CC BY
71
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 6 No. 4 2010, pp. 126-134 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2010 by Alen’kina, Nikitina
ORIGINAL ARTICLE
Azospirillum lectin - induced changes in the content of nitric oxide in wheat seedling roots
Alen’kina S.A. , Nikitina V.E.
Institute of Biochemistry and Physiology ofPlants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 13 Prospekt Entuziastov, Saratov 410049, Russian Federation
E-mail: ilenkinaCaibppm.sgu.ru
The lectin of Azospirillum brasilense Sp7 at 40 |ig ml-1 elicited two peaks of induction of nitric oxide synthesis in the roots of wheat seedlings after 3 and 26 h of coincubation. The lectin of A. brasilense Sp7.2.3, a mutant defective in lectin activity, produced the same effect, but the activation of nitric oxide synthesis in the roots was less in the case of 26-h incubation. Exposure to the lectins for 3 h increased citrulline synthesis in the plant cell to the same extent. This finding indicated that the Azospirillum lectins activate nitric oxide production through the NO signal system of plants, thereby acting as inducers of adaptation processes in the roots of wheat seedlings.
Key words: Azospirillum brasilense, lectins, nitric oxide, citrulline, wheat-seedling roots
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 6 No. 4 2010
ORIGINAL ARTICLE
Изменение содержания оксида азота в корнях проростков пшеницы под влиянием лектинов азоспирилл
Аленькина С. А. , Никитина В. Е.
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049 Саратов, просп. Энтузиастов, 13, Россия E-mail: ilenkina@ibppm.sgu.ru
Показано, что лектин Azospirillum brasilense Sp7 в концентрации 40 мкг/мл вызывает два пика индукции синтеза оксида азота в корнях проростков пшеницы, происходящей через 3 и 26 ч совместной инкубации. Лектин мутантного по лектиновой активности штамма Azospirillum brasilense Sp7.2.3 проявлял аналогичный эффект, но в случае 26 - часовой инкубации в меньшей степени активировал продукцию оксида азота в корнях. Было показано, что лектины в одинаковой степени усиливают синтез цитруллина в растительной клетке после 3-х часов воздействия, что свидетельствует о том, что лектины азоспирилл активируют продукцию оксида азота посредством NO-сигнальной системы растений, и тем самым выступают в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.
Ключевые слова: Azospirillum brasilense/ лектины/ корни проростков пшеницы/ оксид азота/ цитруллин
Известно, что при взаимодействии растений с микроорганизмами происходит изменение уровня активных форм азота в растении (Глянько и др., 2009). Особую роль при этом играет оксид азота (N0). Установлено, что N0
вовлечен во многие метаболические процессы в растениях: в формирование корней (Molina-Favero et all, 2007), адаптацию и ответ на стрессовые воздействия (Valderrama et all, 2007), в защитные реакции (Hong et all, 2008) и другие
Alen ’kina, Nikitina физиологические процессы (Beligni et all, 2000).
Исследователями молекулярных механизмов функционирования микробно-растительных ассоциаций ведется активный поиск рецепторных структур микро- и макропартнеров и изучение ответных реакций, возникающих при установлении ассоциативных взаимодействий. В ассоциации «пшеница-Azospirillum» большой интерес представляют бактериальные лектины в связи с их известными информационными функциями в различных биологических системах (Hebert, 2000). Было показано, что лектины азоспирилл за счет способности связывать углеводы, участвуют не только в адгезии бактерий на корнях растений, но стимулируют прорастание семян, проявляют по отношению к растительной клетке митотическую и ферментмодифицирующую активности (Никитина и др., 1996; Никитина и др., 2004; Alen’kina et all, 2006). Лектины способны участвовать в сигнальных процессах растений, оказывая влияние на синтез цАМФ, перекиси водорода (Аленькина и др., 2010). Данные же о влиянии лектинов азоспирилл на синтез оксида азота полностью отсутствуют.
Исследование биохимических механизмов на начальных этапах взаимодействия пшеницы с почвенными микроорганизмами имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Изучение активных форм азота на начальных стадиях формирования ассоциации между азоспириллами и пшеницей позволит углубить знания о физиолого-биохимических механизмах этого взаимодействия и повысить его эффективность в практическом аспекте.
В связи с этим, целью изучения явилась оценка изменения содержания оксида азота в
корнях проростков пшеницы под влиянием лектинов двух штаммов азоспирилл - A. brasilense Sp7 и Sp7.2.3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы лектины двух штаммов Azospirillum brasilense Sp7, полученного из Института микробиологии РАН (г. Москва) и его мутанта, дефектного по лектиновой активности - Azospirillum brasilense Sp7.2.3. (Аленькина и др., 1998).
Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции О
при 37 С в течение 18 ч (Sadasivan et all, 1985).
Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом Eshdat и Sharon (Echdat et all, 1978).
В экспериментах использовали
кристаллические препараты лектинов, полученные после двукратного осаждения сульфатом аммония и спирто-ацетоновой
смесью.
Белок определяли по методу Бредфорд
(Bradford, 1976).
В работе использовали 3-суточные проростки пшеницы (Triticum aestivum) сорта Саратовская 29. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным этанолом и проращивали на
дистиллированной воде при 22°С. Корни выдерживали в растворах лектинов дикого и мутантного штаммов; в отдельной серии экспериментов - растворах лектинов,
содержащих 1мМ СаСЬ. Корни проростков фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали. К гомогенату добавляли по
100 мкл реактива Гриесса, состоящего из равных объемов 0,3% сульфаниловой кислоты и 0,5% а-нафтиламина (Чибисова, 1999).
После 10 мин контакта определялась оптическая плотность при 540 нм. В качестве контроля использовали образцы корней, не обработанных лектинами.
Количество цитруллина определяли с помощью тонкослойной хроматографии. Экстракт подвергали ТСХ на силикагеле 60А (“Merck”, Germany) в системе растворителей,
содержащей н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1 по объему). Хроматограммы окрашивали раствором нингидрина (Дарбре, 1989). Пятна вырезали, элюировали и проводили количественное определение цитруллина при 570 нм.
Полученные результаты подвергали статистической обработке (Рокицкий, 1973). Результаты представлены как средние значения трех повторностей ± стандартное отклонение. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.
■ лектин A. brasilense Sp7 Ш лектин A. brasilense Sp7.2.3
Рисунок 1. Содержание оксида азота (NO) в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3.
Рисунок 2. Содержание цитруллина в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3.
Рисунок 3. Содержание цитруллина в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3 и СаС!2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характер изменения уровня оксида азота в результате инкубации корней проростков пшеницы с препаратами лектинов родительского и мутантного штаммов в концентрации 40 мкг/мл был неодинаков и зависел от времени воздействия. Для обоих лектинов первое увеличение уровня оксида азота (N0) в корнях происходило уже после 1 ч воздействия лектинов и достигало максимума через 3 ч. Оба лектина проявляли одинаковую активность. Для лектина родительского штамма наблюдалось увеличение в 2 раза по сравнению с контролем, для лектина мутантного штамма - в 1,9 раза. Второе повышение начиналось в результате более длительного воздействия - через 23 ч и достигало максимума через 26 ч. Для лектина родительского штамма уровень оксида азота превосходил контроль в 2,5 раза, для лектина мутантного штамма - в 2 раза. Таким образом, различия между двумя лектинами наблюдались лишь в случае 26-часовой инкубации - лектин родительского штамма в большей степени активировал продукцию оксида азота в корнях (рис. 1).
Различия, проявляемые лектинами в данном случае, вероятно связаны с
конформационными различиями
молекул лектинов и как следствие, различным взаимодействием с поверхностью растительной клетки, что является определяющим фактором для включения последующих этапов.
По мнению многих авторов, в растениях может быть несколько источников образования NO и некоторые из них могут регулироваться через сигнальные пути (Glyan'ko et all, 2009; Flores et all, 2008) .Одним из таких путей является реакция, катализируемая синтазой оксида азота (NOS) по следующей схеме: а-аргинин + О2 + НАДФН ^ а-цитруллин + оксид азота. С целью доказательства того, что лектины способны индуцировать образование оксида азота таким способом, нами были предприняты попытки определения количества цитруллина в корнях после экспозиции в растворах лектинов. В результате было показано, что лектины родительского и мутантного штаммов в одинаковой степени вызывали постепенное увеличение количества цитруллина в растительной клетке лишь в первые часы их совместной инкубации с корнями. Максимальное количество цитруллина синтезировалось через 3 ч (рис. 2). Так
как известно, что NO-синтаза растений является Са-зависимым ферментом (Corpas et all, 2009), было исследовано влияние кальция на синтез цитруллина. Добавление в среду инкубации корней проростков с лектинами ионов кальция в виде СаСЬ (1 мМ) активировало синтез аминокислоты в корнях, причем разницы между лектинами родительского и мутантного штаммов не наблюдалось (рис. 3), как и в случае без кальция.
Тот факт, что инкубация лектинов с корнями приводила к единовременному увеличению оксида азота и цитруллина в корнях, позволяет сделать вывод о том, что лектины способны активировать NO-сигнальную систему растений. Идентичность эффектов, вызываемых лектинами двух штаммов
свидетельствует о том, что в данном случае эффект определялся
специфическими взаимодействиями лектинов, учитывая, что они имеют одинаковую углеводную специфичность. Увеличение синтеза монооксида азота и отсутствие эффекта в отношении цитруллина при более длительном воздействии лектинов свидетельствует о том, что лектины способны регулировать уровень NO и через другие физиологические механизмы отличные
от N0-синтазной сигнальной системы. По мнению Дьякова с соавт. (Дьяков и др., 2001) повышение концентрации N0 приводит к активации гуанилатциклазы, катализирующей превращение ГТФ в цГМФ. цГМФ активирует
протеинкиназу, которая открывает Са-каналы внутриклеточных Са-депо, в результате чего повышается
концентрация кальция в цитозоле,
активируются Са-зависимые
протеинкиназы, фосфорилируется
белковый фактор регуляции
транскрипции и начинается синтез специфических белков.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны увеличивать
синтез оксида азота в корнях пшеницы. и тем самым, регулировать
взаимодействие микро- и
макросимбионта при формировании ассоциации на начальных ее этапах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Аленькина С.А., Никитина В.Е. (2010) Роль лектинов азоспирилл в регуляции активности
пероксидазы и оксалатоксидазы
корней пшеницы. Известия РАН. Серия биологическая. 1, 1-4. Аленькина С.А., Матора Л.Ю., Никитина
В.Е. (2010) Оценка влияния лектинов азоспирилл на уровень ц-АМФ в растительной клетке. Микробиология. 79, 1-3.
Глянько А.К., Васильева Г.Г., Митанова Н.Б., Ищенко А.А. (2009) Влияние минерального азота на бобово-ризобиальный симбиоз. Известия РАН. Серия биол. 36, 302-312. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. (1998) Получение и характеристика мутанта Azospirillum brasilense Sp7 по лектиновой активности.
Микробиология. 67, 782-787. Дарбре А. (1989). Практическая химия белка. Москва. Мир.
Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. (2001) Общая и молекулярная фитопатология. Учеб. пособие.М. Изд-во Общество фитопатологов. Никитина В.Е., Аленькина С. А.
Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. (1996) Изучение роли клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями
пшеницы. Микробиология. 65, 165-170.
Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. (2004) Влияние лектинов азоспирилл на способность семян к прорастанию. Известия АН. Серия биологическая. 4, 431-435.
Рокицкий П.Ф. (1973) Биологическая статистика. Минск..
Чибисова Н.В. (1999) Практикум по экологической химии. Учебное пособие. Калининград.
Калининградский ун-т.
Alen’kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. (2006) Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes. Plant and Soil. 283, 147-151.
Beligni M.W., Lamattina L. (2000) Nitric oxide stimulates seed germination and de-etiolation, and inhibits hypocotyls elongation, there light-inducible responses in plants. Planta. 210, 215221.
Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal. Biochem.. 72, 248254.
Corpas F.J., Palma J.M., del Rio L.A., Barroso J.B. (2009) Evidence supporting the existence of l-arginine-dependent nitric oxide syntase activity in plants. New Physiol. 184, 9-14.
Echdat Y., Ofek I., Yachow-Yan Y., Sharon N., Mirelman D. (1978) Isolation of mannose-specific lectin from E.coli and its role in the adherence of the bacterial to epithelial cells. Biochem. Biophis. Res. Commun. 85, 1551-1559.
Flores T., Todd C.D.,Tovar-Mendez A., Dhanoa P.K., Corra-Aragunde N., Hoyos M.E., Brownfield D.M., Mullen R.T., Lamattina L., Polacco J.C. (2008) Arginase-negative mutant of Arabidopsis exhibit increased nitric oxide signalling in root development. Plant Physiol. 147, 1936-1946.
Glyan'ko A.K., Mitanova N.B., Stepanov A.V. (2009) Physiological role of nitric oxide (NO) at vegetative organisms. J of Stress Physiol.and Biochem. 5, 33-52.
Hong J.K., Yun B-W., Kang J-G., Raja M.U., Know E., Sorhagen K.,Chu
C., Wang Y., Loake G.J.(2008) Nitric oxide function and signaling in plant disease resistanse. J. Exp. Bot. 59, 147-154.
Hebert E. (2000) Endogenous lectins as cell surface transducer. Bioscience Reports. 20, 213-237.
Molina-Favero С., Creus C. M., Lanteri M. L., Correa-Aragunde N., Lombardo M. C., Barassi C. A., Lamattina L. (2007) Nitric oxide and plant growth promoting rhizobacteria: common
features influencing root growth and development. Advances in Botanical Research. 4б, 1-33.
Sadasivan L., Neyra C.A. (1985)
Flocculation in Azospirillum
brasilense and Azospirillum
lipoferum. J. Bacteriol. 1б3, 716723.
Valderrama R., Corpas F.J., Carreras A., Fernandez-Ocana A., Chaki M., Luque L., Gomes-Rodriguez M.V., Colmenero-Varea P., del Rio L.A., Barroso J.B. (2007) Nitrosative stress in plants. FEBS Lett. 581, 453-461.
