ИЗМЕНЕНИЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТРУТНЕЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВАРРООЗА В ПЧЕЛИНЫХ СЕМЬЯХ

Ларькина Е.О.; Лапынина Е.П.

УДК / UDC 638.12

ИЗМЕНЕНИЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТРУТНЕЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВАРРООЗА

В ПЧЕЛИНЫХ СЕМЬЯХ

CHANGES IN REPRODUCTIVE INDICATORS OF DRONES WHEN USING DRUGS FOR THE TREATMENT OF VARROOSIS IN BEE FAMILIES

Ларькина E.O., соискатель, младший научный сотрудник Larkina E.O., Applicant, Junior Researcher E-mail: alenaelena98@yandex. ru Лапынина Е.П., кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Lapynina E.P., Candidate of Agricultural Sciences, Senior Researcher E-mail: [email protected] Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр пчеловодства», Рязанская область, Россия Federal State Budgetary Scientific Institution "Federal Beekeeping Research Centre", Ryazan Region, Russia

Медоносные пчелы играют очень сложную и значительную роль в экосистеме. В последние годы они были в центре внимания многих исследований из-за прогрессирующего сокращения их популяции. Считается, что патогенные микроорганизмы и пестициды ослабляют иммунитет медоносных пчел и влияют на их физиологическое состояние и развитие. Трутни также подвергаются воздействию большого количества химических веществ из окружающей среды. Учитывая репродуктивное качество трутней, большинство исследований было сосредоточено на влияние акарицидов и инсектицидов на фертильность трутней и качество спермы. На репродуктивное качество трутней могут влиять многие экологические и биотические факторы, такие как возраст, сезон и генетика. В том числе к ним относится и питание, которое может влиять на сроки полового созревания трутней. Объектом научного исследования являлись трутни породного типа «Приокский». Цель исследования заключалась в изучении эффективности препаратов для лечения варрооза на репродуктивные показатели трутней. Для научного опыта использовали акарицидные препараты с разными химическими веществами: амитраз, флувалинат, тимол и щавелевая кислота. Качество спермы трутней контрольной и опытных групп оценивали по следующим показателям: морфология, жизнеспособность, концентрация и подвижность сперматозоидов трутней. По окончании научного исследования были получены результаты, которые свидетельствуют о воздействии испытанных препаратов для лечения варрооза на качество спермы трутней. Наблюдается снижение жизнеспособности, увеличиваются деформации головок сперматозоидов. Все это приводит к снижению репродуктивной способности трутней. Самые низкие показатели по качеству спермы наблюдались у трутней, обработанных препаратом Бисанар с действующими веществами щавелевая кислота и тимол. Ключевые слова: трутень медоносной пчелы, оценка качества спермы, репродуктивная способность трутней, морфология, концентрация, подвижность, жизнеспособность сперматозоидов.

Honey bees play a very complicated and significant role in the ecosystem. In recent years, they have been in the focus of many studies due to the progressive decline in their number. It is believed that pathogenic microorganisms and pesticides weaken the immunity of honey bees and affect their physiological state and development. Drones can also be exposed to impact of chemicals from the environment. Taking into the account reproductive quality of drones, most studies have focused on the effects of acaricides and insecticides on drone

fertility and sperm quality. Many environmental and biotic factors can affect the reproductive quality of drones, such as age, season and genetics. This includes nutrition, which can affect the terms of drones' puberty. The object of scientific research is drones of the breed type "Prioksky". The aim was to study the effectiveness of drugs for the treatment of varroosis on the reproductive performance of drones. For scientific experience, acaricidal preparations with different chemicals were used: amitraz, fluvalinate, thymol and oxalic acid. The quality of drone sperm in the control and experimental groups was assessed by the following indicators - morphology, viability, concentration and motility of drone sperm. At the end of the scientific study, the results were obtained, which indicated the impact of the tested drugs for the treatment of varroosis on the quality of drones. There is a decrease in viability, deformations of sperm heads increase. All this leads to a decrease in the reproductive ability of drones. The lowest indicators for the quality of drone sperm were observed in experimental group No. 3, treated with Bisanar with active substances - oxalic acid and thymol. Key words: honey bee drone, evaluation of sperm quality, reproductive ability of drones, morphology, concentration, motility, viability of spermatozoa.

Введение. В настоящее время все более актуальной проблемой является негативное воздействие пестицидов разных классов опасности на физиологическое состояние медоносных пчел и трутней, вследствие обработки пчелиных семей от заболеваний.

Было установлено, что некоторые агрохимикаты негативно влияют на репродуктивное здоровье трутней. В частности, известно, что пероральное воздействие неоникотиноидных инсектицидов тиаметоксама и клотианидина снижает жизнеспособность сперматозоидов у взрослых трутней [1]. Аналогично было обнаружено, что воздействие имидаклоприда влияет на жизнеспособность сперматозоидов трутней и митохондриальную активность, хотя интенсивность этого эффекта также значительно варьировала между пчелиными семьями [2]. Все эти результаты показывают, что воздействие пестицидов либо через загрязнение пчелиного воска, используемого для выращивания пчелиного расплода, либо через потребление загрязненной пищи, отрицательно влияет на количество и жизнеспособность сперматозоидов трутней медоносной пчелы.

Результаты научных исследований американских ученых Адриана Фишера II, Джулиана Рангел показали, что применяемые пчеловодами митициды -амитраз, флувалинат и кумафос, а также в меньшей степени применяемые в полевых условиях агрохимикаты хлорталонил и хлорпирифос, ухудшают репродуктивные показатели трутней. В частности, при применении в полевых концентрациях они обнаружили комбинаторный эффект флувалината и кумафоса, а также комбинаторный эффект хлорталонила и хлорпирифоса на жизнеспособность сперматозоидов трутней [3].

Повсеместное присутствие остатков пестицидов внутри ульев не только влияет на развитие трутней и репродуктивное здоровье, но и может косвенно влиять на репродуктивные показатели пчелиных маток, спаривающихся с трутнями, подвергшимися воздействию пестицидов. Долголетие пчелиной матки зависит от скорости производства ее расплода, причем снижение продуктивности часто приводит к перенасыщению [4]. Поскольку трутни являются источником половины генетического материала, необходимого для воспроизводства следующего поколения, у пчелиной матки, спарившейся с некачественными трутнями, может закончиться жизнеспособная сперма раньше, чем обычно. Интересно, что давнее мнение о том, что пчелиные матки сохраняют только жизнеспособные сперматозоиды после спаривания [5], было оспорено недавними доказательствами сохранения нежизнеспособных сперматозоидов в сперматеке

матки [5-7]. Это явное следствие было продемонстрировано у маток, искусственно осемененных спермой от трутней, выращенных на сиропе, зараженном инсектицидом фипронил. Сперматозоиды, хранящиеся в сперматеке этих маток, имели значительно более низкую жизнеспособность по сравнению с пчелиными матками, осемененными спермой от контрольных трутней [8]. Это также наблюдалось у пчелиных маток, выращенных на пыльце, загрязненной неоникотиноидами тиаметоксамом и клотианидином [9].

Кроме того, энтомолог Борис Баер, проводивший исследования размножения медоносных пчел, предположил, что размер эякулята трутней непосредственно влияет на успешное хранение спермы у маток после спаривания, в то время как успешное оплодотворение зависит от качества отдельных сперматозоидов [10].

Исследователи, изучавшие фипронил (инсектицид), обнаружили значительные последствия для репродуктивного здоровья трутней после его воздействия, включая снижение жизнеспособности сперматозоидов [8, 11, 12]. Кроме того, воздействие фипронила снижает выработку сперматозоидов и, наоборот, повышает метаболизм сперматозоидов [8]. Фипронил оказал синергетическое воздействие на трутней после совместного воздействия с микроспоридийным паразитом Nosema ceranae, усиливая негативное воздействие на нервные метаболические процессы [11]. Кроме того, неоникотиноидный инсектицид имидаклоприд отрицательно влиял на антиоксидантную способность гемолимфы у трутней в разном возрасте. Однако семенная плазма проявляла меньшую антиоксидантную способность, чем гемолимфа, и, следовательно, была более чувствительна к стрессам воздействия инсектицидов [13].

Целью исследований являлось изучение влияния препаратов для лечения варрооза на качество спермы трутней медоносной пчелы.

Условия, материалы и методы. Научно-исследовательская работа проводилась на пасеке ФГБНУ «ФНЦ пчеловодства» в весенне-летний период 2021 г. Сформированы одна контрольная и три опытные группы пчелиных семей. Каждая группа составила по три пчелиные семьи одинаковые по полезно-хозяйственным признакам.

После появления в опытных группах трутневого расплода, каждая пчелиная семья была обработана одним из трех препаратов от клеща Варроа. Первая опытная группа подверглась обработке препаратом Бипин-Т с действующим веществом амитраз (акарицид, 3 класс опасности), вторая опытная группа обработана препаратом Фумисан с действующим веществом флувалинат (акарицид, 3 класс опасности), третья опытная группа обработана препаратом Бисанар с действующим веществом щавелевая кислота и тимол (акарицид, 4 класс опасности).

Трутней помечали перманентными маркерами. Опытные группы, подвергшиеся обработке препаратом Бипин-Т, Бисанаром и Фумисаном, помечали красным, желтым и зеленым цветами, а контрольную группу - белым цветом. Для показателей качества спермы отбирали пробы трутней в возрасте 25-29 сут. Затем провели анализ качества спермы трутней медоносной пчелы из контрольной и опытных групп.

Оцениваемые показатели спермы: концентрация [14] и подвижность [15] с помощью камеры Горяева, жизнеспособность (целостность мембран) сперматозоидов методом флуоресцентной микроскопии [16], морфология сперматозоидов (дефекты, аномалии) [17].

При оценке жизнеспособности сперматозоидов методом флуоресцентной микроскопии применяли флюорохром Hoechst 33258 («Пан-Эко», Россия) и PI («Химмед», Россия). Рабочий раствор флюорохрома готовили в трис буфере pH -8,8 с конечной концентрацией Hoechst 33258 - 5 мкг/мл и PI - 10 мкг/мл. Суспензию из образца спермы готовили в трис буфере с pH 8,8 в соотношение 1:400.

Исследования проводили на биологическом люминесцентном светодиодном микроскопе МИКРОМЕД 3ЛЮМ LED (OOO «Наблюдательные приборы», Россия) при увеличении 400*. Всего подсчитывали 200 сперматозоидов.

Морфологию сперматозоидов (аномалии, деформации) смотрели методом быстрого дифференцированного окрашивания набором реагентов Диахим-Дифф-Квик (ООО «АБРИС+НПФ», Россия).

Полученные данные были обработаны с использованием компьютерной программы Excel 2010, с расчетом средних значений и стандартной ошибки.

Результаты и обсуждение. По окончанию научно-исследовательской работы получены данные по показателям качества спермы трутней контрольных и опытных групп. Данные представлены в таблице.

Таблица - Показатели качества свежеотобранной спермы трутней контрольной и опытных групп_

Показатель Контроль Опытная группа

№ 1 № 2 № 3

Жизнеспособность, % M±m 99,1±0,5 97,9±0,9 99,4±0,2 97,6±0,5

Cv, % 0,9 1,6 0,3 0,8

Деформация головок сперматозоидов, % M±m 52±0,6 72,9±2,9 52,3±12,6 68,7±0,9

Cv, % 2,04 6,8 41,6 2,4

td - 7,06* 0,02 15,5*

Концентрация, млн/мкл M±m 1,9±0,12 1,05±0,2 1,8±0,6 0,7±0,05

Cv, % 11,16 38,7 61,7 13,6

td - 3,7* 0,2 9,2*

Подвижность, балл M±m 4±0 4±0 4±0 4±0

Примечание: достоверные изменения по показателям спермы относительно контрольной группы * - при р<0,05.

Анализ полученных результатов по качеству спермы трутней опытных групп из таблицы 1, показал, что жизнеспособность сперматозоидов опытных групп № 1 и 3 на 1,2% и 1,5% ниже относительно контроля, в опытной группе № 2 этот показатель совсем не изменился. Деформации головок сперматозоидов у опытной группы № 1 на 20,9% выше относительно контрольной группы, также в опытных группах № 2 и 3 - на 0,3% и на 16,7% соответственно выше.

Самая низкая концентрация сперматозоидов оказалась у трутней опытной группы № 3 на 1,2 млн/мкл, а у остальных опытных групп результаты практически не изменились относительно контрольной группы.

Выводы. Таким образом, в результате исследований получены данные, которые свидетельствуют о влиянии испытанных препаратов для лечения варооза на качество трутней. При обработке противоварроозными препаратами наблюдается снижение жизнеспособности, увеличиваются деформации головок сперматозоидов, качество спермы значительно снижается. Все это приводит к снижению репродуктивной способности трутней. Самые низкие показатели по качеству спермы отмечены у трутней после обработки препаратом Бисанар (действующее вещество - щавелевая кислота и тимол).

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Neonicotinoid insecticides can serve as inadvertent insect contraceptives // L. Straub, L. Villamar-Bouza, S. Bruckner, P. Chantawannakul // Proc R Soc. B. 2016. Vol. 283 (1835). P. 1-8. DOI: 10.1098/rspb.2016.0506.

2. Sperm parameters of honeybee drones exposed to imidacloprid / A. Ciereszko, J. Wilde, G.J. Dietrich, M. Siuda // Apidologie. 2017. Vol. 48(2). P. 211-222. DOI: 10.1007 / s13592-016-0466-2.

3. Sperm viability and gene expression in honey bee queens (Apis mellifera) following exposure to the neonicotinoid insecticide imidacloprid and the organophosphate acaricide coumaphos / V. Chaimanee, J.D. Evans, Y. Chen, C. Jackson, J.S. Pettis // J of Insect Physiol. 2016. Vol. 89. P. 1-8. DOI: 10.1016/j.jinsphys.2016.03.004.

4. Impact of chronic neonicotinoid exposure on honeybee colony performance and queen supersedure / C. Sandrock, M. Tanadini, L.G. Tanadini, A. Fauser-Misslin // PLoS ONE. 2014. Vol. 9 (8): e103592. P. 1-13. DOI: 10.1371/journal.pone.0103592.

5. Collins A.M. Relationship between semen quality and performance of instrumentally inseminated honey bee queens // Apidologie. 2000. Vol. 31. P. 421-429.

6. The effect of different thermal conditions on drone semen quality and number of spermatozoa entering the spermathecal of queen bee / M. Bienkowska, B. Panasiuk, P. W^gryznowicz, D. Gerula // J of Apicul Sci. 2011. Vol. 55. P. 161-168.

7. Effects of age, season and genetics on semen and sperm production in Apis mellifera drones / J. W. Rhodes, S. Harden, R. Spooner-Hart, D. L. Andersen // Apidologie. 2011. Vol. 42. P. 29-38.

8. Drone exposure to the systemic insecticide Fipronil indirectly impairs queen reproductive potential / G. Kairo, B. Provost, S. Tchamitchian, F. Ben Abdelkader // Scientific Reports |6:31904|. 2016. P. 1-12. DOI: 10.1038/srep31904.

9. Neonicotinoid pesticides severely affect honey bee queens / G. Williams, A. Troxler, G. Retschnig, K. Roth, O. Yanez // Scientific Reports. 2015. Vol. 5. P. 1-8. DOI: 10.1038/srep14621.

10. Baer B. Sexual selection in Apis bees // Apidologie. 2005. № 36. P. 187-200.

11. Nosema ceranae, fipronil and their combination compromise honey bee reproduction via changes in male physiology / G. Kairo, D.G. Biron, F. Ben Abdelkader, M. Bonnet // Scientific Reports |7:8556|. 2017. P. 1-14. DOI: 10.1038 / s41598-017-08380-5.

12. Assessment of toxic effect of pesticides on honey bee drone fertility using laboratory and semifield approaches: a case study of fipronil / G. Kairo [et al.] // Envrion Toxicol Chem. 2017. Vol. 9(23). P. 45-51. DOI: https://doi.org/10.1002/etc.3773.

13. Total antioxidant capacity of honeybee haemolymph in relation to age and exposure to pesticide, and comparison to antioxidant capacity of seminal plasma / M. Slowinska, J. Nynca, J. Wilde, B. Bak // Apidologie. 2015. Vol. 47(2). P. 227-236. DOI: 10.1007/s13592-015-0391-9.

14. Лазарева Л.Н. Влияние биодобавок на хранение спермы трутней при положительных температурах // Сборник НИИР по пчеловодству. Киров: НИИСХ Северо-востока, 2014. 276 с.

15. Rhodes J.W. Semen production in drone honey bees. RIRDC Pub. // URL: https://rirds.Infoservices.com.au/downloads/08-130.

16. Locke S.J., Peng Y.S., Cross N.L. A supravital staining technique for honey bee spermatozoa // Physiological Entomology. 1990. Vol. 15. P. 187-192.

17. Smith Chad C. Opposing effects of sperm viability and velocity on the outcome of sperm competition // URL: https://researchgate.net.

REFERENCES