CC BY
76
УДК 616.152.21:616.155.1-053.31-07
ИЗМЕНЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ВНУТРИУТРОБНУЮ ГИПОКСИЮ
Валерий Викторович Софронов 1, Наталья Олеговна Туаева 2, Татьяна Евгеньевна Анисимова 2, Тимур Анварович Сибгатуллин 3, Евгения Александровна Мишагина 3, Гузель Камилевна Зиятдинова 2, Александр Васильевич Анисимов 3, Сергей Анатольевич Любин 4
1 Кафедра пропедевтики и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета
(зав. — проф. Р.А. Файзуллина) Казанского государственного медицинского университета, e-mail: Vvsofronov@mail.ru, 2кафедра биохимии (зав. — доц. Ф.К. Алимова), кафедра аналитической химии (зав. — проф. Г.А. Евтюгин) Казанского государственного университета, e-mail: Natalya.Tuaeva@ksu.ru, 3 лаборатория биофизики транспортных процессов (зав. — проф. А.В. Анисимов) Казанского института биохимии и биофизики КазНЦРАН, e-mail: anisimov@mail.knc.ru, 4 Детская городская клиническая больница № 1 (главврач — К.З. Закиров), г. Казань
Реферат
Методом ядерно-магнитного резонанса исследована скорость протонного обмена в мембранах эритроцитов, отражающая проницаемость мембран клеток крови новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию. Дополнительно изучены показатели интегральной антиоксидантной емкости крови и концентрации малонового диальдегида — одного из вторичных продуктов. Проницаемость мембран эритроцитов у таких новорожденных взаимосвязана с интенсивностью перекисного окисления липидов и интегральной антиоксидантной емкостью крови, поэтому данный показатель информативен при комплексной оценке тяжести гипоксии у новорожденных.
Ключевые слова: новорождённые, внутриутробная гипоксия, мембраны эритроцитов.
Хроническая внутриутробная гипоксия является одной из основных причин наиболее распространенных нозологических форм перинатальной патологии. В настоящее время тяжесть хронической внутриутробной гипоксии и асфиксии оценивается по шкале Апгар, включающей ряд визуальных критериев, без учета молекулярных механизмов. На ультраструктурном уровне вследствие гипоксии нарушены функции биомембран и увеличена их проницаемость из-за активации процесса перекисного окисления мембранных липидов. Изучение мембранных дефектов может быть использовано для оценки состояния мембран клеток крови и целесообразности цитопротекторной и антиоксидантной терапии в раннем неонатальном периоде. Поэтому целью данной работы была оценка состояния мембран эритроцитов новорожденных методом ядерно-магнитного резонанса 62
(ЯМР) во взаимосвязи с интегральной антиоксидантной емкостью крови (АОЕ) и концентрацией малонового диальдегида (МДА) крови.
В работе использованы образцы пу-повинной и венозной крови 15 новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию и имевших такие нозологические формы перинатальной патологии, как задержка внутриутробного развития плода по гипотрофическому типу (II—III степени) и перинатальная патология центральной нервной системы (гипоксического генеза). Все дети являлись пациентами отделения патологии новорожденных. Контрольную группу составили 14 условно здоровых новорожденных без патологии, у которых брали пуповинную кровь при рождении.
Кровь в количестве 2 мл брали в пробирку с 1,5% ЭДТА в соотношении 9:1, центрифугировали 15 минут при 1000 об/мин, плазму крови и слой мононуклеа-ров отбрасывали. Эритроцитарную массу дважды центрифугировали в физиологическом растворе 15 минут при 1500 об/мин, физраствор удаляли, клетки концентрировали путём дополнительного центрифугирования. Скорость протонного обмена в полученном пакете эритроцитов измеряли методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ИГМП) на 1Н ЯМР спектрометре с резонансной частотой 16 МГц. Максимальное значение градиента магнитного поля в импульсе составляло 7,3 Т/м. В ходе эксперимента поддерживалась температура 37°С.
Измеряемыми параметрами в диффузионных экспериментах являлись [8] коэффициент самодиффузии и населенности диффузионных компонент, составляющих диффузионные затухания (ДЗ) [5, 9]. Погрешность измерения коэффициента самодиффузии составляла не более 10%. Для каждого времени диффузии определяли населенность (р) медленнодиффунди-рующей компоненты («хвоста» ДЗ):
р(Хй) = р(0)ехр ^ Т-^
Из зависимости р^) путем математических преобразований с помощью ПК в экспоненциальной аппроксимации получали время обмена (т) - количественную характеристику обмена структурообразующих протонов мембраны и молекул воды, связанных с компонентами мембраны, с внутри- и внеклеточной водой.
АОЕ крови как фактора компенсации ПОЛ исследовали с помощью интегральной оценки неферментативных компонентов антиоксидантной системы (глутатион, витамины группы Е, С и К, триптофан, фенилаланин, убихиноны, флавоноиды) методом кулонометрии [4]. Неферментативную составляющую АОЕ крови определяли методом гальванометрической кулонометрии [3]. Характеристику антиоксидантной емкости выражали в единицах количества электричества (кулонах) на 1 литр крови. Электрогенерацию брома осуществляли на потенцио-стате П-2827М (Россия) из 0,2 М раствора бромида калия в 0,1 М водном растворе серной кислоты на платиновом электроде при постоянной силе тока 5,0 мА. Суммарная инструментальная погрешность установки не превышала 0,02 %.
Для оценки интенсивности ПОЛ находили концентрацию МДА тиобарбитуровой кислотой — в осадке липопротеинов [7].
При изучении диффузии молекул воды в образцах эритроцитов у детей, предположительно перенесших внутриутробную гипоксию, и у детей контрольной группы методом ЯМР с ИГМП установлено, что время обмена протонов «мембранной» воды с внутри- и внеклеточной водой (т) для образцов обследованных групп пациентов составило в среднем 61,8 мс для условно здоровых детей и 30,1 мс для детей, предположительно
перенесших внутриутробную гипоксию. Поскольку величина (т) отражает время диффузии, ее снижение свидетельствует о повышении проницаемости мембраны. В данном исследовании проницаемость мембран у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, оказалась выше, чем в контрольной группе (р < 0,05).
Основным фактором повреждения мембран клеток как при гипер-, так и ги-пооксидации является процесс ПОЛ мембраны [2]. Накопление продуктов перок-сидации может привести к образованию в мембранах своеобразных пор, что обусловливает повышенную проницаемость. В результате активации окисления липи-дов происходит избыточное накопление МДА, коррелирующее с уровнем ПОЛ [1]. У новорожденных с перинатальной патологией нами было обнаружено достоверное (р<0,05) увеличение содержания МДА на 20% относительно группы условно здоровых детей (табл. 1).
С помощью корреляционного анализа
Таблица 1
Показатели окисления липидов и антиоксидантной емкости у новорожденных
Показатели В/утробная гипотрофия + ПП ЦНС (1-е сутки) В/утробная гипотрофия + ПП ЦНС (2—3-и сутки) Условно здоровые (1-е сутки)
МДА, мкмоль/мл 0,048 ± 0,006* 0,043 ± 0,02 0,012 ± 0,001
АОЕ, кКл/л 27,98 ± 3,55* 40,7 ± 5,17 21,75 ± 2,15
КС, % от нормы 30,8 * 46,03 100
* р<0,05 при сравнении с контрольной группой
полученных данных выявлена статистически значимая отрицательная связь между т и МДА (гб = -0,4493; р < 0,05), свидетельствовавшая об увеличении проницаемости мембран эритроцитов при активации ПОЛ.
Сразу после рождения у детей с патологией по сравнению с детьми контрольной группы выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение показателя АОЕ (табл. 1). На 2 — 3-и сутки жизни у новорожденных с патологией показатель АОЕ еще более увеличился. С помощью
63
корреляционного анализа выявлена положительная зависимость показателя АОЕ от содержания МДА (г, = 0,648; р < 0,05). Поскольку антиоксидантная система в известной степени нейтрализует негативные последствия активации ПОЛ, то такое увеличение является, скорее всего, компенсаторным. Чтобы определить, достаточно ли оно для компенсации процессов ПОЛ, в данной работе нами введён условный коэффициент скомпенсирован-ности (КС), определяемый как соотношение АОЕ/МДА, принятый в контрольной группе за 100% (табл. 1). Результаты показали, что в первые сутки жизни у новорожденных, перенесших внутриутробную гипоксию, КС значительно ниже, чем в контрольной группе. Затем (на 2—3-и сутки) КС возрастал, однако оставался ниже, чем исходный КС в контрольной группе.
У детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, наблюдалось усиление липопероксидации на фоне недостаточной компенсации антиокси-дантной системой, что может являться результатом окислительного стресса в перинатальном периоде. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что после увеличения АОЕ и снижения интенсивности ПОЛ должно произойти восстановление стабильности мембран. В данной работе это предположение основано на статистически значимой отрицательной корреляции между т и АОЕ (г, = -0,673; р < 0,05): при низком (патологическом) значении т в качестве компенсаторного механизма активируется антиоксидантная система и соответственно при высоком значении т (физиологическом состоянии мембран эритроцитов) активации анти-оксидантной защиты не требуется.
Хроническая внутриутробная гипоксия плода, предшествующая перинатальной патологии, через вовлечение активации липопероксидации приводит к увеличению проницаемости мембран эритроцитов, не в полной мере скомпенсированной антиоксидантной системой крови. Вероятно, эти же процессы лежат в основе активации апоптоза лимфоцитов новорожденных с перинатальной патологией непосредственно в кровяном русле, показанного нами ранее [6].
Ситуация, описанная в данной работе, может являться следствием оксида-64
тивного стресса в результате перехода на легочное дыхание, усугубляемое после перенесенной внутриутробной гипоксии. Поэтому необходимо соблюдать особую осторожность при назначении и дозировке О2-поддержки в момент искусственной вентиляции легких у новорожденных во время реанимационных мероприятий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и не-запрограммированная смерть клетки // СОЖ. — 2000. — Т. 6. — № 9. - С. 1—9.
2. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестн. Росс. АМН. — 1999. — № 2. — С. 15—22.
3. Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В.Аналитическая химия. — М.: Химия. — 1990. — Т. 2. — 846 с.
4. Погорельцев В.И., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Применение метода гальваностатической кулономет-рии в клинической диагностике антиоксидантного статуса организма человека. — Казань: КГМУ. — 2004. — С. 34—35.
5. Сорокина Н.Ю. Трансмембранный протонный обмен в эритроцитах при первичной гипертонии. Исследование методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. -Казань, 2000. - 25 с.
6. Туаева Н.О., Софронов В.В., Емикеева В.А. и др. Взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови и содержания антител к нативной ДНК у новорожденных с пневмопатией//Казанский мед. ж. — 2006. — № 4. — С. 254—257.
7. Федоров Т.М., Коршунова Т.С., Ларский Е.Г. Реакция с тиобарбитуровой кислотой для определения МДА крови методом фотометрии // Лаб. дело. —1983. — Т. 3. — С. 25—28.
8. Andrasco J. Water diffusion permeability of human erythrocytes studies by pulsed gradient NMR technique // Biochem. Biophys. Acta. — 1976. — Vol. 428, № 2. — P. 304—311.
9. Cooper L.R., Chang D.B., Yong A.C. Restricted diffusion in biological system // Biophys. J. — 1974. — Vol. 14. — P. 161— 177.
Поступила 01.06.09.
CHANGES IN THE PERMEABILITY OF
ERYTHROCYTE MEMBRANES IN NEONATES WHICH UNDERWENT INTRAUTERINE HYPOXIA
V.V. Sofronov, N.O. Tuaeva, T.E. Anisimova, T.A. Sibgatullin, E.A. Mishagina, G.K. Ziyatdinova, A.V. Anisimov, S.A Lubin
Summary
Using the method of nuclear magnetic resonance studied was the rate of proton exchange in erythrocyte membranes, reflecting the membrane permeability of blood cells in newborns subject to chronic intrauterine hypoxia. In addition studied were the indices of integral antioxidant capacity of the blood and the concentration of malondialdehyde. The permeability of erythrocyte membranes in these infants was correlated with the intensity of lipid peroxidation and with the integral antioxidant capacity of the blood, thus this figure is informative for a comprehensive assessment of hypoxia severity in neonates.
Key words: newborn, intrauterine hypoxia, erythrocyte membranes.
