CC BY
22
УДК 577.322
A. В. Поляков, А. Н. Даниленко, А. Д. Шутов, И. Г. Платима,
B. Ф. Шкодич, А. М. Кочмев, Г. Е. Заиков
ИЗМЕНЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ АКТИВНОСТИ И РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АДСОРБЦИОННЫХ СЛОЕВ ГЛИЦИНИНА НА ГРАНИЦЕ ВОЗДУХ/РАСТВОР В РЕЗУЛЬТАТЕ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИЗА ПАПАИНОМ
Ключевые слова: глицинин, папаин, ограниченный протеолиз, динамическая тензиометрия и дилатометрия, реология,
адсорбционные слои.
Легумины зернобобовых культур обладают высокой пищевой ценностью, однако из-за особенностей молекулярной структуры они проявляют недостаточно высокие функциональные свойства, что ограничивает их применение в пищевой промышленности. Одним из наиболее мягких и эффективных способов улучшения функциональных свойств белков является ограниченный протеолиз. В работе показано, что в результате ограниченного протеолиза глицинина (легумина соевых бобов Glycine max) папаином увеличивается его поверхностная активность, возрастает скорость формирования и упругость адсорбционных слоев на границе воздух/раствор. Изучено влияние концентрации белка, ионной силы раствора и скорости деформирования на поверхностное давление интактного и модифицированного глицинина, а также дилатационные свойства формируемых ими адсорбционных слоев.
Keywords: glycinin, papain, the limited proteolysis, dynamic tensiometry and dilatometry, rheology, adsorption layers.
Legumes possess high nutritional value, but because of their structure peculiarities they possess unsatisfactory functional properties and their usage in food industry is limited. The limited proteolysis is one of the most perspective methods of improving the protein functional properties. As it was found in the investigation, the limited proteolysis of soybean Glycine max glycinin with using of papain results in increased protein surface activity, growth of the rate of formation and elasticity of adsorption layers at air/solution interface. Proteins concentration, solution ionic strength and dilatational oscillation frequency influence on surface pressun and proteins adsorption layers dilatational properties were studied.
Введение
Легумины представляют собой обширный класс запасных белков зернобобовых культур, имеющий значительный потенциал для расширения сырьевой базы пищевого белка, а также для технического использования в качестве экологичных адгезивов - альтернативы адгезивам на основе фенолформальдегидныз смол [1].
Олигомерная молекула глицинина (легумин соевых бобов) характеризуются гексамерной четвертичной структурой с коэффициентом седиментации 118. Она образуется в результате соединения двух тримеров субъединиц [2]. Благодаря компактной и жесткой третичной структуре, которая стабилизирована дисульфидными связями, легумины характеризуются недостаточно высокими
функциональными свойствами [3,4].
Одним из наиболее эффективных и экологичных методов улучшения функциональных свойств белков является их ограниченный протеолиз с помощью ферментов, обладающих способностью селективно воздействовать на различные участки белковой глобулы. Ограниченный протеолиз происходит с замедлением по мере убывания числа чувствительных участков и завершается образованием стабильного высокомолекулярного продукта, отличающегося от исходного белка структурой и, как следствие, физико-химическими и функциональными свойствами.
Установлено, что улучшение
функциональных свойств модифицированных белков в значительной степени связано с уменьшением их молекулярной массы и размеров и увеличением
поверхностной гидрофобности. Кроме того, в процессе ограниченного протеолиза происходит разрушение дисульфидных связей внутри молекулы белка, что увеличивает ее конформационную подвижность, и, как следствие, улучшает пенообразующую [5,6] и эмульгирующую [7] способности белка.
Ранее было показано, что в результате ограниченного протеолиза изолятов и концентратов белков сои алькалазой, химотрипсином, трипсином, бромелайном и некоторыми другими ферментами улучшается растворимость, эмульгирующие и пенообразующие свойства, гелеобразующая способность [8,9], тогда как более глубокий гидролиз часто вызывает потерю некоторых функциональных свойств [10]. Ограниченный протеолиз белков сои может приводить также к понижению их аллергенности [11] и увеличению атакуемости ферментами желудочно-кишечного тракта [10].
Выбор папаина в качестве модифицирующего фермента для ограниченного протеолиза глицинина обусловлен рядом обстоятельств. Во-первых, действие папаина на легумины зернобобовых культур максимально моделирует процесс их гидролиза под действием кислых эндогенных папаиноподобных протеаз в ходе прорастания бобов зернобобовых культур [12]. Во-вторых, в литературе есть сведения об успешной модификации белковых изолятов и концентратов папаином [13, 14], приведшей к повышению их функциональных свойств. Кроме того, папаин является доступным и относительно недорогим растительным ферментом.
Цель работы состояла в сравнительном исследовании адсорбционного поведения интактного глицинина соевых бобов и глицинина, модифицированного путем ограниченного протеолиза с использованием папаина. Сопоставлены величина адсорбции, динамика формирования и дилатометрические свойства адсорбционных слоев.
Материалы и методика исследований
Глицинин выделяли из сухих семян сои (Glycine max [L.] Merrill, сорт Ликурич, Молдова) с помощью изоэлектрического осаждения и фракционного высаливания сульфатом аммония [15] с последующей очисткой хроматографией на фенил-сефарозе CL-4B (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) [16]. Для получения глицинина-П выделенный препарат глицинина гидролизовали папаином (Sigma Life Science, St. Louis, MO, USA) при весовом соотношении фермент/субстрат 1:200 в 0,037 М фосфатно-цитратном буфере рН 5,6, доведенном NaCl до ионной силы 0,5 М, содержащем 0,02% NaN3, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, при 30° C в течение 2 часов. Реакцию останавливали добавлением реактива Е-64 (Sigma, Life Science) до конечной концентрации 5%. Препараты глицинина и глицинина-П хранили в насыщенном растворе сульфата аммония при 5оС.
Растворы белка готовили путем исчерпывающего диализа исходного раствора белка против фосфатного буфера с содержанием натриевых фосфатных солей суммарной концентрацией 0,05М, рН 7,6 и содержанием 0,5М NaCl и 0,02% NaN3 и разбавления растворов тем же буфером до требуемой концентрации. Перед измерением растворы фильтровали через целлюлозные мембранные фильтры (Millipore) с размером пор 0,22 мкм.
Концентрацию белка в растворе определяли микробиуретовым методом с использованием овальбумина и бычьего сывороточного альбумина в качестве стандартов. Погрешность измерения концентраций не превышала 3%.
Измерения динамического поверхностного натяжения и комплексного дилатометрического модуля упругости проводили на капельном тензиометре Tracker (TRACKER, IT Concept, Longessaine, France) в термостатируемой кювете при температуре 25±10C. Принцип работы тензиометра заключается в определении поверхностного натяжения изучаемого раствора из анализа аксисимметричной формы пузырька воздуха, формируемого в растворе [17].
Перед измерением проверяли вертикальность установки шприца и соответствие формы выдуваемого пузырька воздуха уравнению Лапласа. Объем выдуваемого пузырька составлял 7,0±0,1 мм3. Прибор позволяет проводить эксперимент в течение длительного времени при постоянном значении объема/площади пузырька. Формирование квазиравновесного адсорбционного слоя проводили в течение 70 000 сек.
Сформировавшиеся адсорбционные слои подвергали деформированию растяжение-сжатие в синусоидальном режиме. Амплитуда колебаний
площади поверхности пузырька не превышала 5%, что соответствует области линейной вязкоупругости адсорбционных слоев. Дилатационные свойства регистрировали как функцию времени. Осуществляли серии из 3-5 последовательных колебаний при постоянной амплитуде и частоте. Частотную зависимость модуля упругости исследовали в диапазоне 1,1 - 20 мГц.
Расчет поверхностного натяжения производили на основе информации о форме капли с применение уравнения Лапласа: Г л л Л
Ap = G
1 R1
1 R2
(1)
V"^2 У
где Др - избыточное давление пленки, с -поверхностное натяжение, ^ и - радиусы главных кривизн поверхности капли [18].
Поверхностное давление раствора белка определяли по понижению поверхностного натяжения раствора по сравнению с чистым растворителем:
п = с - с, (2)
где п - поверхностное давление, о - поверхностное натяжение раствора белка, о° - поверхностное натяжение растворителя.
Изучение реологических свойств
адсорбционных слоев глицинина и глицинина-П производили путем приложения малого продольного возмущения к поверхности пузырька воздуха по синусоидальному закону:
А = Ло8т(ю0) , (3)
где А - площадь поверхности пузырька, А0 -амплитуда колебаний площади поверхности, ы -частота нагружения, 0 - время.
Периодическое изменение площади поверхности приводит к синусоидальному изменению поверхностного натяжения адсорбционного слоя:
с = со8т(ю0+^), (4)
где ф - фазовый угол между натяжением и напряжением. о0 - амплитуда поверхностного натяжения.
В области линейной вязкоупругости комплексный модуль эластичности может быть выражен следующим образом:
^ ёс ёп
Е = - =--, (5)
ёА/А ё1пА
где Е - комплексный поверхностный дилатационный модуль.
Дилатационный модуль состоит из действительной и мнимой частей, которые соответствуют эластичной и вязкостной составляющей:
Е = (с0/А0)(со8^+/8т^) = Её + /Еу (6)
Действительная часть дилатационного модуля (или модуль сохранения) является дилатационной эластичностью:
Её = |Е|еоБ^ (7)
Мнимая часть дилатационного модуля (или модуль потерь) является поверхностной дилатационной вязкостью:
Бу = |Б|зт^. (8)
Отношение а0/А0 является суммарной мерой сопротивления материала дилатационным деформациям (эластичным и вязкостным). В случае абсолютно эластичного материала напряжение и натяжение находятся в одной фазе (ф=0), мнимая часть равна единице. В случае абсолютно вязкого материала (ф = 900) действительная часть равна единице [19] материала (ф = 900) действительная часть равна единице [19].
Результаты и их обсуждение
Изменение структуры молекул глицинина в ходе ограниченного протеолиза папином Ранее нами продемонстрированы изменения молекулярных параметров глицинина в результате ограниченного протеолиза папаином [20]. Методами лазерного статического и динамического светорассеяния, малоуглового рентгеновского рассеяния и скоростной седиментации показано снижение при ограниченном протеолизе молекулярной массы, гидродинамического размера, радиуса инерции, поверхностного заряда и степени асимметрии молекулы глицинина, а также увеличение уровня гидрофобности ее поверхности. Установленные изменения молекулярных параметров глицинина в основном согласуются с ранее показанными изменениями первичной структуры его субъединиц при ограниченном протеолизе папаином. По данным 8Б8-РЛОБ [21], в ходе ограниченного протеолиза гидролизу подвергаются
слабоупорядочные С-концевые участки кислых цепей, расположенные на поверхности белковой глобулы.
В ходе недавних исследований [20] нами показано, что модифицированный глицинин обладает меньшей термодинамической стабильностью по сравнению с интактным. Будучи менее конформационно стабильными, молекулы глицинина-П могут проявлять способность к более энергетически выгодной упаковке в составе адсорбционного слоя, что может положительно сказаться на свойствах формируемых адсорбционных слоев.
Поверхностная активность и динамика формирования адсорбционных слоев на границе воздух/вода
Динамические кривые поверхностного давления адсорбционных слоев, формируемых на границе воздух/водный раствор глицинина и глицинина-П разной концентрации представлены на рис.1. Форма кривых (рис.2) типична для глобулярных белков. Зависимости для обоих белков при концентрации 0,001 мг/мл характеризуются 8-образной формой, на которых можно выделить 3 основных участка - индукционный период или лаг-фаза (начальный участок относительно медленного возрастания поверхностного давления), участок значительного повышения поверхностного давления (постиндукционный период) и стационарную фазу, на которой поверхностное давление достигает максимального значения и в дальнейшем практически не меняется.
Известно, что наличие индукционного периода свидетельствует о том, что процесс адсорбции контролируется стадией диффузии макромолекул белка из объема к межфазной поверхности. При концентрации белков в растворе 0,001 мг/мл индукционный период в случае глицинина составляет примерно 1000 сек, а глицинина-П - 600 сек. Уменьшение величины индукционного периода в случае модифицированной формы белка объясняется более высокой скоростью ее диффузии вследствие более низкой молекулярной массы и меньшего гидродинамического размера [20].
Время, тыс. сек Рис. 1 - Динамические кривые поверхностного давления адсорбционных слоев молекул глицинина (0,001 мг/мл - А, 1,0 мг/мл - В) и глицинина-П (0,001 мг/мл - Б, 1,0 мг/мл - Г) на границе буферный раствор/воздух при температуре 25оС
Время, тыс. сек Рис. 2 - Динамические кривые поверхностного давления адсорбционных слоев молекул глицинина (0,001 мг/мл - А, 1,0 мг/мл - В) и глицинина-П (0,001 мг/мл - Б, 1,0 мг/мл - Г) на границе буферный раствор/воздух при температура 25оС (начальные участки кривых)
С увеличением объемной концентрации белка величина индукционного периода обычно сокращается [22], что и наблюдалось в наших исследованиях. При объемной концентрации белков 1 мг/мл и выше кривые п(т) демонстрируют лишь пост-индукционную и финальную стадии адсорбции
(рис. 1). При данной концентрации стадия "индукции" отсутствует, то есть межфазная поверхность практически сразу заполняется молекулами, и поверхностное давление при высоких концентрациях белка уже лимитируется не скоростью диффузии молекул, а величиной энергетического барьера, обусловленного конформационными перестройками, пространственными затруднениями и взаимным влиянием одноименных зарядов при адсорбции молекул белка по мере заполнения ими адсорбционного слоя.
Постиндукционный период, участок наиболее интенсивного повышения поверхностного давления, характеризуется большей крутизной в случае глицинина-П. Это обусловлено его большей конформационной лабильностью и более низким поверхностным зарядом [20]. На этом участке происходит разворачивание адсорбированных белковых молекул и их ориентация неполярными участками к неполярной фазе.
При одинаковых концентрациях интактного и модифицированного белков в растворах последний в большей степени повышает поверхностное давление. Предположительно, это связано с большей поверхностной гидрофобностью глицинина-П и более низким энергетическим барьером при его адсорбции. Как известно из литературы, ферментативно модифицированный соевый изолят также проявлял более высокие значения поверхностного давления по сравнению с немодифицированным [23].
С повышением концентрации белков наблюдается увеличение поверхностного давления, что связано с повышением концентрации белка в адсорбционном слое [24].
30
м/
I 28
м 26
<D S 24
X 22
ф
л
m 20
га
Ч 18
ш
о 16
I
сЗ 14
о 12
I
X
ф 10
m о 8-
а
5,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
lgC (мг/мл)
Рис. 3 - Изотермы адсорбции глицинина (темные квадраты) и глицинина-П (светлые квадраты) на границе воздух раствор при 25оС. Время формирования адсорбционного слоя 70 000 сек
На рис. 3 представлены изотермы адсорбции глицинина и глицинина-П на границе с воздухом при 25оС. Максимальное значение поверхностного давления адсорбционных слоев глицинина-П составляет 28,4±1,2 мН/м и достигается при минимальной концентрации -1,5 мг/мл. Максимальное значение поверхностного давления
интактного глицинина несколько ниже (25,2±1,1 мН/м) и достигается при более высокой концентрации белка в растворе (- 4,0 мг/мл). Таким образом, молекулы модифицированного белка способны образовывать насыщенные адсорбционные слои при более низких концентрациях, чем интактного.
Реологические свойства адсорбционных слоев
Межфазная эластичность является мерой способности измененной межфазной поверхности восстанавливать равновесное состояние после снятия напряжения. Эта способность зависит от частоты прилагаемых дилатационных деформаций и свойств молекул.
На рис.4 представлены частотные зависимости действительной и мнимой частей дилатационных модулей глицинина и глицинина-П. Действительная часть дилатационного модуля значительно превосходит мнимую при всех частотах для обоих белков. Кроме того, как для интактного, так и для модифицированного белка наблюдается заметное увеличение действительной части дилатационного модуля с увеличением частоты колебаний. Этот эффект объясняется тем, что при больших скоростях деформации молекулы белка не успевают полностью перемещаться из адсорбционного слоя в приадсорбционный и обратно.
Мнимая часть дилатационного модуля слабо зависит от частоты прилагаемых деформаций и концентрации белков в растворе, принимая близкие значения у глицинина и глицинина-П. Тангенс угла потерь с увеличением частоты понижается (данные не приведены). Совокупность наблюдаемых эффектов характерна для всех белков с глобулярной структурой и указывает на упругое (твердообразное) поведение адсорбционных слоев интактного и
модифицированного глицинина.
70
2 60.0
4 50-1
0
5
>5 40-1 л
1
° 30-1 :т га
20
^ 10
А
70 60 50 403020 10 - 0
0
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020
Частота колебаний, Гц Рис. 4 - Действительная (темные символы) и мнимая (светлые символы) составляющие дилатационного модуля адсорбционных слоев глицинина (А) и глицинина-П (Б) при различных концентрациях - 0,001 мг/мл (квадраты), 0,01 мг/мл (кружки), 0,1 мг/мл (треугольники), 1 мг/мл (ромбы)
Аналогичные зависимости дилатационного модуля и фазового угла от частоты колебаний были ранее установлены для интактного глицинина [22].
Напротив, в работе [25] при сравнительном исследовании поверхностной активности и дилатационных характеристик адсорбционных слоев молекул глицинина и продуктов его ограниченного протеолиза алькалазой было показано, что адсорбционные слои модифицированных молекул обладают более вязкоэластичными свойствами в сравнении с глицинином, что выражалось в понижении упругой составляющей дилатационного модуля и повышении фазового угла. Таким образом, в результате ферментативной модификации
увеличивалась вязкостная составляющая
комплексного дилатационного модуля. Мы же наблюдали обратную картину. Ограниченный протеолиз папаином приводил к повышению упругости адсорбционных слоев.
Как следует из рис. 4, по абсолютной величине действительной составляющей
дилатационного модуля и большей ее зависимости от концентрации и частоты нагружения глицинин-П демонстрирует более выраженный упругий (твердообразный) характер реологического поведения, чем интактный глицинин. По-видимому, это обусловлено его способностью формировать более плотные адсорбционные слои вследствие большего сродства к неполярной поверхности, меньшего размера молекул, более низкой плотности поверхностного заряда и более высокой конформационной лабильности.
Зависимость свойств адсорбционных слоев от концентрации соли (N30!) в растворе
Известно, что присутствие неорганических солей в растворе ускоряет адсорбцию белка за счет понижения электростатического отталкивания между адсорбируемыми макромолекулами [26,27]. Присутствие неорганических солей экранирует электростатическое отталкивание между молекулами белка в адсорбционном слое, что приводит к усилению стэкинг-взаимодействий и формированию более прочных адсорбционных слоев. Можно ожидать увеличения поверхностного давления растворов белков с увеличением концентрации ЫаО! в растворе. Именно такая закономерность установлена как для интактной, так и модифицированной формы глицинина в интервале концентраций ЫаО! 0-0,5 М (табл. 1).
Таблица 1 - Параметры растворов глицинина и глицинина-П при различной концентрации N80! в растворе (концентрации белков - 0,1 мг/мл)
В то же время, с увеличением концентрации хлорида натрия действительные части дилатационных
модулей адсорбционных слоев глицинина и глицинина-П, понижаются. В работе [28] также было показано понижение дилатационного модуля 11S и 7S глобулинов сои при добавлении NaCI в нейтральной области рН. Аналогичное поведение наблюдалось в случае BSA [29]. Понижение значений дилатационного модуля при более высоких концентрациях NaCI объясняются тем, что соль облегчает денатурацию белков на межфазной поверхности и переориентацию сегментов молекулы в адсорбционном слое. Денатурированный белок на поверхности обладает меньшей жесткостью, что выражается в меньшем значении дилатационного модуля [29].
Как было показано в работе [24], в области изоточки глицинина (при рН5,0) наблюдаются наименьшие значения дилатационного модуля, которые растут при удалении от нее, то есть при росте заряда на поверхности белка. Аналогично, в нашей работе продемонстрировано, что более высокая ионная сила, компенсирующая (понижающая) поверхностный заряд молекул белка, способствует понижению величины дилатационного модуля.
Модификация молекул глицинина соевых бобов путем ограниченного протеолиза с использованием папаина обеспечивает увеличение его поверхностной активности, повышение скорости формирования его адсорбционных слоев на границе воздух/раствор и повышение их упругости особенно при низких ионных силах раствора. Наблюдаемые изменения адсорбционного поведения
модифицированного глицинина являются прямым следствием изменения молекулярных параметров структуры глицинина в процессе ограниченного протеолиза папаином.
Литература
1. R.V. Kumar, M.S.Choudhary, I.K. Varma, B. Mattiason Ind. Crops Prod. 16, 155-172 (2002)
2. M. Adachi, J. Kanamori, T. Masuda, K. Yagasaki, K. Kitamura, B. Mikami, S. Utsumi Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 7395-7400 (2003)
3. J. E. Kinsella JAOCS, 56, 242-258 (1979).
4. S. Utsumi, Y. Matsumura, T. Mori Food proteins and their application, CRC Press, Boca Raton, 1997, C. 257-291. (1997)
5. L. S. Bernardi Don, A. M. R. Pilosof, G. B. Bartholomai J. Am Oil Chem Soc. 68, 2, 102-105 (1991).
6. Molina Ortiz, S. and J.R. Wagner Food Res. Int. 35 511518 (2002).
7. J.B. German, T.E. O'Neill, J.E. Kinsella JAOCS, 62, 9, 1358-1366 (1985);
8. S.Y. Kim, P.S.W. Park, K.C. Rhee J.AgricFood Chem. 38, 3, 651-656 (1990).
9. C.M.Anon, S. Molina Ortiz J. Am. Oll Chem. Soc 77,
12, 1293-1301 (2000)
10. M. B. Barac, S. P. Stanojevic, S. T. Jovanovic, M. B. Pesic APTEFF, 35, 3-15 (2004)
11. K. Tsumura Food Sci. Technol. Res., 15, 4, 381 - 388 (2009)
12. A. D. Shutov, I. A. Vaintraub, Phytochemistry, 26, 6, 15571566 (1987)
13. L. Were, N. S. Hettiarachchy, U. Kalapathy J. Food Sci., 62, 4, 821- 850 (1997)
Белок
Параметр Концентр ация NaCl, M Глицинин Глицинин -П
Макси мально е поверх ностно е давлен 0 20,0±1,2 24,6±1,2
0,2 21,5±1,2 25,9±1,1
0,5 22,1±1,3 27,8±1,3
Дилата ционн ый модул ь, (50 сек) 0 61,3±0,7 98,5±0,7
0,2 53,2±0,6 78,8±0,7
0,5 42,0±0,5 61,5±0,6
14. W.U. Wu, N. S. Hettiarachchy, M. Qi, JAOCS, 75, 7, 845850 (1998)
15. M. Adachi, J. Kanamori, T. Masuda, K. Yagasaki, K. Kitamura, B. Mikami, S. Utsumi Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 7395-7400 (2003)
16. A.D. Shutov, V.I. Senyuk, I.A. Kakhovskaya, J. Pineda Biokhimiya, 58, 174-182 (1993)
17. Loglio G., Pandolfini P., Miller R., Makievski A.V., Ravera F., Ferrari M., Liggieri L. // Novel Methods to Study Interfacial Layers, Studies in Interface Science. 2001. V. 11. P. 439.
18. S. S. Dukhin, R. Miller, G. Kretzschmar, Dynamics of Adsorption at Liquid Interfaces: Theory, Experiment, Applications. Elsevier, Amsterdam, 1995. 600 c.
19. J. Lucassen, V. D. Tempel Chemical Engineering Science, 27, 6, 1283-1291 (1972)
20. А. В. Поляков, А. Н. Даниленко, А. В. Кривандин, С.В. Рудаков, А.С. Рудакова, А. Д. Шутов, И. Г. Плащина, Г.Е. Заиков, О. Н. Кузнецова Вестник Казанского Технологического Университета, 9, 184-189 (2013)
21. A.D. Shutov, A. Rudakova, S. Rudakov, I. Kakhovskaya, A. Schallau, N. Maruyama, K. Wilson J. Plant. Physiol., 169, 1227-1233 (2012)
22. J. M. Rodriguez Patino, M. R. Rodriguez Nino, C. Carrera Sanchez, S. E. Molina Ortiz, M. C. Anon, Journal of Food Engineering 68, 4, 429-437 (2005)
23. K. D. Martirnez, C. C. Sarnchez, J. M. R. Patino, A. M.R. Piloso, FoodHydrocolloids, 23, 2149-2157 (2009)
24. Zhou Chun-xia, Yang Xiao-quan, Wen Qi-bia Journal of Shaanxi University of science and technology, 24, 22-27 (2006)
25. V. P. Ruiz-Henestrosa, C. Carrera Sanchez, J. J. Pedroche, F. Millan, J.M. Rodriguez Patino Food Hydrocolloids 23, 2, 377- 386 (2009)
26. B.A. Noskov, S.N. Nuzhnov, G. Loglio, R. Miller, Macromolecules, 37, 7, 2519-2526 (2004)
27. B.A. Noskov Current Opinion in Colloid & Interface Science, 15, 4, 229-236 (2010)
28. V. P. Ruiz-Henestrosa, C.C. Sanchez, J. M. Rodriguez Patino JAgric Food Chem 55, 15, 6339-6348 (2007)
29. L. G. C. Pereira, O. Theodoly, H. W. Blanch, C. J.Radke, Langmuir, 19, 6, 2349-2356 (2003)
© А. В. Поляков - асп. лаб. физико-химической модификации биополимеров, Институт биохимической физики им. М.Н.Эмануэля РАН, po1yakov-a-v@mai1.ru; А. Н. Даниленко - вед. науч. сотр. той же лаборатории, ana-dani1enko@yandex.ru; А. Д. Шутов - д-р биол. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. биохимии растений, Государственный университет Молдовы, shutovandrei@yahoo.com; И. Г. Плащина - канд. хим. наук, зав. лаб. физико-химической модификации биополимеров, Институт биохимической физики им. М.Н.Эмануэля РАН, igp1ashchina@sky.chph.ras.ru; В. Ф. Шкодич - канд. хим. наук, доц. каф. технологии синтетического каучука КНИТУ, shkodich@mai1.ru; А. М. Кочнев - д.п.н., проф., зав. каф. технологии синтетического каучука КНИТУ, kochnev55@bk.ru; Г. Е. Заиков - д.х.н., профессор каф. технологии пластических масс КНИТУ, gezaikov@yahoo.com.
