CC BY
40
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИИ - 2016 - Т. 23, № 2 - С. 50-55 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 2 - P. 50-55
УДК: 616-001.16: 577.15 DOI: 10.12737/20424
ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРО- И АНТИОКСИДАНТНОГО БАЛАНСА КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
А.Г. СОЛОВЬЕВА*, С.П. ПЕРЕТЯГИН*, Н.В. ДИДЕНКО*, А.И. ДУДАРЬ**
'ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Верхне-Волжская наб., 18/1, Нижний Новгород, Россия, 603155
"ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им.
Н.И.Лобачевского», пр. Гагарина, 23, Нижний Новгород, Россия, 603950
Аннотация. В работе представлены результаты исследования окислительного метаболизма крови интактных животных, подвергнутых длительному ингаляционно-наружному воздействию газовой смеси, содержащей синглетный кислород. Эксперимент выполнен на крысах линии Wistar. Продолжительность эксперимента составила 30 и 60 суток. Контроль представлен здоровыми крысами без каких-либо манипуляций. В плазме крови и эритроцитах изучали интенсивность перекисного окисления липидов с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции и по уровню малонового диальдегида. В гемолизате эритроцитов определяли активность супероксиддисмутазы, каталазы. Воздушный поток с синглетным кислородом получали с применением аппарата «Airnergy» (Германия) при мощности генератора 100%. Показано, что длительное субхроническое ингаляционно-наружное воздействие газовой смеси, содержащей синглетный кислород через 30 суток снижает про-и антиоксидантный баланс в организме животных: отмечено уменьшение концентрации малонового диальдегида в плазме и эритроцитах, падение общей антиоксидантной активности и удельной активности супероксиддисмутазы. В восстановительном периоде спустя 60 суток после применения синг-летного кислорода выявлено минимально инициирующее его влияние на процессы перекисного окисления (по данным биохемилюминесценции) в плазме крови и повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы в эритроцитах.
Ключевые слова: синглетный кислород, перекисное окисление липидов, малоновый диальдегид, супероксиддисмутаза, каталаза.
CHANGE OF INDICATORS OF PRO- AND ANTIOXIDANT BLOOD BALANCE DURING CHRONIC EXPOSURE OF SINGLET OXYGEN IN THE EXPERIMENT
A.G. SOLOVEVA*, S.P. PERETYAGIN*, N.V. DIDENKO*, A.I. DUDAR**
Privolzhsky Federal Research Medical Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation, 603155, Nizhny Novgorod, Verhne-Volzhskaya sq., 18/1 "Lobachevsky Nizhni Novgorod State University, 603950, Nizhny Novgorod, Gagarin av., 23
Abstract. This article presents the results of a study of oxidative metabolism of blood of intact animals subjected to prolonged inhalation-external exposure to the gas mixture containing singlet oxygen. The experiment was performed on Wistar rats. Duration of experiment was 30 and 60 days. The control was presented by healthy rats without any manipulation. In plasma and erythrocytes intensity of lipid peroxidation using the method of induced biochemic iluminescence and by the level of malonic dialdehyde was studied. In the hemo-lysate of erythrocytes the activity of superoxide dismutase, catalase was determined. The air flow singlet oxygen was obtained with the application of the "Airnergy" (Germany) with the capacity of the generator 100%. It was shown that a long period of inhalation-external sub-chronic exposure to the gas mixture containing singlet oxygen after 30 days reduces pro - and antioxidant balance in the organism of animals: the decrease in the concentration of malonic dialdehyde in plasma and erythrocytes, the decrease in total antioxidant activity and specific activity of superoxide dismutase were marked. During the recovery period then 60 days after applying the
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 2 - P. 50-55
singlet oxygen were noted the minimum initiating influence on peroxidation processes in blood plasma and increase activity of catalase and superoxide dismutase in erythrocytes.
Key words: singlet oxygen, lipid peroxidation, malonic dialdehyde, superoxide dismutase, catalase.
Применение любых активных форм кислорода в биологии и медицине с саногенетиче-скими целями неизбежно приводит к интенсификации свободно-радикального окисления (СРО), активации процессов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) биологических мембран, направленных на адаптивное в условиях гиперметаболизма повышение клеточной проницаемости. Поэтому использование окислительных методов терапии неразрывно связано с необходимостью исследования процессов липопероксида-ции, так как изменение баланса про- и антиок-сидантных систем организма является одним из диагностических критериев тяжести патологического состояния, характеризуя формирование и прогрессирование окислительного стресса [2,3]. Синглетно-кислородная терапия в настоящее время является новым методом кисло-родотерапии на основе использования синглет-но-кислородных смесей [6,10]. Синглетно-кислородная терапия имеет широкое применение при патологии органов дыхания и пищеварения, для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сахарного диабета. Применение синглетного кислорода (СК) нормализует содержание гемоглобина, потенциал клеточных мембран, углеводный обмен, активирует фагоцитоз и фосфорилирующее дыхание митохондрий, стимулирует обменные и регенеративные процессы в тканях, снижает активность воспалительных процессов и признаки гипоксии, восстанавливает антиоксидантное состояние и повышает детоксикационную функцию организма [6]. В то же время СК играет ключевую роль при развитии ряда патологических процессов, таких как катаракта, протопор-фирии, синдром ишемии-реперфузии [8,9]. В этой связи актуальна проблема изучения механизмов свободнорадикальных процессов при ингаляционно-наружном использовании газовой смеси, содержащей СК в условиях ее хронического воздействия на организм млекопитающих, а также при нарушении функций организма в условиях патологии.
Цель исследования - изучение влияния газовой смеси, содержащей синглетный кислород, на про- и антиоксидантные системы крови ин-тактных крыс при длительном ее применении.
Материалы и методы исследования. Эксперимент был проведен на белых крысах-самцах линии Wistar, полученных из филиала «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (Филиал «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, г. Москва). Все животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, согласно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской Конвенции ET/S 129, 1986 и директивам 86/609 ESC [4]. Из 19 крыс массой 200-250 г. сформировали 3 группы: первая - контроль (интактные здоровые животные, n=8); вторая - опытная (n=6), в которой крысы были подвергнуты ежедневному воздействию (по 10 минут) газовой смеси, содержащей СК, в течение 30 дней; третья -опытная (n=5), животные которой на протяжении 30 суток ежедневно ингалировались по 10 минут газовой смесью с синглетным кислородом и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям. Крыс второй группы выводили из эксперимента на 30-е сутки, животных третьей группы - на 60-е сутки путем декапитации под комбинированным наркозом (Золетил (60 мг/кг) + Ксила(6 мг/кг)). Ингаляционно-наружное воздействие СК на животных осуществляли в эксикаторе. Воздушный поток с СК получали с применением аппарата «Airnergy» (Германия) при мощности генератора 100%.
Для исследований баланса про- и антиок-сидантных систем использовали кровь, стабилизированную цитратом натрия (1:9). В плазме крови и эритроцитах изучали активность процессов СРО с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на биохемилю-минометре БХЛ-06 (Н.Новгород) [1]. Оценивали
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 2 - P. 50-55
следующие параметры хемилюминограммы: tg2a - показатель, характеризующий скорость спада процессов СРО в плазме и свидетельствующий об общей антиоксидантной активности (АОА); S - светосумма хемилюминесценции за 30 сек. - отражает потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ. Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по уровню содержания вторичного продукта СРО - малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах методом M.Uchiyama, M.Mihara [12].
Среди ферментов, представляющих первое звено антиоксидантной системы защиты, исследовали супероксиддисмутазу (СОД), которая переводит супероксидный радикал в электронейтральную форму Н2О2. Активность СОД определяли в гемолизате отмытых эритроцитов (1:10) по ингибированию образования продукта аутоокисления адреналина [7]. В гемолизате отмытых эритроцитов (1:100) определяли активность каталазы, катализирующей реакцию разложения перекиси водорода [5]. Расчет удельной активности ферментов осуществляли по концентрации белка, исследовавшегося модифицированным методом Лоури [13]. Результаты исследований обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0, с помощью которой рассчитывалась средняя арифметическая величина показателей и ошибка среднего. Значимость различий между показателями определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.
Результаты и их обсуждение. По данным биохемилюминесценции полученные результаты свидетельствовали о снижении про- и анти-оксидантного баланса в плазме крови животных через 30 суток после применения газовой смеси, содержащей синглетный кислород (рис. 1, 2). Светосумма хемилюминесценции во второй опытной группе уменьшилась на 38% по сравнению с контролем (p=0,001). В восстановительном периоде (через 60 суток) после ингаляций газовой смеси, содержащей СК, показатель S увеличился на 36% (р=0,014) по сравнению с 30 сутками, но оказался ниже показателя здоровых животных на 16% (р=0,032) (рис. 1).
При этом через 30 и 60 суток после воздействия газовой смеси, содержащей СК, антиок-
сидантные резервы, оцениваемые по значению показателя tg 2а, уменьшились на 21% (р=0,038) и 17% (р=0,041) соответственно по сравнению с показателем контрольной группы (рис. 2).
Рис. 1. Динамика изменения светосуммы хемилюминесценции в крови крыс при воздействии газовой смеси, содержащей синглетный кислород, в условиях хронического эксперимента.
Примечание: 1 - первая группа - контроль (интакт-ные здоровые животные); 2 - вторая опытная группа,
в которой крысы 30 суток ингалировались газовой смесью, содержащей СК; 3 - третья опытная группа, животные которой на протяжении 30 суток ингали-ровались газовой смесью с синглетным кислородом и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям; * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению со второй опытной группой (p<0,05)
Одновременно у крыс второй и третьей опытных групп в эритроцитах также выявлено снижение светосуммы хемилюминисценции, характеризующей процесс перекисного окисления липидов, на 25% (р=0,017) и 26% (р=0,021) по сравнению с интактными животными (рис. 1), что коррелирует с повышением резистентности мембран к воздействию перекиси водорода [1], но в условиях длительной кислородной интоксикации может привести к нарушениям в биологических мембранах, связанным с изменением их проницаемости, ионного транспорта и физико-химических свойств мембранных белков и липидов, изменением активности мембранно-связанных ферментов, уменьшением электрической стабильности ли-пидного бислоя мембран [2,11].
^ШХАЬ ОЕ ХЕШ МЕБТСАЬ ТЕСИХОШСТЕБ - 2016 - V. 23, № 2 - Р. 50-55
0,9 п
1 2 3
Рис. 2. Динамика изменения показателя 122а в плазме крови крыс при воздействии газовой смеси, содержащей синглетный кислород, в условиях хронического эксперимента
Примечание: 1 - первая группа - контроль (интакт-ные здоровые животные); 2 - вторая опытная группа,
в которой крысы 30 суток ингалиро вались газовой смесью, содержащей СК; 3 - третья опытная группа, животные которой на протяжении 30 суток ингали-ровались газовой смесью с синглетным кислородом и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям; * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению со второй опытной группой (р<0,05)
Таблица 1
Концентрация малонового диальдегида в крови крыс при субхроническом воздействии синглетного кислорода
Примечание: 1 - первая группа - контроль (интакт-ные здоровые животные); 2 - вторая опытная группа,
в которой крысы 30 суток ингалиро вались газовой смесью, содержащей СК; 3 - третья опытная группа, животные которой на протяжении 30 суток ингали-ровались газовой смесью с синглетным кислородом и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям; * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению со второй опытной группой (р<0,05)
Таким образом, ингаляционно-наружное применение газовой смеси, содержащей кисло-
род, приводит к снижению про- и антиоксидант-ного баланса крови через 30 суток после воздействия. В восстановительном периоде спустя 60 суток после использования СК отмечена тенденция к росту перекисного окисления липидов и общей антиоксидантной активности плазмы крови.
Снижение общего уровня прооксидантно-го баланса на фоне длительного воздействия газовой смеси, содержащей СК, подтверждали также данные определения вторичного продукта ПОЛ - МДА. Полученные результаты показали уменьшение концентрации малонового диальдегида в плазме крови во второй и третьей опытных группах соответственно на 23% (р=0,034) и 60% (р=0,001) по сравнению с интактными животными (табл. 1).
В эритроцитах не выявлено изменения концентрации МДА спустя 30 суток после воздействия газовой смеси, содержащей синглетный кислород, по сравнению с контрольной группой крыс (табл. 1). В третьей опытной группе в эритроцитах отмечено снижение уровня МДА по сравнению с контролем и показателем второй экспериментальной группы на 41% (р=0,010) и 42% (р=0,018) соответственно.
Таблица 2
Активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах крови крыс при субхроническом воздействии синглетного кислорода
Примечание: 1 - первая группа - контроль (интакт-ные здоровые животные); 2 - вторая опытная группа,
в которой крысы 30 суток ингалировались газовой смесью, содержащей СК; 3 - третья опытная группа, животные которой на протяжении 30 суток ингалировались газовой смесью с синглетным кислородом и затем 30 суток не подвергались никаким манипуляциям; * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению со второй опытной группой (р<0,05).
Исследование ферментативного звена антиоксидантной защиты организма выявило уменьшение удельной активности СОД на 7% (р=0,058) и повышение каталитических свойств
Показатель 1 2 3
МДА в плазме, мкмоль/л 1,043±0,019 0,804±0,013* 0,421±0,009*/**
МДА в эритроцитах, мкмоль/л 6,040±0,038 5,997±0,054 3,485±0,024*/**
Показатель 1 2 3
СОД, усл.ед/мг белка 917,30±18,21 852,97±10,67 1138,68±15,09*/**
Каталаза, усл.ед./минЧмг белка 19,30±0,58 24,83±0,54* 33,65±1,21*/**
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2016 - Т. 23, № 2 - С. 50-55 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 2 - P. 50-55
каталазы на 29% (р=0,012) через 30 суток после воздействия газовой смеси, содержащей СК, по сравнению с контролем (табл. 2). В восстановительном периоде спустя 60 суток после ингаляционно-наружного применения синг-летного кислорода отмечено повышение анти-оксидантных ресурсов эритроцитов, проявляющееся в увеличении удельной активности СОД и каталазы. В третьей опытной группе активность СОД возросла на 24% (р=0,033) и 34% (р=0,002) по сравнению с контролем и показателем второй опытной группы соответственно. Активность каталазы через 60 суток после воздействия СК повысилась на 74% (р=0,001) и 36% (р=0,017) по сравнению с показателями здоровых животных и крыс второй опытной группы соответственно.
Таким образом, изменения про- и антиок-сидантного статуса под влиянием газовой смеси, содержащей синглетный кислород, при длительном ее применении по данным биохе-милюминесценции свидетельствовали об уменьшении окислительного потенциала на системном уровне (кровь) и могли быть одной из причин ослабления сопротивляемости организма [11]. Участие синглетного кислорода в процессах перекисного окисления обусловле-
Литература
1.
2. З.
4.
5.
б.
но, вероятно, способностью СК внедряться по месту двойных связей в молекулы полиненасыщенных жирных кислот с образованием гидропероксидов [6]. На этом фоне была статистически значимо повышена энзиматиче-ская антиоксидантная активность в эритроцитах в восстановительном периоде через 60 суток после ингаляционно-наружного применения синглетного кислорода. Это создавало условия для обрыва процессов перекисного окисления липидов.
Выводы:
1. Результаты проведенного исследования позволяют констатировать, что длительное субхроническое ингаляционно-наружное воздействие газовой смеси, содержащей синглет-ный кислород, на протяжении 30 суток снижает в целом про- и антиоксидантный баланс в организме животных.
2. Спустя 60 суток после применения синглетного кислорода отмечено минимально инициирующее его влияние на процессы пе-рекисного окисления в плазме крови с преимущественным защитным антиоксидантным действием в эритроцитах.
References
Кузьмина Е.И., Перетягин С.П., Евстигнеев С.В. Определение антиоксидантного потенциала в плазме крови ожоговых больных: пособие для врачей. Н. Новгород: ННИИТО, 2000. 12 с. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Фирма «Слово», 2006. 556 с.
Павлюченко И.И., Ременякина Е.И., Панасенко-ва Ю.С., Ваштак И.В. Целесообразность мониторинга перекисного окисления липидов для оценки эффективности терапевтических программ в условиях санатория // Фундаментальные исследования. 2012. № 7. С. 151-154.
Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / Под ред. Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева. М.: Профиль - 2С, 2010. 358 с.
Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 2011. 61 с. Синглетно-кислородная терапия (научно-методическое пособие) / Под ред. И.З. Самосюк,
Kuz'mina EI, Peretyagin SP, Evstigneev SV. Opredele-nie antioksidantnogo potentsiala v plazme krovi oz-hogovykh bol'nykh: posobie dlya vrachey. N. Novgorod: NNIITO; 2000. Russian. Men'shchikova EB, Lankin VZ, Zenkov NK. Okisli-tel'nyy stress. Prooksidanty i antioksidanty. Moscow: Firma «Slovo»; 2006. Russian.
Pavlyuchenko II, Remenyakina EI, Panasenkova YuS, Vashtak IV. Tselesoobraznost' monitoringa perekisno-go okisleniya lipidov dlya otsenki effektivnosti tera-pevticheskikh programm v usloviyakh sanatoriya. Fundamental'nye issledovaniya. 2012;7:151-4. Russian.
Rukovodstvo po laboratornym zhivotnym i al'terna-tivnym modelyam v biomeditsinskikh issledova-niyakh / Pod red. N.N. Karkishchenko, S.V. Gracheva. Moscow: Profil' - 2S; 2010. Russian. Sibgatullina GV, Khaertdinova LR, Gumerova EA. Metody opredeleniya redoks-statusa kul'tiviruemykh kletok rasteniy. Kazan': Kazanskiy (Privolzhskiy) Fed-eral'nyy universitet; 2011. Russian. Singletno-kislorodnaya terapiya (nauchno-metodicheskoe posobie) / Pod red. I.Z. Samosyuk, L.I.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 2 - P. 50-55
Л.И. Фисенко. Киев: НМЦ «Мединтех», 2007. 228 с.
7. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45, № 3. С.109-116.
8. Dufour Y.S., Landick R., Donohue T.J. Organization and Evolution of the Biological Response to Singlet Oxygen Stress // J Mol Biol. 2008. Vol. 383, № 3. P. 713730.
9. Hwang J.Y., Lubow D.J., Chu D., Sims J., Alonso-Valenteen F., Gray H.B., Gross Z., Farkas D.L., Me-dina-Kauwe L.K. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity // J Control Release. 2012. Vol. 163, № 3. P. 368-373.
10. Riethmuller M., Burger N., Bauer G. Singlet oxygen treatment of tumor cells triggers extracellular singlet oxygen generation, catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis-inducing signaling // Redox Biol. 2015. № 6. P. 157-168.
11. Tarpy S.P., Celli B.R. Long-term oxygen therapy // Engl J Med. 1995. Vol. 333, № 11. Р. 710-714.
12. Uchiyama M., Mihara М. Determination of malonalde-hyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Analyticac Biochemistry. 1978. № 86. Р. 271.
13. Waterborg J.H., Matthews H.R. The Lowry method for protein quantitation // Methods Mol Biol. 1994. Vol. 32, №1. P. 1-4.
Fisenko. Kiev: NMTs «Medintekh»; 2007. Russian. Sirota TV. Novyy podkhod v issledovanii protsessa autookisleniya adrenalina i ispol'zovanie ego dlya izmereniya aktivnosti superoksiddismutazy. Voprosy meditsinskoy khimii. 1999;45(3):109-16. Russian.
Dufour YS, Landick R, Donohue TJ. Organization and Evolution of the Biological Response to Singlet Oxygen Stress. J Mol Biol. 2008;383(3):713-30.
Hwang JY, Lubow DJ, Chu D, Sims J, Alonso-Valenteen F, Gray HB, Gross Z, Farkas DL, Medina-Kauwe LK. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. J Control Release. 2012;163(3):368-73.
Riethmuller M, Burger N, Bauer G. Singlet oxygen treatment of tumor cells triggers extracellular singlet oxygen generation, catalase inactivation and reactivation of intercellular apoptosis-inducing signaling. Redox Biol. 2015;6:157-68.
Tarpy SP, Celli BR. Long-term oxygen therapy. Engl J Med. 1995;333(11):710-4.
Uchiyama M, Mihara M. Determination of malonalde-hyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Analyticac Biochemistry. 1978;86:271. Waterborg JH, Matthews HR. The Lowry method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 1994;32(1):1-4.
