CC BY
35
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
УДК 612.63.031.3:618.36:616.523-036.11
И.В. Довжикова
ИЗМЕНЕНИЕ ОБМЕНА ГЕСТАГЕНА ПРИ ГЕСТАЦИИ, ПРОТЕКАЮЩЕЙ НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН (Благовещенск)
При обострении герпес-вирусной инфекции обнаружено снижение содержания прогестерона в периферической крови, и. в плаценте беременных на различных этапах гестации. Выявленное изменение являлось результатом, недостатка базисного стероида — холестерина, а также нарушения, процесса синтеза стероидного гормона: низкой активности фермента — 3^-гидроксистероиддегидрогеназы — в плаценте и. неадекватности регуляторных механизмов гормонообразования.
Ключевые слова: гестаген, холестерин, плацента, герпес
CHANGE OF GESTOGEN METABOLISM AT THE GESTATION WITH HERPES-VIRAL INFECTION RECURRENCE
I.V. Dovzhikova
Far Eastern Scientific Centre of Physiology and Pathology of Respiration, Siberian Branch of Russian
Academy of Medical Sciences, Blagoveshchensk
Decrease of blood and placenta progesterone concentration was found in pregnant women with herpes-viral infection recurrence at all stages of gestation. Revealed, change was shown as a result of basic steroid. — cholesterol content defect, as well as of distribution, of the steroid, hormone syntheses process: low activity of placental 3^-hydroxysteroid dehydrogenase and. steroidogenesis regulating mechanism, inadequacy.
Key words: progesterone, cholesterol, placenta, herpes
Среди персистирующих инфекций важное место занимают вирусы семейства герпес — одни из самых распространенных возбудителей у человека. Физиологический иммунодефицит беременных создает благоприятную основу для активации различных форм герпес-вирусной инфекции, что приводит к возникновению внутриутробного инфицирования плода и различных осложнений беременности, к числу которых относится фетоплацентарная недостаточность [1, 3, 5]. Появляются нарушения гормонального фона.
Главным гормоном гравидарного периода считается гестаген (прогестерон). Он необходим для трансформации эндометрия в децидуальную ткань и подготовки к имплантации, способствует развитию и васкуляризации эндометрия, снижает его тонус и возбудимость путем нейтрализации действия окситоцина, а также повышает мобильность и эластичность сосудов в гравидарный период [4,
6, 8]. Прогестерон-индуцирующий блокирующий фактор обеспечивает иммунную толерантность организма матери к развивающемуся плоду и гомеостаз эндометрия [9, 11]. Гестаген имеет высокую антиэстрогенную активность, умеренные антиандрогенный и антиминералокортикоидный эффекты, то есть данный стероид участвует в
создании баланса действия различных гормонов, поэтому его оценка очень важна [4].
Цель нашей работы — проанализировать содержание и обмен гестагена (прогестерона) в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили 98 образцов ворсинчатого хориона, взятого при проведении медицинских абортов на сроке 5—10 недель беременности, и 62 зрелые плаценты, полученные во время родоразрешения в срок от практически здоровых женщин, которые составили контрольную группу, и беременных с признаками клинического и лабораторно диагностированного обострения герпес-вирусной инфекции I типа. По значимым параметрам (возраст, акушерско-гинекологический анамнез, наличие других хронических соматических заболеваний) на момент обследования сравниваемые группы достоверно не различались.
Диагностику герпес-вирусной инфекции I типа осуществляли путем определения антител класса М и G к вирусу простого герпеса иммуноферментным методом с помощью стандартных тест-систем ЗАО
«Вектор-Бест» (Новосибирск) на аппарате спектрофотометр «Stat-Fax 2100» (USA).
Исследование стероидов (холестерин, прогестерон, 17-гидроксипрогестерон) в периферической крови и плацентарном гомогенате проводили методом иммуноферментного анализа, используя наборы «Новохол» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) и ЗАО «Алкор Био» (Санкт-Петербург, Россия) на спектрофотометре «Stat-Fax 2100» (США). Все пациентки обследовались в динамике по триместрам беременности (10 — 12 недель, 20 — 24 недели, 30 — 34 недели).
Плаценту забирали в течение 10—15 мин после родов. Её поверхность со стороны базальной пластинки отмывали большим количеством физиологического раствора. Плодовая часть плаценты срезалась скальпелем пластинками площадью 2 — 3 см2 и толщиной не более 1 мм. Кусочки ткани помещали в 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая в течение 15 мин на магнитной мешалке. Для получения экстрактов отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали, растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г — 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при —20 °С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и центрифугировали при 4000 об./мин при температуре +4 °С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при
— 20 °С до проведения ИФА.
Выявление 3р-гидроксистероиддегидрогеназы производилось по методу З. Лойда с соавт. (1982) в модификации лаборатории «Механизмов этиопа-тогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ» ДНЦ ФПД СО РАМН. Субстратом для выявления являлись 0,1 М растворы 5андростен-3р-ол-17он (SERVA). Для определения локализации энзима в качестве акцептора применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals в конечной концентрации 5 мМ. Как кофактор ис-
пользовали НАДФ в конечной концентрации 1 мМ. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1 М фосфатного буфера с рН = 7,4. Инкубацию проводили при 37 °С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывали дистиллированной водой, фиксировали в 10%-м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин.
Выявление аденилатциклазы проводили по J. Reik et al. (1970) в модификации Б.Я. Рыжавского (1979) в лаборатории «Нейроэндокринной регуляции дыхательной системы» ДНЦ ФПД СО РАМН. Метод выполнялся на криостатных срезах после фиксации 1% раствором глютаральдегида на како-дилатном буфере (рН = 7,4). Инкубация продолжалась в течение 30 минут при 37 °С с последующей обработкой срезов 0,5%-м раствором сульфида натрия. Осадок сульфида свинца маркировал места локализации фермента. Заключение обычное.
Количество образующихся продуктов реакции проводили путем подсчета на программе компьютерной цитофотометрии методом измерения на стандартную единицу площади 0,1 (зонд) в 100 различных точках объекта. Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики с оценкой достоверности различий по критерию Стъюдента (t). Принимались во внимание уровни значимости (р) 0,05, 0,01 и 0,001. Различия считали достоверными при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При физиологической беременности концентрация гестагена (прогестерона) в периферической крови возрастала по сравнению с показателями на начальном этапе беременности во II триместре на 17 % и в III триместре — уже на 40 % (табл. 1). Данный факт вполне объясняется особенностями стероидогенеза в данный период.
Доказано, что с первого триместра беременности фетоплацентарная система принимает активное участие в метаболизме прогестерона. Образующиеся при этом метаболиты обладают биологической активностью [12]. Наряду с определением количества прогестерона изучалась и динамика
Таблица 1
Содержание гестагена (прогестерона) и 17-гидроксипрогестерона на различных этапах беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции (рост титра антител класса Ig G 1: 12800) (нмоль/л)
Течение беременности Прогестерон 17-гидроксипрогестерон
Сроки гестации Группа исследования
I триместр Контрольная группа 181,3 ± 15,71 20,8 ± 1,77
Обострение герпеса 139,7 ± 14,11 p < 0,05 16,6 ± 1,91 p < 0,05
II триместр Контрольная группа 212,7 ± 9,02 25,1 ± 1,67
Обострение герпеса 159,5 ± 12,90 p < 0,01 19,9 ± 1,45 p < 0,05
III триместр Контрольная группа 254,9 ± 13,11 28,9 ± 1,51
Обострение герпеса 133,1 ± 12,75 p < 0,001 21,8 ± 1,45 p < 0,01
Примечание: здесь и далее р - достоверность различий по сравнению с контролем.
изменений его метаболита по биосинтезу — 17-ги-дроксипрогестерона. Количество данного стероида возрастало с течением гестации на 20 % во втором триместре и на 39 % в третьем по сравнению с показателями первого гравидарного этапа (табл. 1).
Синтез прогестерона во время гравидарного периода осуществляется плацентой. Постепенно, с 5-й недели внутриутробного развития, она становится основным поставщиком гормона и к концу беременности производит его 300 мг в день, что примерно в 10 раз больше, чем желтое тело яичников [13]. Поэтому для более полного отражения гормонального фона и стероидогенеза мы провели анализ содержания прогестерона в гомогенате непосредственно самого органа, взятого на разных сроках первого триместра беременности и полученного при родах. Концентрация данного стероидного гормона увеличивалась по мере роста срока развития так же линейно, как и в периферической крови матери (табл. 2).
Серьезные изменения выявлены при обострении герпес-вирусной инфекции в период гестации. Исследование содержания гестагена в периферической крови показало его достоверное снижение по сравнению с показателями контрольной группы в I триместре на 23 %, во II триместре — на 25 %. Серьезнее всего ситуация сложилась в III триместре беременности (табл. 1).
В гомогенате ворсинчатого хориона при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности также было выявлено, что содержание изучаемого гормона резко изменялось (табл. 2) по сравнению с показателями контрольной группы. Данная тенденция сохранялась при оценке количества гестагена в гомогенате зрелой плаценты, взятой при родах в срок от матерей, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности, где также было установлено достоверное снижение прогестерона на 25 %.
Достаточный уровень гормона необходим для сохранения гестации. В случае его падения, особенно в первом триместре, наступает десинхрониза-
ция развития эндометрия, что создает предпосылки для развития фетоплацентарной недостаточности и является в большинстве случаев основной причиной преждевременного прерывания беременности [4, 9, 11].
Изучение метаболита прогестерона — 17-ги-дроксипрогестерона — в плазме периферической крови при обострении герпес-вирусной инфекции показало ту же направленность изменений, что и у предыдущего стероида по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Отмечалось снижение его показателей в I и II триместрах более чем на 20 %. Наряду с этим динамика изменений 17-ги-дроксипрогестерона была изучена в гомогенате ворсинчатых хорионов, полученных при сроке 5 — 10 недель беременности (табл. 2). Количество его достоверно снизилось. Подобная же картина наблюдалась и при анализе стероида в гомогенате зрелой плаценты, где его содержание уменьшилось аналогичным образом по сравнению с показателями контрольной группы.
Рассмотрим факторы, которые могли привести к столь значительным нарушениям гестагенной концентрации. Совершенно ясно, что лимитирование процесса прогестероногенеза будет определяться достаточным наличием субстрата, которым в данном случае является холестерин. В том случае, если во время гестации регистрировалась активация герпес-вирусной инфекции, наблюдались резкие изменения в концентрации холестерина. В периферической крови матери в первом триместре количество данного стероида достоверно понизилось до 5,01 ± 0,09 ммоль/л (на 11 %), во втором — до 5,88 ± 0,12 ммоль/л (на 14 %) в третьем — до 6,33 ± 0,11 ммоль/л (на 19 %) по сравнению с контрольной группой, в которой оно составляло 5,61 ± 0,11 (р < 0,001), 6,78 ± 0,13 (р < 0,001) и 7,79 ± 0,12 ммоль/л (р < 0,001) соответственно. Примечательно, что данный факт отмечался не только в крови матери, но и непосредственно в самом органе, где происходит основной процесс стероидогенеза во время беременности. При обо-
Таблица2
Содержание гестагена (прогестерона) и 17-гидроксипрогестерона в гомогенате плаценты при обострении герпетической инфекции (повышение титра антител класса ^ G до 1: 12800) (нмоль/л)
Течение беременности Прогестерон 17-гидроксипрогестерон
Сроки гестации Группа исследования
Ворсинчатый хорион (5-6 недель) Контрольная группа 152,2 ± 38,92 17,4 ± 0,87
Обострение герпеса 23,4 ± 5,71 р < 0,001 8,5 ± 0,96 р < 0,001
Ворсинчатый хорион (7-8 недель) Контрольная группа 160,0 ± 21,13 26,3 ± 0,91
Обострение герпеса 32,9 ± 4,11 р < 0,01 14,1 ± 0,67 р < 0,001
Ворсинчатый хорион Контрольная группа 171,2 ± 22,16 32,8 ± 0,88
(9-10 недель) Обострение герпеса 48,3 ± 4,33 р < 0,001 17,3 ± 0,93 р < 0,001
Контрольная группа 240,5 ± 9,05 122,7 ± 12,31
Зрелая плацента Обострение герпеса 183,9 ± 13,18 р < 0,05 75,2 ± 10,3 р < 0,001
стрении герпес-вирусной инфекции наблюдалось достоверное снижение количества холестерина в гомогенате ворсинчатых хорионов I триместра беременности до 1,12 ± 0,093 ммоль/л по сравнению с контрольной группой (2,65 ± 0,113 ммоль/л (р < 0,001)) и в гомогенате зрелых плацент, полученных при родах в срок, до 1,46 ± 0,096 ммоль/л (в контрольной группе — 3,14 ± 0,091 ммоль/л (р < 0,001)).
Также был проанализирован процесс образования гестагена из холестерина, который идет при последовательном действии двух плацентарных ферментов — P450scc и 3р-гидрокси-стероиддегидрогеназы [10, 15]. Последний катализирует конечную стадию биосинтеза.
Мы оценили активность 3р-гидрокси-стероиддегидрогеназы в плаценте. В контрольной группе отмечалось возрастание интенсивности окраски синцитиотрофобласта и цитотрофобласта хориальных ворсин по мере прогрессирования беременности, свидетельствующее о росте активности стероидогенного фермента. При сроке беременности 5 — 6 недель гестации его содержание цитофотометрически составило 2,33 ± 0,067 усл. ед., 7 — 8 недель — 3,56 ± 0,113 усл. ед., при 9—10-недельной стадии развития — 4,90 ± 0,091 усл. ед.; в зрелой плаценте на 39 — 40-й неделе гестации — 7,23 ± 0,098 усл. ед.. В материале от женщин, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности, наблюдалось изменение гистохимической реакции. Были получены убедительные, подтвержденные цитофотометрической оценкой, свидетельства низкой интенсивности работы данного энзима как в ворсинчатых хорионах первого триместра развития, так и в зрелой плаценте. Цитофотометрически она была равной 1,08 ± 0,034 усл. ед. при 5 — 6-недельной стадии развития, 1,63 ± 0,098 усл. ед. при сроке 7 — 8 недель, 1,97 ± 0,078 усл. ед. при 9—10-недельной стадии и 4,68 ± 0,067 усл. ед. — в зрелой плаценте. По нашему мнению, снижение активности стероидогенеза в плаценте становилось причиной уменьшения количества прогестерона при осложненной герпесом беременности.
Следующим моментом, на котором мы остановили свое внимание, и который мог привести к низкому содержанию гестагена, было нарушение регуляторных процессов. Биосинтез стероидных гормонов в плаценте характеризуется отсутствием контроля со стороны тех веществ, которые осуществляли его у небеременной женщины. Следует также упомянуть об отсутствии иннервации в данном органе, благодаря чему все процессы находятся в ней под гормональным управлением. Установлено, что образование гестагена регулируется плацентарными белковыми гормонами, действующими через посредника — цАМФ [14, 15]. Ферментом, отвечающим за образование этого нуклеотида, является аденилатциклаза. Гистохимическая картина позволила прийти к выводу, что присутствие вирусной инфекции уменьшало интенсивность работы энзима в ворсинах зрелой
плаценты до 3,10 ± 0,25 усл. ед. (при титре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1 : 12800) (ци-тофотометрическая оценка в контрольной группе
— 6,59 ± 0,21 усл. ед.). Это становилось причиной низкого содержания в цитоплазме цАМФ, что, по нашему мнению, являлось фактором, влияющим на снижение процесса стероидогенеза. Кроме этого, данное нарушение могло иметь и другие негативные последствия, так как цАМФ выступает в качестве основного проводника взаимодействия структурно-функциональной системы живых клеток с внешней средой.
Что касается ингибирования в плаценте про-гестеронового образования, то данный вопрос еще находится на стадии накопления данных. Существует гипотеза о том, что синтез стероидных гормонов ингибируется оксидом азота [7]. Согласно ей, NO подавляет активность самого первого фермента в цепи стероидогенеза. Если придерживаться этой теории, то сопутствующим фактором, приведшим к снижению количества гестагена, являлась избыточная активность NO-синтазы, обнаруженная нами в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции [2].
ВЫВОДЫ
1. Обострение герпес-вирусной инфекции существенно снижает содержание гестагена в периферической крови беременной и плаценте при различных сроках гестации.
2. Выявленное изменение является закономерным результатом, во-первых, нарастающего недостатка базисного стероида — холестерина, а во-вторых, нарушения процесса синтеза стероидного гормона (низкой активностью фермента — 3р-гидроксистероиддегидрогеназы в плаценте).
ЛИТЕРАТУРА
1. Вареница А.Н., Герасимова А.А., Демкин В.В. Герпес-вирусная инфекция и беременность // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2006. — № 5. - С. 8-11.
2. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика активности НАДФН-диафоразы (маркера NO-синтазы), аденилат- и гуанилатциклаз в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — 2003. — Вып. 15. — С. 14—19.
3. Курманалиева З.Б. Патофизиологические основы невынашивания беременности у женщин на фоне герпетической инфекции : автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Бишкек, 2007. — 18 с.
4. Свирская Е.В. Гестагены при беременности // 9 месяцев — 2008. — № 3 [Электронный ресурс].
— Режим доступа : http://www.ginecolog.by/statya. php?st = 83 (дата обращения 21.04.09).
5. Тютюнник В.Л. Тактика ведения беременных при плацентарной недостаточности инфекционного генеза // Русский медицинский журнал.
— 2006. — Т. 14, № 18. — С. 1307—1311.
6. Challis J.R.G. et al. Endocrine and paracrine regulation of birth at term and preterm // Endocr. Rev. - 2000. - Vol. 21, N 5. - P. 514-550.
7. Drewett J.G. et al. Nitric oxide potently inhibits the rate-limiting enzymatic step in steroidogenesis // Mol. Cell Endocrinol. - 2002. - Vol. 194, N 1-2. - P. 39-50.
8. Goharkhay N. et al. Plasma progesterone, de-hydroepiandrosterone sulfate and estriol levels during labor induction with a sustained-release prostaglandin E2 vaginal insert // J. Matern. Fetal Med. - 2001. -Vol. 10, N 3. - P. 197-202.
9. Lockwood C.J., Krikun G., Schatz F. Decidual cell-expressed tissue factor maintains hemostasis in human endometrium // Ann. NY Acad. Sci. - 2001. -Vol. 943. - P. 77-88.
10. Payne A.H., Hales D.B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones // Endocr. Rev. - 2004. -Vol. 25, N 6. - P. 947-970.
11. Piccinni M.P. et al. Role of hormone-controlled Th1- and Th2-type cytokines in successful pregnancy // J. Neuroimmunol. - 2000. - Vol. 109. - P. 30-33.
12. Sheehan P.M. A possible role for progesterone metabolites in human parturition // Austral. N.-Z. J. Obstetr. Gynaecol. - 2006. - Vol. 46, N 2. -P. 159-163.
13. Strauss J.F., Martinez F., Kiriakidou M. Placental steroid hormone synthesis: unique features and unanswered questions // Biology of Reproduction. -1996. - Vol. 54. - P. 303-311.
14. Tremblay Y., Beaudoin C. Regulation of 3p-hydroxysteroid dehydrogenase and 17p-hydroxysteroid dehydrogenase messenger ribonucleic acid level by cyclic AMP and phorbol myristate acetate in human choriocarcinoma cells // Molecular. Endocrinology. - 1993. - Vol. 7. - P. 355-364.
15. Tuckey R.C. Progesterone synthesis by the human placenta // Placenta. - 2005. - Vol. 26, Is. 4. - P. 273-281.
Сведения об авторах
Довжикова Инна Викторовна - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН (675000, г Благовещенск, ул. Калинина, 22; тел.: 8 (4162) 33-12-27, 8 (914) 394-44-03; e-mail: megapolis_5000@ mail.ru, [email protected]).
