CC BY
70
УДК 615.92:616-093:616.345
ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА МАКРООРГАНИЗМ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
С.В. Пантелеев, О.Ю. Шроль, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.С. Нестеров, А.В. Нестерова
ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»
Проведены исследования микробиома толстой кишки мышей при воздействии солей тяжелых металлов (сульфата меди, сульфата цинка и ацетата свинца) с питьевой водой в течение 100 сут. Показано, что хроническая интоксикация экспериментальных животных приводит к количественным и структурным изменениям микробиома кишечника, проявляющимся в подавлении роста нормофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp.) на фоне повышения показателей частоты встречаемости и плотности колонизации представителей условно-патогенной (Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp.) и патогенной микробиоты (Staphylococcus aureus). Наиболее значительные дисбиотические сдвиги отмечены у животных, получавших с питьевой водой соли меди и цинка. Установлено статистически значимое увеличение количества бактерий, в генотипе которых содержались гены, экспрессирующие факторы патогенности.
Ключевые слова: микробиом кишечника, сульфат меди, сульфат цинка, ацетат свинца, дисбиоз, нуклеотидные последовательности генов.
Введение. Тяжелые металлы являются одними из приоритетных техногенных загрязнителей и обладают выраженным токсическим влиянием на человека. Известно их тератогенное, канцерогенное и мутагенное воздействие. Уровень концентрации, оказывающий токсическое воздействие на макроорганизм, зависит от вида металла и его биологической роли. Концентрация меди более 3 мг/л может стать причиной острого нарушения функции желудочно-кишечного тракта, вызывая тошноту, рвоту, диарею. Отравление свинцом проявляется признаками поражения центральной и периферической нервной системы, кишечника, почек. Установлено, что тяжелые металлы оказывают влияние не только на физиологическое, но и на психическое состояние человека [1, 2]. Показано, что часто они попадают в организм человека с питьевой водой [6, 8].
Токсигенный эффект, как правило, обнаруживается уже при незначительном уровне содержания солей тяжелых металлов в макроорганизме. Существует необходимость выявления токсического воздействия данных
веществ на ранних его стадиях. В связи с этим чрезвычайно интересным является использование в качестве маркера, чувствительного к малым дозам токсических веществ, микробиома кишечника, представляющего собой не только консорциум самих микробов определенного биотопа, но и совокупность всех микробных генов, оказывающих влияние на среду, в которой они существуют. Роль микробиома кишечника в поддержании гомеостаза организма трудно переоценить. Это подтверждают результаты многочисленных исследований в области биологии, биохимии, экологии, медицины и токсикологии [3, 4].
Цель исследования. Изучение возможности использования микробиома кишечника экспериментальных животных в качестве чувствительного маркера токсического воздействия солей цинка, свинца и меди при длительном их поступлении в тестируемый макроорганизм.
Материалы и методы. В работе использовали четыре группы белых беспородных мышей, которые в течение 100 сут получали
питьевую воду, содержащую соли тяжелых металлов в количествах, соответствующих 10 предельно допустимым концентрациям (ПДК) [7]. В каждую из групп входило по 20 животных: первая группа получала раствор сульфата меди пятиводного (10 мг/л), вторая - раствор сульфата цинка семиводно-го (50 мг/л), третья - раствор ацетата свинца (0,3 мг/л). Четвертую группу (контрольную) составляли интактные животные, не получавшие солей тяжелых металлов.
Через 20, 40, 60, 80, 100 сут от начала эксперимента у животных определяли наличие количественных и качественных дисбио-тических изменений микробиома кишечника [5]. Видовой состав исследовали с помощью коммерческих тест-систем фирмы Lachema (Чехия) и определителя бактерий Берджи.
Для нахождения уровня патогенности условно-патогенных представителей микро-биома кишечника определяли нуклеотидные последовательности генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности, с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (PCR Real
Первые дисбиотические сдвиги микро-биоты кишечника мышей первой и второй групп происходили уже на 20-е сут: по сравнению с контролем частота встречаемости указанных изменений повысилась в три и два раза соответственно. В третьей группе данный показатель не увеличивался. К концу эксперимента (100-е сут) дисбиотические изменения микробиома кишечника отмечались практически у всех животных опытных
time).
Результаты и обсуждение. Наблюдение за экспериментальными животными выявило у мышей всех опытных групп проявления воздействия на макроорганизм солей тяжелых металлов начиная с 30-40-х сут. У животных отмечалось уменьшение подвижности, вялость, замедление скорости реакции, выпадение волос, нарушение пищеварения. У мышей первой группы наблюдалось достоверное отставание в росте и массе тела по сравнению с группой контроля (p<0,05), образование множественных участков некроза кожи, изъязвление носовой перегородки, конъюнктивит, часто заканчивающийся слепотой. У 40 % мышей, подвергшихся действию сульфата цинка, зарегистрирован отек яичек и образование рубцов на коже в области ануса.
Результаты исследования дисбиотиче-ских изменений микрофлоры толстой кишки мышей, получавших тяжелые металлы с питьевой водой, показали, что частота встречаемости дисбиотических изменений микро-биома кишечника на протяжении всего эксперимента изменялась (табл. 1).
групп, при этом были наименее выражены в третьей группе, однако превышая контрольные значения более чем в 14 раз.
Изучение плотности колонизации представителей микробиома кишечника также выявило изменения данного показателя при воздействии солей тяжелых металлов на организм мышей, наиболее выраженные к 100-му дню эксперимента (табл. 2).
Таблица 1
Частота встречаемости дисбактериоза кишечника у экспериментальных животных, %
Группа животных 20-е сут 40-е сут 60-е сут 80-е сут 100-е сут
Первая (медь) 15,1±0,2* 30,3±2,1* 39,8±2,7* 69,7±3,2* 97,2±3,7*
Вторая(цинк) 10,1±1,4* 30,2±4,1* 41,7±3,6* 74,7±4,1* 96,4±4,1*
Третья (свинец) 5,2±0,2 14,9±0,8* 29,5±1,8* 49,2±3,7* 74,3±2,6*
Контрольная 5,0±0,1 5,3±0,2 5,1±0,1 5,3±0,2 5,0±0,3
Примечание. * - достоверность различия показателя по сравнению с группой контроля (р<0,05).
Таблица 2
Показатели плотности колонизации микробиоты кишечника мышей к 100-му дню эксперимента, KOE/г
Вид микроорганизмов Группа животных
первая вторая третья контроль
Bifidobacterium spp. 5,2±0,3* 6,8±0,6* 8,9±0,9 10,1±0,6
Lactobacillus spp. 4,5±0,3* 4,7±0,5 * 6,9±0,4* 8,9±0,7
Escherichia coli 7,9±0,6 8,2±0,3 8,1±0,3 8,9±0,2
Лактозонегативные 4,5±0,6* 3,8±0,9* 1,2±0,5 0,3±0,1
Гемолитические 3,2±0,3 2,8±0,3 0,9±0,1 -
Bacteroides spp. 6,5±0,1* 6,9±0,2* 7,9±0,8 9,6±0,4
Enterococcus spp. 8,8±0,4* 8,7±0,3* 6,3±0,7 6,1±0,2
Proteus spp. 3,5±0,4 2,7±0,4* 2,3±0,6* 0,8±0,1
Klebsiella spp. 3,4±0,1* 2,5±0,3* 1,7±0,3* 0,3±0,1
Staphylococcus aureus 3,3±0,2 2,5±0,3 1,4±0,1 -
S. epidermidis 1,5±0,3 1,6±0,1* 1,2±0,1 0,9±0,2
Candida spp. 3,6±0,5* 4,1±0,3* 3,7±0,3* 0,5±0,1
Примечание. * - достоверность различий показателя по сравнению с контролем (p<0,05).
Уровень обсемененности нормофлорой (Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp.) достоверно снижался (p<0,05). В первой и второй группах мышей, получавших с питьевой водой сульфат меди и сульфат цинка, к 100-м сут произошло снижение количества лактобакте-рий до lg 4,5±0,28 и lg 4,7±0,54 KOE/г соответственно (в контроле lg 8,30±0,37 KOE/г). Депрессия нормофлоры происходила на фоне расширения видового спектра патогенных (гемолитические и лактозонегативные Escherichia coli, Staphylococcus aureus) и условно-патогенных видов (Klebsiella spp, Proteus spp, Enterococcus spp ). Выявленные изменения у животных третьей группы были наименее выраженными.
При оценке изменений характера микро-биома большое значение имеет выявление генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности условно-патогенных видов, поскольку наличие таких генов обусловлива-
ет патогенный потенциал микроорганизмов. Определение нуклеотидных последовательностей генов при помощи PCR Real time выявило статистически значимое увеличение количества особей, в генотипе которых локализованы гены, экспрессирующие факторы патогенности.
Заключение. Таким образом, при воздействии на макроорганизм солей меди, цинка и свинца выявлены количественные и структурные изменения микробиома кишечника экспериментальных животных, проявляющиеся в подавлении роста нормофлоры на фоне повышения показателей частоты встречаемости и плотности колонизации представителей условно-патогенной и патогенной микробиоты. Наиболее значительные дисбиотические сдвиги отмечены у животных, получавших с питьевой водой соли меди и цинка.
Токсичные вещества, попадающие в же-
лудочно-кишечный тракт, в первую очередь нарушают равновесие в сообществе населяющих его микроорганизмов, именно они принимают на себя первый удар токсиканта. Проведенные исследования показали, что длительное поступление меди и цинка с питьевой водой в концентрации 10 ПДК приводит к подавлению нормофлоры и размножению условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в составе микробиома толстого кишечника белой мыши и, как следствие, к развитию дисбактериоза. Наиболее выраженные дисбиотические изменения выявлены у животных, получавших с питьевой водой ионы меди. У них наблюдался заметный дисбаланс в ассоциациях условно-патогенной микрофлоры, снижение уровня облигатной микробиоты (бифидобактерий и лактобактерий) и появление условно-патогенных и патогенных видов микроорганизмов, отсутствующих в контроле.
Проведенными исследованиями показано статистически значимое увеличение количества особей, в генотипе которых содержатся гены, экспрессирующие факторы патогенно-сти. Это свидетельствует о повышении патогенного потенциала кишечной микробиоты в результате хронического воздействия на макроорганизм солей тяжелых металлов.
1. Бингам Ф. Т. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Ф. Т. Бингам, М. Коста, Э. Эйхенберг ; пер. с англ. под ред. Х. Зигель, А. Зигель. - М. : Мир, 1993. - 368 с.
2. Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов 1-ГУ групп / под ред. В. А. Филова. - Л. : Химия, 1988. - 512 с.
3. Звягинцева Т. Д. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и перспективы лечения / Т. Д. Звягинцева, Е. И. Сергиенко // Экспериментальная клиническая гастроэнтерология. -2003. - № 3. - С. 70-74.
4. Новые подходы к диагностике кишечного дисбиоза у пациентов с псориатической болезнью / Н. Г. Гумаюнова [и др.] // Вестн. Российского ун-та дружбы народов. Сер. Медицина. - 2009. -№ 2. - С. 93-97.
5. ОСТ 91500.11.0004-2003. Дисбактериоз кишечника. Протокол ведения больных. - М. : Минздрав России, 2003. - С. 5-21.
6. Оценка качества водопроводной воды г. Димитровграда / О. В. Фокеева [и др.] // Вода. Химия и экология. - 2012. - № 11. - С. 99-101.
7. СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. - М. : Минздрав России, 2002. - С. 15-17.
8. Содержание тяжелых металлов в воде наблюдательных скважин полигона захоронения отходов / И. В. Турецкая [и др.] // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 7. - С. 75-76.
THE MODIFICATION OF THE INTESTINE MICROBIOME AFTER CHRONIC INFLUENCE OF HEAVY METAL COMPOUNDS
ON MACROORGANISM
S.V. Panteleev, O.J. Shrol, N.I. Potaturkina-Nesterova, A.S. Nesterov, A.V. Nesterova
Ulyanovsk State University
It has been studied mice colon's microbiome after effect of such heavy metals compounds as copper sulfate, zinc sulfate and lead acetate by drinking water for one hundred days. It was shown that chronic toxicity of experimental animals leaded to quantitative and structural changes in the microbiome of the intestine, which was manifested in the suppression of growth normoflora (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp.), while the frequency of occurrence and density of colonization of opportunistic bacteria (Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp.) and pathogenic microbiota (Staphylococcus aureus) were increased. The most significant of dysbiotic changes have been observed in animals which got compounds of copper and zinc with drinking water. It has been found significant increase in quantity of bacteria which contained in the genotype genes of expression pathogenicity factors.
Keywords: intestine microbiome, copper sulfate, zinc sulfate, lead acetate, dysbiosis, density colonization, the nucleotide sequences of the genes.
