ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАГЕНОМНОГО СОСТАВА РУБЦА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

Нуржанов Баер Серекпаевич; Дускаев Галимжан Калиханович; Кван Ольга Вилориевна; Ажмулдинов Елемес Ажмулдинович

УДК 636.085.25:633.88 DOI: 10.33284/2658-3135-104-3-167

Изменение метагеномного состава рубца при воздействии экстрактов лекарственных растений

Б. С. Нуржанов, Г.К. Дускаев, О.В. Кван, Е.А. Ажмулдинов

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук (г. Оренбург)

Резюме. Ограничения на законодательном уровне использования кормовых антибиотиков привели к поиску новых кормовых средств природного происхождения со схожими свойствами. Из большого разнообразия кормовых добавок выделяются фитобиотики, обладающие иммуно- и росто-стимулирующими, а также антиоксидантными свойствами. Согласно схеме исследования особям контрольной группы скармливали основной рацион (ОР), I опытной - ОР+экстракты коры дуба (ЭКД) 33,3 %+листья березы (ЭЛБ) 33,3 %+трава зверобоя (ЭТЗ) 33,3 %, II опытной -ОР+экстракты коры дуба 50 %+листья березы 50 %, III опытной - ОР+экстракты коры дуба 50 %+трава зверобоя 50 %. Экстракты вводили в индивидуальные поилки из расчёта 1,66 мл/кг массы тела. Геномная ДНК была выделена из контрольных и опытных образцов с использованием метода химической экстракции. При подсчёте полученного материала in situ было выявлено, что распадаемость сухого вещества зерносмеси при введении экстрактов коры дуба 33,3 %+листьев березы 33,3 %+травы зверобоя 33,3 % была выше по сравнению с II и III группами на 11,98 и 13,52 %. Наименьшей переваримостью сухого вещества зерносмеси отмечалась группа, получавшая экстракт коры дуба 50 % и экстракт травы зверобоя 50 %, этот показатель был ниже на 1,54 % в сравнении со II группой. Применение экстрактов коры дуба 33,3 %+листьев березы 33,3 %+травы зверобоя 33,3 % способствовало увеличению количества бактерий, относящихся к филуму Firmicutes на 5,65 и 6,24 % от II и III групп. Введение экстрактов коры дуба и листьев березы оказало положительное влияние на повышение количества микроорганизмов, относящихся к семействам Muribaculaceae (на 2,49 и 1,14 %), Prevotellaceae (на 9,06 и 8,07 %) и Candidatus Saccharibacteria (на 0,06 и 0,34 %) в сравнении с I и III группами.

Ключевые слова: бычки, рубец, кормление, переваримость, экстракты, метагеном, бактерии. UDK 636.085.25:633.88

Changes in metagenomic composition of rumen under the influence of herbal extracts

Baer S Nurzhanov, Galimzhan K Duskaev, Olga V Kwan, Elemes A Azhmuldinov

FederalResearch Centre of Biological Systems andAgrotechnologies of the Russian Academy ofSciences (Orenburg, Russia)

Abstract. Legislative restrictions on the use of feed antibiotics have led to the search for new feed products of natural origin with similar properties. Phytobiotics stand out from a wide variety of feed additives. They have immuno- and growth-stimulating, as well as antioxidant properties. According to the study scheme, animals in the control group received BD, experimental I - BD + Oak bark extracts (OBE) 33.3% + birch leaves (BL) 33.3% + St. John's wort (ETZ) 33.3%, experimental II - BD + Oak bark extracts 50% + birch leaves 50%, III experimental - BD + Extracts of oak bark 50% + St. John's wort 50%. The extracts were administered with individual drinkers at the rate of 1.66 ml/kg body weight. Genomic DNA was isolated from control and experimental samples using the chemical extraction method. According to the results of in situ studies, it was found that the digestibility of the dry matter of the grain mixture with the introduction of extracts of oak bark 33.3% + birch leaves 33.3% + St. John's wort herb 33.3% was higher compared to groups II and III by 11.98 and 13.52%. The group that received 50% oak bark extract and 50% St. John's wort extract was found to have the least digestibility of dry matter of the grain mixture; this indicator was 1.54% lower in comparison with group II. The use of oak bark extract 33.3% + birch leaves 33.3% + St. John's wort 33.3% contributed to an increase in the number of bacteria

belonging to the phylum Firmicutes by 5.65 and 6.24% from groups II and III. The introduction of extracts of oak bark and birch leaves promoted better development of bacteria of the families Muribaculaceae (by 2.49 and 1.14%), Prevotellaceae (by 9.06 and 8.07%), and Candidatus Saccharibacteria (by 0.06 and 0.34%) in comparison with groups I and III. Keywords: bulls, rumen, digestibility, extracts, metagenome, bacteria.

Введение.

Известно, что бактериальная масса в рубце жвачных составляет около 10 % сухого вещества содержимого рубца. В 1 мл рубцовой жидкости содержится около 1011 бактерий, 103 -107 грибов, 109 архей и 106 простейших. Бактериальное сообщество рубца представлено амилолитическими (Bacteriodes ruminicola, Streptococcus bovis, Succinomonas amylolítica, Ruminobacter amylophilus, Selenomonas ruminantium, в основном стрептококки), липолитическими (Anaerovibrio lipolytica, продукты - ацетат, пропионат), целлюлозолитическими (Lachnospira multiparus, Fibrobacter succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococci albus, Clostridium lochheadii) и молочнокислыми бактериями (расщепляют крахмал и сахар до молочной кислоты). К бактериям относятся клостридии, селемонады, бактероиды, уреолитические бактерии (Колоскова Е.М. и др., 2020).

Установленный в последнее время приоритет в выращивании животных - это введение в типовые рационы кормовых препаратов на природной основе, так как применение определённых подкормок, в частности антибиотиков, ограничивается на законодательном уровне по причине развития устойчивости бактерий (Huyghebaert G et al., 2011). Это создало предпосылки к поиску безопасных кормовых веществ, способные заменить вредные и дорогие аналоги в скотоводстве.

В настоящее время пробиотики, пребиотики, травы, минеральные и растительные вещества считаются хорошими заменителями кормовых антибиотиков (Sasidharan S et al., 2011). Отдельные виды водных растворов из лекарственных растений содержат в своем составе активные компоненты обладающие иммуно- и ростостимулирующими, а так же антиоксидантными свойствами (Newman D and Gordon MC, 2014). Все они объединяются под общим названием — фитобиотики, и часто применяются в качестве кормовых добавок для жвачных с целью укрепления здоровья животного (Abreu AC et al., 2012; Valenzuela-Grijalva NV et al., 2017; Muhammed A Arowolo and Jianhua He, 2018). Все возможные вытяжки из лекарственных растений используются из века в век для предотвращения болезней и их лечения в связи с их распространённостью, дешевизной и минимальными негативными последствиями. Самым апробированным из растений остается Quercus robur. Экспериментально было доказано, что его раствор обладает антибактериальной, антиоксидантной, противогрибковой и противоопухолевой способностью (Tolmacheva AA et al., 2014). Кроме того, выступая в качестве ингибитора системы чувствительности кворума (QS) у бактерий, влияет на реорганизацию бактериальной флоры желудочно-кишечного тракта и, как следствие, на продуктивность сельскохозяйственных животных (Duskaev GK et al., 2018; Logachev K et al., 2015; Karimov I et al., 2020).

Цель исследования.

Изучить влияние экстрактов на переваримость сухого вещества корма и метагеномный статус рубца бычков молочной породы.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Рубцовая жидкость молодняка крупного рогатого скота; бычки красной степной породы в возрасте 12 мес. и живой массой 300 кг.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями российских нормативных актов (1987 г.; Приказ Минздрава СССР No 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных») и «Guide for the Care and Use

of Laboratory Animals» (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов.

Схема эксперимента. Место проведения исследования - физиологический двор Покровского сельскохозяйственного колледжа-филиал ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет» и ЦКП БСТ РАН (https://ckp-rf.ru/ckp/77384). Для приготовления водного экстракта помещали соответствующий компонент лекарственного растения в кастрюлю, заливали её водой (из расчёта: компонент лекарственного растения - 20 г, вода - 0,5 л) и помещали ёмкость на плиту. Кипятили средство в течение 10 минут, после этого настаивали его ещё полчаса и процеживали.

Основной рацион (ОР) включал в себя сено суданковое 2-го укоса, сено люцерновое, концентраты. Животные контрольной группы получали ОР, I опытной - ОР+экстракты коры дуба (ЭКД) 33,3 %+листья березы (ЭЛБ) 33,3 %+трава зверобоя (ЭТЗ) 33,3 %, II опытной - ОР+экстракты коры дуба 50 %+листья березы 50 %, Ш опытной - ОР+экстракты коры дуба 50 %+трава зверобоя 50 %. Экстракты вводили в индивидуальные поилки из расчёта 1,66 мл/кг массы тела.

Отбор рубцовой жидкости проводился через хроническую фистулу рубца. Переваримость сухого вещества концентратов in situ определяли по разности массы образца корма вместе с мешочком и после двухстадийной инкубации и высушивания до постоянной массы при температуре +60 °С по следующей формуле:

К=100 (А-В) / С,

где К - коэффициент переваримости сухого вещества корма (%);

А - исходная масса образца корма вместе с мешочком (г);

В - масса образца корма вместе с мешочком после переваривания (г);

С - исходная масса образца корма без массы мешочка (г).

Отбор проб для исследования микробиома рубца проводили по традиционной методике, с использованием стерильного оборудования, с последующем размещением проб в стерильные микропробирки типа «эппендорф», в последующем замораживая их при -70 °C в криоморозильнике и хранили, не допуская повторного размораживания.

Геномная ДНК была выделена из контрольных и опытных образцов (n=12) с использованием метода химической экстракции. Чистоту ДНК проверяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле. Концентрацию ДНК определяли количественно с использованием флюорометра Qubit 2.0 с анализом высокой чувствительности dsDNA (Life Technologies).

Оборудование и технические средства. Стерильные микропробирки типа «эппендорф» (Nuova Aptaca S.R.L., Италия), криоморозильник ULUF65 («ARCTlCO», Дания).

Подготовка библиотек ДНК, а также секвенирование проводилось на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием реагентов MiSeq v3c2 x 300 пар оснований в Центре коллективного пользования «Персистентность микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Оренбург, Россия).

Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 10.0» («Stat Soft Inc.», США), рассчитывая среднюю величину (М), среднеквадратичное отклонение (о), ошибку стандартного отклонения (m). Уровень значимости считали достоверным при Р<0,05.

Результаты исследований.

При подсчёте полученного материала in situ (рис. 1) было выявлено, что распадаемость сухого вещества концентрированных кормов при одновременном поступлении водных растворов ЭКД 33,3 %+ЭЛБ 33,3 %+ЭТЗ 33,3 % была выше по сравнению с II и III группами на 11,98 и 13,52 %. Наименьшей переваримостью сухого вещества зерносмеси отмечалась группа, получавшая экстракт коры дуба 50 % и экстракт травы зверобоя 50 %, этот показатель был ниже на 1,54 % в сравнении со II группой.

170

Рис. 1 - Биодоступность сухого вещества концентрированного корма in situ, % Figure 1 - Bioavailability of dry matter of concentrated feed in situ, %

Экспериментальные данные метагеномного анализа рубцовой жидкости бычков, получавших с основным рационом различные виды растительных экстрактов в разных пропорциях, свидетельствуют о количественных и качественных изменениях в составе

Figure 2 - Changes in the microbiome of ruminai fluid in group I

Наиболее выраженным в количественном отношении от общего числа классифицированных бактерий являлся таксон Bacteria 99,86-99,94 %.

У животных, получавших экстракты ЭКД 33,3 %+ЭЛБ 33,3 %+ЭТЗ 33,3 % в пробе преобладали следующие филумы: Bacteroidetes - 54,39 %, Firmicutes - 40,87 %, Proteobacteria - 1,1 % от общего количества. Применение этих экстрактов способствовало увеличению количества бактерий, относящихся к филуму Firmicutes на 5,65 и 6,24 % от II и III групп.

Микробиом рубцового содержимого особей I группы включал в себя 10 выявленных классов, главные из которых: Bаcteroidia - 48,01 %, Chstridia - 34,89 %, Negativicutes - 5,76 %, Sphingobacteriia - 1,82 %. При этом количество бактерий из класса Negativicutes уменьшилось на 0,72 и 5,13 % в сравнении с II и III группами.

Введение животным I группы ЭКД 33,3 %+ЭЛБ 33,3 %+ЭТЗ 33,3 % спровоцировало максимальный рост числа микроорганизмов семейства Lachnospiraceae (на 1,13 и 4,80 %) и Ruminococcaceae (на 4,5 и 6,85 %) в сравнении с II и III группами.

Введение экстракта коры дуба 50 %+листья березы 50 % животным II группы способствовало увеличению числа бактерий филума Bacteroidetes (на 6,15 %) и уменьшению Firmicutes (на 5,65 %) в сравнении с бычками, получавшими экстракты ЭКД 33,3 %+ЭЛБ 33,3 %+ЭТЗ 33,3 % (рис. 3).

Figure 3 - Changes in the microbiome of ruminal fluid in group II

Колебание бактерий в пределах филума Bacteroidetes y бычков II группы шло в основном за счет увеличения количества микроорганизмов входящих в класс Bacteroidia, unclassifiedBacteroidetes и Candidatus Saccharibacteria.

Введение ЭКД и ЭЛБ позволило большему росту представителей семейства Muribaculaceae (на 2,49 и 1,14 %), Prevotellaceae (на 9,06 и 8,07 %) и Candidatus Saccharibacteria (на 0,06 и 0,34 %) в сравнении с I и III группами.

Введение экстракта коры дуба 50 %+трава зверобоя 50 % способствовало лучшему развитию бактерий филума Bacteroidetes (на 7,73 и 1,58 %) и уменьшению числа бактерий филума

Figure 4 - Changes in the microbiome of ruminal fluid in group III

Это отразилось на изменении доли в микробиоценозе микроорганизмов классов Bacteroidia, Clostridia и Negativicutes. При этом из всех сравниваемых групп наибольшое количество бактерий класса Negativicutes наблюдались y бычков из III группы, что на 5,13 и 4,41 % больше, чем y аналогов из I и II групп.

При введении бычкам ЭКД 50 %+ЭТЗ 50 % наблюдалось уменьшение числа бактерий семейства Lachnospiraceae (на 4,8 и 3,67 %) и Ruminococcaceae (на 6,85 и 2,35 %) относительно I и II групп. Распределение бактерий по видам происходило в следующей последовательности: Duncaniella - 3,21 % от всех обнаруженных бактерий, Prevotella - 5,0 % от всех обнаруженных бактерий, неопределённые unclassified_Bacteroidales - 30,13 % от всех обнаруженных бактерий, unclassifiedLachnospiraceae -3,61 % от всех обнаруженных бактерий, Sporobacter - 3,80 % от всех обнаруженных бактерий, unclassifiedRuminococcaceae - 7,9 % от всех обнаруженных бактерий, Succiniclasticum - 9,12 % от всех обнаруженных бактерий. Остальные виды бактерий были представлены менее 3 %.

Обсуждение полученных результатов.

Анализ литературных источников указывает, что вещества, обнаруженные в растениях, например, изофлавон, присутствующий в луговом клевере (Trifloium pratense L), изменяет ферментацию в преджелудке жвачных. Биоханин А подавляет бактерии, продуцирующие аммиак, и способствует развитию целлюлолитических бактерий (Harlow BE et al., 2020). Аналогичные эффекты наблюдались и в нашем эксперименте.

Вероятным механизмом действия в данном случае может быть различие в составе экстрактов растений. В частности известно, что составные части листьев Leucaena leucocephala состоят из десятков веществ (флавоноидов), при этом 4 флавоноида проявляли сильную противовоспалительную активность, 7 показали более сильную антиоксидантную активность, а некоторые подвергались дегликозилированию до агликона кверцетина при анаэробной инкубации с бактериями преджелудка жвачных (Xu Y et al., 2018). Кроме того, известно (Oh S et al., 2017), что включение экстрактов растений в качестве кормовой добавки (Ginkgo extract) способны изменить уровни общих бактерий (Ruminococcus и Fibrobacter) в сторону уменьшения, либо увеличения их численного состава (Selenomonas, Anaerovibrio, Ruminobacter, Succinivibrio и Megasphaera elsdenii) или изменить типы бактреий (Kasparovska J et al., 2016).

В конечном итоге некоторые экстракты способны положительно повлиять на переваримость сухого вещества рациона (Li D et al., 2016), что согласуется с результатами наших экспериментов.

Выводы.

Таким образом, установлено положительное влияние смеси из трёх экстрактов на микробиом рубца жвачных, что оказало положительное влияние на распадаемость сухого вещества концентрированных кормов.

Исследования выполнены в соответствии с планом НИР за 2021-2023 гг. ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН (№ 0761-2019-0005)

Литература

1. Исследование микробиома рубца у овец с использованием молекулярно-генетических методов (обзор) / Е.М. Колоскова, К.С. Остренко, В.А. Езерский, А.Н. Овчарова, Н.В. Белова // Проблемы биологии продуктивных животных. 2020. № 4. С. 5-26. [Koloskova EM, Ezerskiy VA, Ostrenko KS, Ovcharova AN, Belova NV. Studies of the sheep rumen microbiome using molecular genetic methods: a review. Problemy biologii produktivnykh zhivotnykh. 2020;4:5-26. (In Russ)]. doi: 10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2020.4.5-26

2. Abreu AC, McBain AJ, Simoes M. Plants as sources of new antimicrobials and resistance-modifying agents. Nat Prod Rep. 2012;29(9):1007-1021. doi: 10.1039/c2np20035j

3. Duskaev GK, Kazachkova NM, Ushakov AS, Nurzhanov BS, Rysaev AF. The effect of purified Quercus cortex extract on biochemical parameters of organism and productivity of healthy broiler chickens. Vet World. 2018;11(2):235-239. doi: 10.14202/vetworld.2018.235-239

4. Harlow BE, Flythe MD, Kagan IA, Goodman JP, Klotz JL, Aiken GE. Isoflavone supplementation, via red clover hay, alters the rumen microbial community and promotes weight gain of steers grazing mixed grass pastures. PLoS One. 2020;15(3):e0229200. doi: 10.1371/journal.pone.0229200

5. Huyghebaert G, Ducatelle R, Van Immerseel F. An update on alternatives to antimicrobial growth promoters for broilers. Veterinary Journal. 2011;187(2):182-188. doi: 10.1016/j.tvjl.2010.03.003

6. Karimov I, Kondrashova K, Duskaev G, Kvan O. Evaluation of effects of rumen fluid in combination with probiotic preparations and vanillin on the luminescence of a recombinant strain E. coli. In: Zhou P, He Y, Weerasinghe R, editors. E3S Web of Conferences: 2nd International Symposium on Architecture Research Frontiers and Ecological Environment (ARFEE 2019); 2019 December 20-22; Guilin, China. Les Ulis, France: EDP Science; 2020; 143:02034. doi: https://doi.org/10.1051/e3sconf/202014302034

7. Kasparovska J, Pecinkova M, Dadakova K, Krizova L, Hadrova S, Lexa M, Lochman J, Kaspa-rovsky T. Effects of isoflavone-enriched feed on the rumen microbiota in dairy cows. PLoS One. 2016;:11(4):e0154642. doi: 10.1371/journal.pone.0154642

8. Li D, Zhang Y, Cui Z, He L, Chen W, Meng Q, Ren L. Effects of phytoecdysteroids (PEDS) extracted from cyanotis arachnoidea on rumen fermentation, enzyme activity and microbial efficiency in a continuous-culture system. PLoS One. 2016;11(4):e0153584. doi: 10.1371/journal.pone.0153584

9. Logachev K, Karimov I, Duskaev G, Frolov A, Tulebaev S, Zav'yalov O. Study of intercellular interaction of ruminal microorganisms of beef cattle. Asian Journal of Animal Sciences. 2015;9(5):248-253.

10. Muhammed A Arowolo, Jianhua He. Use of probiotics and botanical extracts to improve ruminant production in the tropics: A review. Anim Nutr. 2018;4(3):241 -249. doi: https://doi.org/10.1016/j.aninu.2018.04.010

11. Newman DJ, Gordon MC. Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014. J Nat Prod. 2016;79(3):629-661. doi: 10.1021/acs.jnatprod.5b01055

12. Oh S, Koike S, Kobayashi Y. Effect of ginkgo extract supplementation on in vitro rumen fermentation and bacterial profiles under different dietary conditions. Anim Sci. J. 2017;88(11):1737-1743. doi: 10.1111/asj.12877

13. Sasidharan S, Chen Y, Saravanan D, Sundram KM, Yoga Latha L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 2011;8(1): 1-10.

14. Tolmacheva AA, Rogozhin EA, Deryabin DG. Antibacterial and quorum sensing regulatory activities of some traditional Eastern-European medicinal plants. Acta Pharmaceutica. 2014;64(2):173-186. doi: 10.2478/acph-2014-0019

15. Valenzuela-Grijalva NV, Pinelli-Saavedra A, Muhlia-Almazan A, Domínguez-Díaz D, González-Ríos H. Dietary inclusion effects of phytochemicals as growth promoters in animal production. J Anim Sci Technol. 2017;59:8. doi: 10.1186/s40781-017-0133-9

16. Xu Y, Tao Z, Jin Y, Yuan Y, Dong TTX, Tsim KWK, Zhou Z. Flavonoids, a potential new insight of leucaena leucocephala foliage in ruminant health. J Agric Food Chem. 2018;66(29):7616-7626 doi: 10.1021/acs.jafc.8b02739

References

1. Koloskova EM, Ezerskiy VA, Ostrenko KS, Ovcharova AN, Belova NV. Studies of the sheep rumen microbiome using molecular genetic methods: a review. Problems of the Biology of Productive Animals. 2020;4:5-26. doi: 10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2020.4.5-26

2. Abreu AC, McBain AJ, Simoes M. Plants as sources of new antimicrobials and resistance-modifying agents. Nat Prod Rep. 2012;29(9):1007-1021. doi: 10.1039/c2np20035j

3. Duskaev GK, Kazachkova NM, Ushakov AS, Nurzhanov BS, Rysaev AF. The effect of purified Quercus cortex extract on biochemical parameters of organism and productivity of healthy broiler chickens. Vet World. 2018;11(2):235-239. doi: 10.14202/vetworld.2018.235-239

4. Harlow BE, Flythe MD, Kagan IA, Goodman JP, Klotz JL, Aiken GE. Isoflavone supplementation, via red clover hay, alters the rumen microbial community and promotes weight gain of steers grazing mixed grass pastures. PLoS One. 2020;15(3):e0229200. doi: 10.1371/journal.pone.0229200

5. Huyghebaert G, Ducatelle R, Van Immerseel F. An update on alternatives to antimicrobial growth promoters for broilers. Veterinary Journal. 2011;187(2):182-188. doi: 10.1016/j.tvjl.2010.03.003

6. Karimov I, Kondrashova K, Duskaev G, Kvan O. Evaluation of effects of rumen fluid in combination with probiotic preparations and vanillin on the luminescence of a recombinant strain E. coli. In: Zhou P, He Y, Weerasinghe R, editors. E3S Web of Conferences: 2nd International Symposium on Architecture Research Frontiers and Ecological Environment (ARFEE 2019); 2019 December 20-22; Guilin, China. Les Ulis, France: EDP Science; 2020; 143:02034. doi: https://doi.org/10.1051/e3sconf/202014302034

7. Kasparovska J, Pecinkova M, Dadakova K, Krizova L, Hadrova S, Lexa M, Lochman J, Kaspa-rovsky T. Effects of isoflavone-enriched feed on the rumen microbiota in dairy cows. PLoS One. 2016;:11(4):e0154642. doi: 10.1371/journal.pone.0154642

8. Li D, Zhang Y, Cui Z, He L, Chen W, Meng Q, Ren L. Effects of phytoecdysteroids (PEDS) extracted from cyanotis arachnoidea on rumen fermentation, enzyme activity and microbial efficiency in a continuous-culture system. PLoS One. 2016;11(4): e0153584. doi: 10.1371/journal.pone.0153584