CC BY
0УДК 615.828+611.018.21 © И. А. Аптекарь, Е. Г. Костоломова,
https://doi.org/10.32885/2220-0975-2019-1-2-72-84 Ю. Г. Суховей, 2019
Изменение функциональной активности фибробластов в процессе моделирования компрессии, гиперкапнии и гипоксии
И. А. Аптекарь1, Е. Г. Костоломова2, Ю. Г. Суховей3
1 Тюменский институт мануальной медицины. 625048, Россия, Тюмень, ул. Попова, д. 7-А
2 Тюменский государственный медицинский университет. 625023, Россия, Тюмень, ул. Одесская, д. 54
3 Тюменский филиал Института клинической иммунологии. 625027, Россия, Тюмень, ул. Котовского, д. 5/2
Введение. В генезе формирования соматической дисфункции ведущую роль отводят реакциям со стороны организма в целом и соединительной ткани в частности. Основными клетками соединительной ткани являются фибробласты, обладающие в полной мере основными свойствами клеток организма. Цель исследования — изучение изменения функциональной активности фибробластов в процессе моделирования компрессии, гиперкапнии и гипоксии.
Материалы и методы. В условиях эксперимента in vitro проводили моделирование компрессии, гиперкапнии и гипоксии в культуре фибробластов человека.
Результаты. В ответ на моделируемые изменения условий окружающей среды фибробласты изменяют локальную среду обитания (межклеточное вещество) за счет изменения соотношения эластина и коллагена и адаптируются морфологически (меняя форму). Компрессия и гиперкапния оказывают наиболее повреждающее действие на основные клетки соединительной ткани.
Заключение. Установление зависимости реакции фибробластов на повреждающие воздействия может быть обоснованием последовательности методов устранения нарушений соединительной ткани в процессе остеопатической коррекции (декомпрессия, устранения отёка и гипоксии).
Ключевые слова: фибробласты, адаптационные реакции, соматическая дисфункция, соединительная ткань, остеопатическая коррекция
UDC 615.828+611.018.21 © A. I. Aptekar, E.G. Kostolomova,
https://doi.org/10.32885/2220-0975-2019-1-2-72-84 Y. G. Sukhovey, 2019
^ange in the functional activity of fibroblasts in the process of modelling of compression, hypercapnia and hypoxia
A. I. Aptekar1, E. G. Kostolomova2, Y. G. Sukhovey3
Для корреспонденции:
Игорь Александрович Аптекарь, канд. мед. наук, врач-остеопат, директор Тюменского института мануальной медицины
Адрес: 625048, Россия, Тюмень, ул. Попова, д. 7-ф E-mail: aptekar72@mail.ru
For correspondence: Igor A. Aptekar, M. D., D. O., Ph. D. (Med), osteopathyc physician, director of Tyumen Institute of Manual Medicine
Address: 7-f ul. Popova, Tyumen, Russia 625048 E-mail: aptekar72@mail.ru
Для цитирования: Аптекарь И. А., Костоломова Е. Г., Суховей Ю.Г. Изменение функциональной активности фибробластов в процессе моделирования компрессии, гиперкапнии и гипоксии. Российский остеопатический журнал 2019; 1-2 (44-45): 72-84.
For citation: Aptekar A. I., Kostolomov E. G., Sukhovey Y. G. Change in the functional activity of fibroblasts in the process of modeling of compression, hypercapnia and hypoxia. Russian Osteopathic Journal 2019; 1-2 (44-45): 72-84.
1 Tyumen Institute of Manual Medicine. 7-А ul. Popova, Tyumen, Russia 625048
2 Tyumen State Medical University. 54 ul. Odesskaya, Tyumen, Russia 625023
3 Tyumen Branch of the Institute of Clinical Immunology. 5/2 ul. Kotovskogo, Tyumen, Russia 625027
Introduction. In the genesis of the formation of somatic dysfunction, the leading role belongs to the reactions of the organism in the whole and of the connective tissue in particular. The main connective tissue cells are fibroblasts, possessing the full basic properties of cells.
Goal of research — to examine changes in the functional activity of fibroblasts in the process of modelling of compression, hypercapnia and hypoxia.
Materials and methods. During the experiment (in vitro), simulation of compression, hypercapnia and hypoxia in human fibroblast culture was carried out.
Results. In response to simulated changes in environmental conditions, fibroblasts changed their local habitat (intercellular substance) by changing the balance of elastin and collagen, and adapted morphologically (by changing their shape). Compression and hypercapnia had the most damaging effect on the main cells of the connective tissue
Conclusion. Determination of the dependence of the reaction of fibroblasts on damaging effects can form the basis for justifying the sequence of the use of methods aimed to eliminate connective tissue disorders in the process of osteopathic correction (decompression, reduction of edema and hypoxia). Key words: fibroblasts, adaptive reactions, somatic dysfunction, connective tissue, osteopathic correction
Введение
Среди этиологических факторов соматической дисфункции наиболее значимы различные виды травматических воздействий с патогенетическим механизмом, приводящим к компрессии, гипоксии и избытку СО2. Адаптация к воздействию травматических факторов выражается целостным ответом организма, в том числе адаптационными изменениями, инициированными основными клетками соединительной ткани — фибробластами.
В настоящее время в отношении фибробластов накоплен большой опыт во многих медико-биологических исследованиях, что обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань, главным элементом которой являются фибробласты, составляет весьма значительную часть массы тела. Кроме того, фибробласты, составляя строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимые для дифференцировки и функционирования специализированных клеток [1]. Важно отметить, что фибробласты представляют in vitro не только самих себя и соединительную ткань, но и клеточные системы иной специализации, в частности нервные клетки [2].
Благодаря культивированию возможности исследования и диагностики расширяются практически беспредельно, что позволяет оценивать не только морфологические и биохимические изменения, но и таковые поведения клеток, их реакцию на различные агенты, в том числе и лекарственные воздействия.
При рассмотрении вопроса о возможности и пределах экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo было показано, что:
•фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные этим клеткам в организме; более того, они сохраняют онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организма-донора;
• не существует другого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма;
• изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму путем создания соответствующих условий.
Поэтому представляет несомненный интерес исследование функциональной активности фи-бробластов при моделировании in vitro компрессии, гиперкапнии и гипоксии.
В качестве гипотезы рассматривали утверждение, что локальные адаптационные реакции соединительной ткани формируются за счет изменения состояния фибробластов и их приспособления к изменяющимся условиям окружающей среды, и качественное изменение характеристик соединительной ткани является, в первую очередь, следствием адаптации фибробластов.
Цель исследования — изучение изменения функциональной активности фибробластов в процессе моделирования компрессии, гиперкапнии и гипоксии.
Материалы и методы
Исследование проводили на базе Тюменского филиала Института клинической иммунологии в период с июня по октябрь 2018 г. В процессе исследования использовали следующее оборудование: проточный цитофлюориметр «CytoFLEX» («Beckman Coulter», США), С02-инкубатор («Sanyo», Япония), герметичная камера («StemCell Technologies», США), мультигазовый инкубатор 5 % 02 («Sanyo», Япония), инвертированный микроскоп «CKX-41» («Olympus», Япония).
Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи путем механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Стандартное культивирование проводили при 37 °С в атмосфере 5 % С02 с использованием С02-инкубатора. Для создания пониженного содержания кислорода в среде использовали мультигазовый инкубатор (5 % 02) и герметичную камеру, модифицированную датчиками давления и концентрации 02, которую продували газовой смесью (95 % N2, 5 % С02) до установления 0 % концентрации кислорода.
В работе использовали клетки 4-6-го пассажа. Каждый эксперимент воспроизводили 15 раз с дублированием аналитических измерений. Прижизненную визуализацию фибробластов и визуализацию фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе их препаратов проводили с помощью инвертированного микроскопа «CKX-41». Жизнеспособность клеток после каждого пассажа оценивали микроскопированием по окрашиванию их трипановым синим.
Контролировали процессы апоптоза и некроза, оценивая количество апоптозных и некротических клеток методом проточной цитофлюориметрии «CytoFLEX» с помощью набора «Annexin V-APC» («Becman Coulter», США) согласно инструкции производителя.
Иммунофенотипирование культивируемых фибробластов проводили на проточном цито-флюориметре «CytoFLEX» с помощью моноклональных антител к CD29, CD44, CD90, CD105, специфичных для мезенхимальных стволовых клеток, и CD34, CD45 — маркеров гемопоэти-ческих клеток [2, 3]. Пролиферативную активность изучали по времени удвоения популяции клеток и состоянию их клеточного цикла [4].
Способность фибробластов к продукции эластина, коллагена 1-го типа (COL1) и растворимого CD44var (v6) определяли в супернатанте после каждого пассажа методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем («ELISA», США) по методике производителя. В процессе подготовки фибробластов к условиям эксперимента обращали внимание на тот факт, что скорость роста и свойства фибробластов в культуре зависят от следующих факторов: число пассажей, способ культивирования, тип используемых сред и сывороток, возраст донора, область проведения биопсии [5].
Для определения пролиферативного потенциала клеточной культуры используют понятие эффективности клонирования, которая представляет долю клеток, способных образовывать колонии из 16 клеток и более в течение 18 сут. Эффективность клонирования в значительной степени зависит от таких факторов, как условия культивирования, число пассажей, тип используемой сыворотки. При одинаковых условиях она является очень точной и воспроизводимой характеристикой штамма клеток [6].
Для фибробластов эффективность клонирования в процессе культивирования плавно нарастает, достигая максимума на 5-м пассаже, затем образуется плато и следует спад. Такие изменения связаны с кинетикой роста фибробластов: к 5-му пассажу постепенно увеличивается доля
активно делящихся клеток в силу их селективного преимущества, затем наблюдают постепенное истощение их пролиферативного потенциала.
Полученная клеточная популяция в процессе эксперимента была гетерогенна, так как выделенные фибробласты находятся на разных стадиях развития (небольшие веретеновидные активно делящиеся клетки-предшественники; более крупные веретеновидные созревающие клетки; крупные плащевидные зрелые фиброциты). Также установлено, что основной пул клеток находится в GO-фазе, 9,5-19 % культуры постоянно делится, что соответствует характеристике дифференцированных фибробластов. Индекс ДНК в среднем составил 1,96, что характеризует нормально развивающуюся культуру. Субпопуляционный состав культуры фибробластов характеризуется экспрессией мезенхимных (CD29, CD44, CD90, CD105) и отсутствием эпителиальных, гемопоэти-ческих и лейкоцитарных маркеров (CD31, CD34, CD45, HLA-DR), рис. 1.
Рис. 1. Экспрессия поверхностных маркеров в культуре фибробластов Fig. 1. Expression of surface markers in fibroblast culture
Важным свойством, характеризующим функциональное состояние клеточной популяции, является синтез коллагена и эластина фибробластами. Известно, что при длительном культивировании фибробласты теряют способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, возникает риск накопления в клетках хромосомных аномалий [7]. В этой связи, по нашим наблюдениям, наиболее актуальными для исследования являются фибробласты, находящиеся в процессе культивирования на более ранних пассажах (обычно 4-6-м). Данное заключение подтверждается проведенным исследованием. В контрольной группе максимальное содержание коллагена и эластина в супернатанте определялось после 6-го пассажа и составило 1 984 пг/мл и 295 нг/мл соответственно (рис. 2).
Морфологически после 5-6-го пассажа фибробласты формируют сплошной монослой, в клетках появляются более крупные вакуоли. Очевидно, при этом увеличивается и секреторная активность клеток, так как в среде культуры клеток увеличивается концентрация коллагена и эластина.
2500
2000
1500
1000
500
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
— Эластин, нг/мл 4,9 9,3 150 270 290 272 295 251 230 200 219 193 185 171 179 100 115 97 95 35
— Коллаген, пг/мл 50 83 190 362 511 1984 2142 1002 919 913 500 550 403 332 117 132 114 109 99 65
CD44растворимый, нг/мл 0 2 7 5 6 10 9 9 8 10 7 5 4 5 3 4 2 2 0 1
Неделя культивирования
Рис. 2. Продукция коллагена (COL1), эластина, растворимого CD44var (v6) фибробластами в зависимости от продолжительности культивирования
Fig. 2. Production of collagen (COL1), elastin, soluble CD44var (v6) by fibroblasts, depending on the time of cultivation
Дизайн эксперимента:
•моделирование гипоксии достигали снижением содержания кислорода до 0 % в замкнутой системе; экспозицию фибробластов в среде с измененным газовым составом 0 % концентрации кислорода осуществляли однократно в течение 1, 12 и 24 ч, затем клетки культивировали в стандартных условиях при 37 °С в атмосфере 5 % С02 с использованием С02-инкубатора;
• моделирование венозного стаза за счет повышения количества С02 в 4 раза (5-20 %);
•моделирование условий компрессии за счет повышения давления в замкнутой системе:
флаконы с культурой клеток помещали в эксикатор, где с помощью насоса создавали условия повышенного давления;
• моделирование условий гипоксии и компрессии за счёт снижения количества кислорода до 0 % и повышения давления в замкнутой системе;
• экспозицию фибробластов в среде с моделируемым повреждающим фактором осуществляли однократно в течение 1, 12 и 24 ч, затем клетки культивировали в стандартных условиях при 37 °С в атмосфере 5 % С02 с использованием С02-инкубатора;
•исследование контрольной группы — культуры фибробластов, не подвергавшейся воздействиям.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel и Statistics 7.0. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
Моделирование гипоксии. Изменение содержания кислорода в окружающей среде формирует комплекс ответных реакций клетки, запускающий процесс адаптации. Культивирование фибробластов в условиях гипоксии приводит к снижению их морфологической гетерогенности, повышению пролиферативной активности, в том числе колониеобразующей способности и жизнеспособности клеток, с сохранением их иммунофенотипа.
После помещения культуры клеток в нормоксические условия (95 % воздуха + 5 % СО2) было отмечено снижение уровня экспрессии CD44+ (рецептор гиалуроновой кислоты), после культивирования фибробластов в условиях гипоксемии в течение 12 и 24 ч — в 1,5-2 раза соответственно и восстановление до первоначального уровня экспрессии CD44 на мембране клеток через 48 ч. Результаты исследования показали, что наименее повреждающее действие на клетки оказывает гипоксия в течение 1 ч. Пониженное содержание кислорода вызывает в клетках слабый окислительный стресс, адаптация к которому, вероятно, приводит к повышению устойчивости клеток.
При культивировании фибробластов в условиях гипоксии в течение 1 ч по сравнению с нор-моксией наблюдали значительный прирост клеток — 91±5 и 77±4 % в контрольной группе соответственно. Кроме того, в условиях гипоксии наблюдали антиапоптозный и антинекротический эффекты, что проявляется в повышении числа жизнеспособных фибробластов. Изменяется состав межклеточного вещества (МкВ) за счет выработки культурой фибробластов эластина, коллагена и растворимого CD44 (БАВ) в условиях снижения количества О2 в системе (до 0 %).
Кратковременная (1 ч) гипоксия не оказывает значимого влияния на продукцию фибробла-стами коллагена и эластина в сравнении с контрольной группой. Однако после помещения культуры в условия нормоксемии (37 °С в атмосфере 5 % СО2) наблюдали резкое угнетение синтеза данных веществ с восстановлением их продукции до нормальных единиц после 48 ч культивирования (табл. 1). Полученные данные указывают на высокую устойчивость культивируемых фибробластов к кратковременному действию гипоксии.
Таблица 1
Функциональная активность фибробластов при отсутствии O2 в течение 1 ч
Table 1
Functional activity of fibroblasts during 1-hour absence of O2
Состав МкВ Контрольная группа Отсутствие O2 Нормальные условия (^..-инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 262±25 164±35 191±27 196±30 210±25 190±15
Коллаген, пг/мл 364±25 200±16 59±17* 194±19* 185±24* 280±29 200±16
CD44, нг/мл 5±0,4 7±0,5 8±0,3 7±0,9 7±0,3 6±0,4 5±0,9
Примечание. Здесь и в табл. 2-12: * достоверные отличия, р<0,05 (п=15)
В культуре клеток, которые находились в условиях 12-часовой гипоксии, наблюдали значительное угнетение синтеза как коллагена, так и эластина фибробластами (табл. 2). Последующее культивирование в нормальных условиях (95 % воздуха + 5 % С02) приводило лишь к умеренному восстановлению продукции фибробластами данных веществ.
После нахождения культуры фибробластов в условиях гипоксии в течение 24 ч происходит практически полное угнетение синтеза коллагена и эластина (табл. 3) с последующим незначительным восстановлением продукции эластина и полным угнетением синтеза коллагена при культивировании в условиях нормоксемии.
Российский остеопатический журнал Russian Osteopathic Journal
2019. № 1-2 (44-45) 2019. № 1-2 (44-45)
Таблица 2
Функциональная активность фибробластов при отсутствии O2 в течение 12 ч
Table 2
Functional activity of fibroblasts during 12-hour absence of O2
Состав МкВ Контрольная группа Отсутствие O2 Нормальные условия (ДО^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 8±0,4* 6±0,2* 24±0,9* 69±12* 100±38* 99±11*
Коллаген, пг/мл 364±25 19±1,5* 10±0,2* 12±0,9* 19±1,2* 34±12* 40±13*
CD44, нг/мл 5±0,4 10±0,1* 10±,1* 9±0,1* 8±0,7* 8±1,3* 4±0,2*
Таблица 3
Функциональная активность фибробластов при отсутствии O2 в течение 24 ч
Table 3
Functional activity of fibroblasts during 24-hour absence of O2
Состав МкВ Контрольная группа Отсутствие O2 Нормальные условия (C02-инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 1±0,2* 0,7±0,1* 19±0,1* 30±17* 13±10* 18±0,5*
Коллаген, пг/мл 364±25 0,7±0,3* 0 0 0 0 0
CD44, нг/мл 5±0,4 10±0,4* 9±0,3* 9±0,2* 8±0,5* 0 0
Результаты показали, что наименее повреждающее действие на клетки оказывает кратковременное (1 ч) культивирование клеток в условиях гипоксии. В результате воздействия происходит повышение устойчивости клеток к моделируемому стрессу, поскольку данные условия способствуют повышению активности ферментов антиоксидантной системы. Более длительная (12 и 24 ч) гипоксия вызывает в клетках необратимые процессы.
Культивирование в условиях отсутствия кислорода в системе приводит к изменению скорости роста, способности к дифференцировке и продукции синтезируемых веществ, при этом их основные морфологические и фенотипические особенности сохраняются.
Адаптивные «мероприятия» антиоксидантного характера [8] позволяют не только избежать окислительной деградации, но и создать условия для стимуляции пролиферативного процесса, снизив первоначально высокий «цитотоксический» внутриклеточный дисбаланс до уровня, необходимого для окислительного митогенеза. Однако и эта стадия в жизни первичной культуры ограничивается непрерывно угнетающей ее гипероксической средой.
Таким образом, исследование демонстрирует роль кислорода не только как фактора, моделирующего свойства фибробластов, но и как важного компонента микроокружения клеток, позволяющего понять принципы их функционирования.
Моделирование повышенного содержания СО2 в атмосфере (гиперкапния). Культивирование фибробластов в условиях гиперкапнии приводит к снижению их морфологической гетерогенности, изменению пролиферативной активности и жизнеспособности клеток.
По морфологии фибробласты после кратковременного (1 ч) действия повышенного парциального давления С02 значительно отличались от клеток, культивируемых в нормальных условиях. Клетки находились как во взвешенном состоянии, так и при распластывании на дне культу-рального флакона. В контрольной группе выявилась гетерогенность: наблюдали небольшие вере-
Оригинальные статьи Original Articles
И. А. Аптекарь, Е. Г. Костоломова, Ю. Г. Суховей A. I. Aptekar, E. G. Kostolomova, Y. G. Sukhovey
теновидные активно делящиеся клетки-предшественники, более крупные веретеновидные созревающие клетки, а также крупные плащевидные зрелые фиброциты.
Клетки во взвешенном состоянии являются погибшими. Количество жизнеспособных клеток в опытном образце и в контрольном составило 48±9 и 90±3 % соответственно. При более длительной (12 и 24 ч) инкубации фибробластов в условиях гипоксии все клетки в культуре находились во взвешенном состоянии, наблюдали 100 % гибель фибробластов.
Индекс пролиферации возрастал после 1 ч культивирования в условиях гиперкапнии до 2,67+0,24 (в контрольной группе — 0,75+0,15). При дальнейшем культивировании (12 и 24 ч) индекс пролиферации снижался до 0. Это связано с тем, что рСО2 достигает критического уровня, при котором клетки уже не могут нормально существовать.
Кратковременная (1 ч) гиперкапния приводит к активации продукции фибробластами как коллагена, так и эластина в сравнении с контрольной группой. Однако после помещения культуры в условия нормоксемии (37 °С в атмосфере 5 % СО2) после часовой инкубации наблюдали резкое угнетение синтеза данных веществ, приводящее лишь к умеренному восстановлению в течение последующей инкубации (12, 24, 48 и 72 ч соответственно), табл. 4.
Таблица 4
Функциональная активность фибробластов при повышении содержания CO2 в течение 1 ч
Table 4
Functional activity of fibroblasts during 1-hour increase of CO level
Состав МкВ Контрольная группа Повышение CO2 Нормальные условия (^..-инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 395±30 90±17* 62±19* 100±25* 102±21* 99±29*
Коллаген, пг/мл 364±25 400±19 62±24* 48±13* 54±10* 67±24* 73±25*
CD44, нг/мл 5±0,4 10±2,5* 9±2,2* 10±2* 9±2,1* 8±1,1* 5±0,2
После нахождения культуры фибробластов в условиях более длительной (в течение 12 и 24 ч) гиперкапнии происходит полное угнетение синтеза коллагена и эластина (табл. 5, 6) вследствие гибели культуры клеток. Высокий индекс пролиферации, как и усиленную продукцию компонентов внеклеточного матрикса, предположительно можно объяснить механизмами адаптации клеток к условиям гиперкапнии.
Таблица 5
Функциональная активность фибробластов при повышении CO2 в течение 12 ч
Table 5
Functional activity of fibroblasts during 12-hour increase of CO level
Состав МкВ Контрольная группа Повышение CO2 Нормальные условия (^^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 0 0 0 0 0 0
Коллаген, пг/мл 364±25 0 0 0 0 0 0
CD44, нг/мл 5±0,4 10±1,4* 5±0,4 4±0,1 3±0,5 0 0
Таблица 6
Функциональная активность фибробластов при повышении содержания CO2 в течение 24 ч
Table 6
Functional activity of fibroblasts during 24-hour increase of CO2 level
Состав МкВ Контрольная группа Повышение CO2 Нормальные условия (С02-инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 0 0 0 0 0 0
Коллаген, пг/мл 364±25 0 0 0 0 0 0
CD44, нг/мл 5±0,4 6±0,3* 3±0,5 3±0,1 0 0 0
При высоком уровне СО2 в атмосфере в первую очередь, возможно, повреждаются митохондрии. Неспособность адаптивных механизмов клетки к быстрой и полной нейтрализации внезапно возникшей гиперкапнии, с одной стороны, и высокая уязвимость митохондриального звена при пероксидативных стрессах, с другой, определяют необратимый процесс дегенерации клеток после возникновения в них «критического уровня» повреждений. Необходимо отметить, что деструктивные изменения именно в митохондриях (основных потребителях О2 и в этом смысле — главной антикислородной ступени защиты в антиоксидантной системе клетки) не оставляют вариантов выживания для большинства клеток в условиях in vitro.
Моделирование условий высокого давления. В процессе эксперимента установлено, что культивирование фибробластов в условиях повышенного давления приводит к снижению их морфологической гетерогенности, повышению пролиферативной активности и жизнеспособности клеток с сохранением их иммунофенотипа.
После помещения культуры клеток в нормоксические условия (37 °С в атмосфере 5 % СО2) было отмечено снижение, как и в условиях гипоксии, уровня клеток, экспрессирующих маркер CD44, после культивирования фибробластов в условиях гипоксемии в течение 12 ч — 61±13 и 90±7 % в контрольной группе и 24 ч — 50±11 и 90±7 % в контрольной группе. Восстановление до первоначального уровня экспрессии на поверхности происходит через 72 ч.
Особый интерес представляет изменение морфологии фибробластов при воздействии высокого давления на клетки при культивировании. Так, морфология клеток после кратковременного (1 ч) воздействия отличалась от контрольной группы, наряду с распластанными верете-новидными клетками появлялись фибробласты с крупными вакуолями в цитоплазме и округлые клетки с радиальными «лучистыми» нитями вокруг. При более длительном (12 и 24 ч) воздействии наблюдали в суспензии открепленные и округлившиеся клетки, вокруг которых появлялся «ореол» из тонких нитей, идущих в виде лучей от тела клетки, а также клетки шаровидной формы, прикрепленные нитями к дну флакона. Дополнительно были отмечены мелкие округлые глыб-чатые образования, расположенные на поверхности клеток и на дне флакона. Вероятно, эти нити являлись остатками вещества (возможно, белково-гликопротеидной природы), с помощью которого клетки прикреплялись к дну флакона. Очевидно, что эти явления — части одного процесса взаимодействия поверхности клеток с подлежащим стеклом или пластиком дна культу-рального флакона.
Изучение изменения состава МкВ за счет выработки культурой фибробластов эластина, коллагена и растворимого CD44 (БАВ) в условиях повышения давления в системе показало, что кратковременное (1 ч) высокое давление, оказываемое на систему, приводит к активации синтеза фибробластами компонентов внеклеточного матрикса как коллагена, так и эластина в сравнении с контрольной группой. После прекращения данного действия на культуру клеток наблюдали угне-
Таблица 7
Функциональная активность фибробластов при повышении давления в течение 1 ч
Table 7
Functional activity of fibroblasts during 1-hour increase of pressure
Состав МкВ Контрольная группа Повышение давления Нормальные условия (^^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 350±24 163±19* 296±61 250±13 259±19 276±16
Коллаген, пг/мл 364±25 496±33 182±21* 290±35 299±21 304±31 350±11
CD44, нг/мл 5±0,4 6±0,3 5±0,3 5±0,2* 4±0,3 4±0,9 4±0,3
тение синтеза данных веществ после 1 ч инкубации в нормальных условиях (37 °С в атмосфере 5 % СО2) с восстановлением их продукции до нормальных единиц после 12 ч культивирования (табл. 7).
Данный феномен можно объяснить процессами, которые наблюдают при изменении морфологии клеток. После формирования сплошного монослоя в клетках начинали накапливаться более крупные вакуоли. Очевидно, при этом увеличивалась секреторная активность клеток, так как в среде культуры клеток повышалась концентрация коллагена и эластина. Возможно, это и является механизмом адаптации в ответ на оказываемое повышенное давление.
В исследуемой культуре фибробластов, где повышенное давление на систему оказывалось в течение 12 ч, наблюдали значительное угнетение синтеза как коллагена, так и эластина. Культивирование в нормальных условиях (37 °С в атмосфере 5 % СО2) приводило к постепенному полному восстановлению продукции фибробластами данных веществ (табл. 8).
После нахождения культуры фибробластов в условиях повышенного давления в течение 24 ч происходило практически полное угнетение синтеза коллагена и эластина. Последующее культивирование в нормальных условиях приводило к постепенному восстановлению продукции коллагена до контрольных цифр и умеренному восстановлению синтеза эластина (табл. 9).
Если повреждающий фактор присутствует постоянно, как при воздействии хронических физических, токсических, метаболических и аутоиммунных факторов, регенеративный ответ идет безостановочно и приводит к хроническому процессу, также известному как фиброз. Таким образом, тканевой фиброз можно рассматривать как повреждение, которое тормозит процесс восстановления из-за постоянной активации механизмов регенерации (адаптации). Частично это регулируется эпигенетическими механизмами в активированных фибробластах, что усиливает активность антиапоптозных сигнальных путей и пролиферацию клеток, приводящую к генерации гиперактивированных фибробластов.
Таблица 8
Функциональная активность фибробластов при повышении давления в течение 12 ч
Table 8
Functional activity of fibroblasts during 12-hour increase of pressure
Состав МкВ Контрольная группа Повышение давления Нормальные условия (^^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 17±2,9* 29±3,4* 63±19* 199±25* 233±24 260±20
Коллаген, пг/мл 364±25 89±13* 74±12* 200±40 255±20 290±17 284±18
CD44, нг/мл 5±0,4 9±0,7* 7±0,9 5±0,4 5±0,3 5±0,3 4±0,1
Таблица 9
Функциональная активность фибробластов при повышении давления в течение 24 ч
Table 9
Functional activity of fibroblasts during 24-hour increase of pressure
Состав МкВ Контрольная группа Повышение давления Нормальные условия (ДО^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 4,9±1,3* 4±0,2* 9,7±0,3* 101±15* 115±17* 240±36
Коллаген, пг/мл 364±25 39±1,2* 29±0,9* 41±5,4* 90±11* 102±10* 104±19*
CD44, нг/мл 5±0,4 8±0,3* 9±0,1* 6±0,2 5±0,5 4±0,2 4±0,2
Моделирование комбинированного воздействия факторов компрессии и гипоксии (1, 12
и 24 ч). При воздействии на систему этих повреждающих факторов происходило значительное угнетение синтеза как коллагена, так и эластина фибробластами после экспозиции в течение 1 ч. Последующее культивирование в нормальных условиях (37 °С, 95 % воздуха + 5 % С02) приводило лишь к умеренному восстановлению продукции фибробластами данных веществ (табл. 10).
Таблица 10
Функциональная активность фибробластов при комбинированном воздействии компрессии и гипоксии в течение 1 ч
Table 10
Functional activity of fibroblasts during 1-hour effect of combined compression and hypoxia
Состав МкВ Контрольная группа Компрессия и гипоксия Нормальные условия (ДО^инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 300±42 72±20* 109±31* 95±27* 119±14* 93±24*
Коллаген, пг/мл 364±25 400±28 24±10* 42±17* 30±10* 34±9,2* 40±5,4*
CD44, нг/мл 5±0,4 10±1,1* 9±0,4* 7±1,1 6±2,1 7±1,7 5±2,7
Более длительная (в течение 12 и 24 ч) экспозиция приводила к тотальной гибели клеток (табл. 11,12).
Таблица 11
Функциональная активность фибробластов при комбинированном воздействии компрессии и гипоксии в течение 12 ч
Table 11
Functional activity of fibroblasts during 12-hour effect of combined compression and hypoxia
Состав МкВ Контрольная группа Компрессия и гипоксия Нормальные условия (^^инкубатор, 37 °С, 5 %% CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 9±1,9* 0 0 0 0 0
Коллаген, пг/мл 364±25 11±2,4* 0 0 0 0 0
CD44, нг/мл 5±0,4 10±0,9* 9±2,2* 0 0 0 0
Таблица 12
Функциональная активность фибробластов при комбинированном воздействии компрессии и гипоксии в течение 24 ч
Table 12
Functional activity of fibroblasts during 24-hour effect of combined compression and hypoxia
Состав МкВ Контрольная группа Компрессия и гипоксия Нормальные условия (С02-инкубатор, 37 °С, 5 % CO2)
1 ч 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Эластин, нг/мл 270±19 0 0 0 0 0 0
Коллаген, пг/мл 364±25 0 0 0 0 0 0
CD44, нг/мл 5±0,4 10±0,3* 9±3,4* 0 0 0 0
Данный эксперимент установил, что приоритетность повреждающего влияния на фибробласты, их жизнеспособность и формирование межклеточного вещества выражается последовательностью по степени убывания: компрессия-гиперкапния-гипоксия. Более повреждающим действием на основные клетки соединительной ткани обладают компрессия и гиперкапния.
Таким образом, в остеопатической практике возможная модель коррекции функциональных нарушений соединительной ткани может быть выражена следующей последовательностью: декомпрессия-устранение отека и гиперкапнии-восстановление артериального кровообращения. Это требует дальнейших экспериментальных исследований. Клинические исследования, проведённые за период 2015-2019 гг. на базе АНО «ТИММ. Клиника семейной остеопатии», в ходе которых была использована приведённая выше последовательность остеопатической коррекции [9] (декомпрессия, устранение гиперкапнии и гипоксии), подтверждают правильность данного подхода.
Заключение
Подводя итоги исследования, перечислим основные характеристики поведения фибробластов при воздействии факторов внешней среды.
• Основная реакция фибробластов на воздействие формируется в течение 48 ч.
•Основной этап восстановления после устранения внешнего фактора (компрессия, гипоксия,
гиперкапния) происходит в течение первых 72 ч.
• Фибробласты адаптируются морфологически (меняя форму) и изменяют локальную среду обитания (межклеточное вещество) в ответ на изменение условий окружающей среды за счёт изменения соотношения эластина и коллагена.
•Фибробласты прекращают контакт с внешней средой за счет «сбрасывания» рецепторов CD44+ и на определённом этапе адаптации завершают жизнедеятельность, что особенно важно, процессом апоптоза.
В результате исследования выявлено, что приоритетность повреждающего влияния на фибробласты, их жизнеспособность и формирование межклеточного вещества выражается последовательностью по степени убывания: компрессия-гиперкапния-гипоксия.
Полученные результаты могут лечь в обоснование модели коррекции функциональных нарушений соединительной ткани, которая соответственно может быть выражена следующей последовательностью: декомпрессия-устранение отека и гиперкапнии-восстановление артериального кровообращения.
Исследование не финансировалось каким-либо источником, конфликт интересов отсутствует.
Литература/References
1. Омельяненко Н. П., Слуцкий Л. И. Соединительная ткань (гистофизиология и биохимия). В 2-х т. М.: Известия, 2008; 2 [Omelyanenko N. P., SluczkiT L. I.Soedinitelnaya tkan (gistofiziologiya i bioximiya). V 2-x t. M.: Izvestiya, 2008; 2 (in russ.)].
2. Бозо И. Я., Деев Р. В., Пинаев Г. П. Фибробласт — специализированная клетка или функциональное состояние клеток мезенхимного происхождения? Цитология 2010; 52 (2): 99-109 [Bozo I. Ya., Deev R. V., Pinaev G. P. Fibroblast — specializirovannaya kletka ili funkcionalnoe sostoyanie kletok mezenximnogo proisxozhdeniya? Citologiya 2010; 52 (2): 99-109 (in russ.)].
3. Sorrell M., Caplan A. I. Fibroblasts — a diverse population at the center of it all. Int. Rev. Cell. Molec. Biol. 2009; 276: 161- 214.
4. Кудрявцев И. В., Хайдуков С. В., Зурочка А. В., Черешнев В. А. Применение метода проточной цитофлюориметрии для оценки пролиферативной активности клеток в медико-биологических исследованиях. Российский иммунологический журнал 2012; 6 (14), (3-1): 21-40 [Kudryavcev I. V., Xajdukov S. V., Zurochka A. V., Chereshnev V. A. Primenenie metoda protochnoj citofluorimetrii dlya ocenki proliferativnoj aktivnosti kletok v mediko-biologicheskix issledovaniyax. Rossijskij immunologicheskij zhurnal 2012; 6 (14), (3-1): 21-40 (in russ.)].
5. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир; 1983 [Adams R. Metody kultury kletok dlya bioximikov. M.: Mir; 1983 (in russ.)].
6. Аптекарь И. А. Тромбоцитарное звено и постоянное внутрисосудистое свёртывание крови при активации и угнетении липопероксидации: Дис. канд. мед. наук. Тюмен. ГУ. Тюмень, 2003 [Aptekar I. A. Trombocitarnoe zveno i postoyannoe vnutrisosudistoe svyortyvanie krovi pri aktivacii i ugnetenii lipoperoksidacii: Dic. kand. med. nauk. Tyumen. GU. Tyumen, 2003 (in russ.)].
7. Бочков Н. П. Цитогенетический контроль безопасности стволовых клеток: Тезисы конф. «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества». М.; 2007 [Bochkov N. P. Citogeneticheskij kontrol bezopasnosti stvolovyx kletok: Tezisy konf. «Stvolovye kletki: zakonodatelstvo, issledovaniya i innovacii. Mezhdunarodnye perspektivy sotrudnichestva». M.; 2007 (in russ.)].
8. Бышевский А. Ш.., Галян С. Л., Шаповалов П. Я. Механизмы связи гемостаза и перекисного окисления липидов. Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения. М.; 2000: 52-53 [Byshevskij A. Sh., Galyan S. L., Shapovalov P. Ya. Mexanizmy svyazi gemostaza i perekisnogo okisleniya lipidov. Trombozy, gemorragii, DVS-sindrom. Problemy lecheniya. M.; 2000: 52-53 (in russ.)].
9. Боброва Е. А., Абрамова Е. В., Долгова И. Г., Аптекарь И. А., Малишевская Т. Н., Дунаевская А. В. Остеопатическая коррекция миопии слабой степени у детей 7-10 лет. Российский остеопатический журнал 2015; 1-2 (28-29): 43-49 [Bobrova E., Aptekar I., Abramova E.. Osteopathic Correction of Mild Myopia in 7-10 Years Old Children. Russian Osteopathic Journal 2015; 1-2 (28-29): 43-49 (in russ.)]. https://doi.org/10.32885/2220-0975-2015-1-2-43-49.
Поступила в редакцию 20.02.2019 После доработки 20.02.2019 Принята к публикации 26.03.2019
Сведения о соавторах:
Е. Г. Костоломова, канд. биол. наук,
кафедра патологической физиологии
Ю. Г. Суховей, докт. мед. наук, профессор, директор
Information about co-authors:
E. G. Kostolomova, M. D., Ph. D. (Bio),
Pathological Physiology Department
Y. G. Sukhovey, Professor, M. D., Ph. D. (Med),
D. Sc. (Med), Director
