CC BY
16
(сс)
doi: 10.21518/2079-701X-2020-12-71-74 Краткое сообщение / Short report
Изменение экспрессии гена STAT3 при лечении псориаза
В.В. Соболев1'2®, ORCID: 0000-0003-4779-156X, e-mail: vLsobolew@gmaiL.com Е.В. Денисова2, ORCID: 0000-0002-4887-284X, e-mail: evdenissova@rambler.ru И.М. Корсунская2, ORCID: 0000-0002-6583-0318, e-mail: marykor@bk.ru
1 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; 105064, Россия, Москва, Малый Казенный пер., д. 5
2 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии; 109029, Россия, Москва, ул. Средняя Калитниковская, д. 30
Резюме
Введение. Псориаз является типичным комплексным мультигенным и мультифакторным заболеванием с гетерогенной генетической наследуемостью, для проявления которого необходимо взаимодействие генов как друг с другом, так и с факторами окружающей среды. STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) совсем недавно стал рассматриваться как один из ключевых игроков в развитии и патогенезе псориаза и псориатических воспалительных состояний. Цель исследования. Изучение экспрессии гена STAT3 в пораженной части кожи больных псориазом по отношению к визуально непораженной части. Изучение изменения уровня экспрессии гена STAT3 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у больных до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм. Материалы и методы. В исследовании участвовали 12 больных псориазом. Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи. Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени. Результаты и обсуждение. Проведено количественное измерение экспрессии гена STAT3 с помощью ПЦР-РВ в пораженной части кожи больных псориазом по отношению к визуально непораженной части кожи у тех же пациентов до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона). В результате исследования было экспериментально показано увеличение экспрессии гена STAT3 в пораженной части кожи больных псориазом в среднем в 3,96 ± 2 раза. Уменьшение экспрессии гена наблюдалось в пораженной псориазом коже по сравнению с образцами непораженных участков. После лечения пациентов лазерным излучением низкой интенсивности наблюдалось достоверное снижение экспрессии сверхэкспрессированного гена STAT3 до 1,75 ± 0,5 раза. Выводы. Транскрипционная активность гена STAT3 может являться индикатором эффективности лечения псориаза на молекулярном уровне, а также стать новой терапевтической мишенью.
Ключевые слова: псориаз, STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3), экспрессия гена, ПЦР-РВ, лазерное излучение низкой интенсивности
Для цитирования: Соболев В.В., Денисова Е.В., Корсунская И.М. Изменение экспрессии гена STAT3 при лечении псориаза. Медицинский совет. 2020;(12):71-74. doi: 10.21518/2079-701X-2020-12-71-74.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Alteration of STAT3 gene expression in psoriasis treatment
Vladimir V. Sobolev12H, ORCID: 0000-0003-4779-156X, e-mail: vlsobolew@gmail.com Elena V. Denisova2, ORCID: 0000-0002-4887-284X, e-mail: evdenissova@rambler.ru Irina M. Korsunskaya2, ORCID: 0000-0002-6583-0318, e-mail: marykor@bk.ru
1 Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera; 5a, Malyy Kazenny Lane, Moscow, 105064, Russia
2 Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences; 30, Srednyaya Kalitnikovskaya St., Moscow, 109029, Russia
Abstract
Introduction. Psoriasis is a typical complex multigenic and multifactorial disease with heterogeneous genetic heredity, which requires the interaction of genes both with each other and with environmental factors. STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) has only recently been considered a key player in the development and pathogenesis of psoriasis and psoriatic inflammatory conditions. Aim of the study. To study the expression of the STAT3 gene in the affected part of the skin of psoriasis patients in relation to the visually unaffected part. To study the change in the STAT3 gene expression level in psoriasis-affected skin as compared to non-affected skin in patients before and after treatment with low-level laser radiation at a wavelength of 1.27 ^m. Materials and methods. The study involved 12 psoriasis patients. Biopsies from the unaffected skin were taken at a distance of about 3 cm from the affected skin. Real-time PCR analysis was performed.
Results and discussion. The expression of the STAT3 gene was quantitatively measured using RT-PCR in the affected part of the skin of psoriasis patients compared to the visually unaffected part of the skin of the same patients before and after treatment with low-level laser radiation with a wavelength of 1.27 pm (short-wave infrared). As a result of the study, an increase in the expression of the STAT3 gene in the affected part of the skin of psoriasis patients of an average of 3.96 ± 2 times was experimentally shown. A decrease in gene expression was observed in psoriasis affected skin compared to samples of non-affected areas. After treatment of patients with low-level laser radiation, a significant reduction in the expression of the overexpressed STAT3 gene to 1.75 ± 0.5 times was observed. Conclusions. The transcription activity of the STAT3 gene can be an indicator of the efficacy of psoriasis treatment at the molecular level and can also be a new therapeutic target.
Keywords: psoriasis, STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3), gene expression, RT-PCR, low-level laser radiation
For citation: Sobolev V.V., Denisova E.V., Korsunskaya I.M. Alteration of gene expression in psoriasis treatment. Meditsinskiy sovet = Medical Council. 2020;(12):71-74. (In Russ.) doi: 10.21518/2079-701X-2020-12-71-74.
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
© Соболев В.В., Денисова Е.В., Корсунская И.М., 2020
2020;(12):71-74 MEDITSINSKIY SOVET 71
ВВЕДЕНИЕ
Псориаз - это хроническое воспалительное заболевание кожи, которым болеют от 2 до 3% людей во всем мире [1]. Псориаз бляшечного типа (также известный как вульгарный псориаз - Psoriasis vulgaris) является наиболее распространенным клиническим вариантом, на который приходится примерно 85% случаев, характеризуется толстыми эритематозными бляшками, покрытыми серебристыми пластинчатыми чешуйками, преимущественно локализованными на разгибательных поверхностях, коже черепа и туловища [2].
Основной причиной развития псориаза является хроническое взаимодействие между гиперпролиферативны-ми кератиноцитами и инфильтрирующими активированными иммунными клетками. Первоначально считалось, что псориаз возникает исключительно из-за пролифера-тивной дисфункции кератиноцитов [3].
Псориаз является типичным комплексным заболеванием - мультигенным и мультифакторным с гетерогенной генетической наследуемостью, для проявления которого необходимо взайимодействие генов как друг с другом, так и с факторами окружающей среды. При семейном анализе и генотипировании больных псориазом было выяснено, что разные фенотипы болезни имеют разные локусы [4].
Локусы, связанные с псориазом, локализованы по крайней мере на 13 различных хромосомах и обозначаются как PSORS (Psoriasis Susceptibility) PSORS1-PSORS13 [5]. В пределах каждой из этих областей картирован целый ряд генов-кандидатов [6].
Изучение дифференциальной экспрессии генов в коже больных псориазом существенно расширило знание о патогенезе псориаза [7-9].
STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) совсем недавно стал рассматриваться как один из ключевых игроков в развитии и патогенезе псориаза и псориа-тических воспалительных состояний [10]. Гиперактивация гена STAT3 описана практически в каждом типе клеток, участвующих в инициации и поддержании заболевания, и этот фактор опосредует сигналинг большинства цитокинов, участвующих в патогенезе заболевания, включая основные интерлейкины - IL-23, IL-17, IL-22 [11-13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Забор биопсий осуществлялся у пациентов, проходивших лечение в клинике им. В.Г. Короленко Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии с установленным диагнозом «псориаз бляшечного типа (Psoriasis vulgaris)». Возраст пациентов варьировал от 25 до 56 лет (табл.). Диагноз "Psoriasis vulgaris" в каждом случае устанавливался клинически и был подтвержден путем патоморфологического изучения биоптатов кожи.
Забор пораженного и непораженного участков кожи больных псориазом проводили под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм).
• Таблица. Клинические показатели больных псориазом (Psoriasis vulgaris)
• Table. Clinical indicators of psoriasis patients (Psoriasis vulgaris)
Пациенты с основным диагнозом «псориаз» (п = 23)
Возраст 43,5 ± 8,8
Пол, n (%)
• мужчины 10 (43,5%)
• женщины 13 (56,5%)
PASI 22,1 ± 6,25
Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи. Исследование одобрено локальным комитетом по этике при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и соответствует принципам, изложенным в декларации Хельсинского соглашения.
Выделение РНК из биопсий проводили на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit® для кожи. Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДНКазой Qiagen. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США), после чего образцы выравнивали по концентрации в ddH2O.
Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносили: буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M_MLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНК_аз RNasin (Promega), 500 нг oLigo(dT) праймеров (ДНК_Синтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь тер-мостатировали 1 ч при 37 °С.
ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием интеркалирующе-го красителя SYBR Green (Евроген, Россия). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез».
Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, CFX96™), используя следующею программу: (1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин, (2) денатурация при 94 °С в течение 15 с, (3) отжиг при 55 °С в течение 15 с, (4) элонгация при 72 °С в течение 15 с, (5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. Амплификация гена GAPDH и исследуемых генов проводилась в разных пробирках.
Для обсчета результатов использовались данные реакции ПЦР в реальном времени со следующими параметрами: эффективность праймеров в реакции ПЦР в реальном времени не менее 95%; коэффициент корреляции не менее 0,99; наклон кривой (slope) -3,4 ± 0,2.
Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2"мсг, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным [14]. AACt рассчитывалось как AACt = ÄCt (пораженной кожи) - ACt (непораженной кожи) и каждое значение ACt = Ct (исследуемый ген) - Ct (GAPDH). Эксперименты проводили в трехкратной повторности для каждого образца.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В своей работе мы сравнивали уровни экспрессии гена STAT3 в пораженной части кожи больных псориазом по отношению к визуально непораженной части кожи, находящейся на расстоянии не менее 3 см от пораженной псориатической кожи одного и того же больного. Такое сравнение позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента [15]. Используя метод ПЦР в реальном времени, был проведен анализ уровня экспрессии гена STAT3 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у 12 больных.
При индивидуальном анализе каждого больного было показано, что уровень экспрессии гена STAT3 у всех пациентов повышен относительно контроля, и повышается в диапазоне от 1,6 раза (пациент 10) до 6,7 раза (пациент 1) (рис. 1). В среднем экспрессия гена STAT3 у пациентов оказалась повышенной в пораженной коже относительно визуально непораженной в 3,96 ± 2 раза.
• Рисунок 1.Уровень экспрессии мРНК гена STAT3 в пораженной коже пациентов по отношению к уровню содержания в визуально непораженной псориазом коже, принятому за 1
• Figure 1. Expression level of STAT3 gene mRNA in affected skin of patients compared to the level in visually unaffected psoriasis skin taken for 1
На следующем этапе работы, для дополнительной верификации полученных результатов мы сравнили изменение уровня экспрессии гена БТАТ3 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у 12 больных до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона).
После лечения пациентов лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм наблюдалось достоверное снижение экспрессии сверхэкспресси-рованного гена БТАТ3 до 1,75 ± 0,5 раза у исследуемой группы пациентов (рис. 2).
1 Рисунок 2. Сравнение уровня экспрессии гена STAT3 непараметрическим методом Манна - Уитни в образцах пораженной псориазом кожи до и после лечения низкоинтенсивным лазерным излучением (p < 0,01). За 1 принят уровень экспрессии в визуально непораженной коже f Figure 2. Comparison of the level of STAT3 gene expression by the non-parametric Mann-Whitney method in samples of psoriasis-affected skin before and after low-level laser treatment (p < 0.01)
пациенты до лечения
пациенты после лечения
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствует о том, что в пораженной псориазом коже происходит активация экспрессии гена STAT3, что позволяет предположить, что дефектная активация внутриклеточного пути, управляемого STAT3, может способствовать поддержанию повреждающего кожу иммунно-воспалительного ответа при псориазе.
STAT3, участвующий в передаче внеклеточных сигналов в ядро, является возможной важной связью между кератиноцитами и иммуноцитами и имеет решающее значение для развития псориаза [16]. Ранее, другими исследователями было показано, что применение различных способов лечения псориаза снижает уровень экспрессии STAT3 в пораженной коже [17, 18].
STAT3 является ключевым положительным регулятором экспрессии транскрипционного фактора RORgamma и связывается с промотером IL-17. Повышенная экспрессия STAT3 и RORgamma необходима для развития клеток Th17 и координации их дифференцировки [19, 20].
Учитывая перечисленные факты в сочетании с собственными результатами, мы пришли к выводу, что транскрипционная активность гена STAT3 может являться индикатором эффективности лечения псориаза на молекулярном уровне, а также стать новой терапевтической мишенью.
Поступила / Received 22.08.2020 Поступила после рецензирования / Revised 24.09.2020 Принята в печать / Accepted 28.09.2020
-Список литературы / References-
1. Christophers E. Psoriasis - epidemiology and clinical spectrum. Clin Exp Dermatol. 2001;26(4):314-320. doi: 10.1046/j.1365-2230.2001.00832.x.
2. Boehncke W.H., Schon M.P. Psoriasis. Lancet. 2015;386(9997):983-994. doi: 10.1016/S0140-6736(14)61909-7.
3. Di Cesare A., Di Meglio P., Nestle F.O. The IL-23/Th17 axis in the immu-nopathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol. 2009;129(6):1339-1350. doi: 10.1038/jid.2009.59.
4. Samuelsson L., Enlund F., Torinsson A., Yhr M., Inerot A., Enerbâck C. et al. A genome-wide search for genes predisposing to familial psoriasis by using a stratification approach. Hum Genet. 1999;105(6):523-529.
doi: 10.1007/s004399900182.
5. Merve H.M., Sevilay K., Sibel O., Basac B., Ceren C.G., Demirci T., Cuneyt A. Psoriasis and Genetics. In: Chiriac A. (ed.) An Interdisciplinary Approach to Psoriasis. 2017. doi: 10.5772/intechopen.68344.
2020;(12):71-74 MEDITSINSKIY SOVET 73
6. Barker J.N. Genetic aspects of psoriasis. Clin Exp Dermatol. 2001;26(4):321-325. doi: 10.1046/j.1365-2230.2001.00830.x.
7. Соболев В.В., Золотаренко А.Д., Соболева А.Г, Саутин М.Е., Ильина С.А., Саркисова М.К. и др. Экспрессия гена FOSL1 при псориазе и атеросклерозе. Генетика. 2010;46(1):104-110. Режим доступа: http://www.vigg.ru/ genetika.
Sobolev V.V.,Zolotarenko A.D., Soboleva A.G., Sautin M.E., Il'ina S.A., Sarkisova M.K. et al. Expression of the FOSL1 gene in psoriasis and atherosclerosis. Genetika = Russian Journal of Genetics. 2010;46(1):104-110. (In Russ.) Available at: http://www.vigg.ru/genetika. Sobolev V.V., Zolotorenko A.D., Soboleva A.G., Elkin A.M., Il'ina S.A., Serov D.N. et al. Effects of Expression of Transcriptional Factor AP-1 FOSL1 Gene on Psoriatic Process. Bull Exp Biol Med. 2011;150(5):632-634. doi: 10.1007/ s10517-011-1208-0.
Sobolev V.V., Nikol'skaya T.A., Zolotarenko A.D., Piruzyan E.S., Bruskin SA. Expression of bioinformatically identified genes in skin of psoriasis patients. Russ J Genet. 2013;49(10):1057-1064. doi: 10.1134/S1022795413100116.
10. Calautti E., Avalle L., Poli V. Psoriasis: A STAT3-Centric View. Int J Mol Sci. 2018;19(1):171. doi: 10.3390/ijms19010171.
11. Sestito R., Madonna S., Scarponi C., Cianfarani F., Failla C.M., Cavani A. et al. STAT3-dependent effects of IL-22 in human keratinocytes are counterregu-lated by sirtuin 1 through a direct inhibition of STAT3 acetylation. FASEB J. 2011;25(3):916-927. doi: 10.1096/fj.10-172288.
12. Yang X.O., Panopoulos A.D., Nurieva R., Chang S.H., Wang D., Watowich S.S., Dong C. STAT3 Regulates Cytokine-mediated Generation of Inflammatory Helper T Cells. J Biol Chem. 2007;282(13):9358-9363. doi: 10.1074/jbc. C600321200 .
13. Harris TJ., Grosso J.F., Yen H.-R., Xin H., Kortylewski M., Albesiano E. et al. Cutting Edge: An In Vivo Requirement for STAT3 Signaling in TH17
8.
9.
Development and TH17-Dependent Autoimmunity. J Immunol. 2007;179(7):4313-4317. doi: 10.4049/jimmunol.179.7.4313.
14. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2(-MC(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262.
15. Yao Y., Richman L., Morehouse C., de los Reyes M., Higgs B.W., Boutrin A. et al. Type I Interferon: Potential Therapeutic Target for Psoriasis? PLoS One. 2008;3(7):e2737. doi: 10.1371/journal.pone.0002737.
16. Chowdhari S., Saini N. hsa-miR-4516 Mediated Downregulation of STAT3/ CDK6/UBE2N Plays a Role in PUVA Induced Apoptosis in Keratinocytes.
J Cell Physiol. 2014;229(11):1630-1638. doi: 10.1002/jcp.24608.
17. Grabarek B., Wcislo-Dziadecka D., Gola J., Kruszniewska-Rajs C., Brzezinska-Wcislo L., Zmarzly N., Mazurek U. Changes in the Expression Profile of JAK/ STAT Signaling Pathway Genes and Mirnas Regulating their Expression Under the Adalimumab Therapy. Curr Pharm Biotechnol. 2018;19(7):556-565. doi: 10.2174/1389201019666180730094046.
18. Grabarek B., Krzaczynski J., Strzatka-Mrozik B., Wcisto-Dziadecka D., Gola J. The influence of ustekinumab on expression of STAT1, STAT3, STAT4, SOCS2, and IL17 in patients with psoriasis and in a control. Dermatol Ther. 2019;32(5):e13029. doi: 10.1111/dth.13029.
19. Bovenschen H.J., van de Kerkhof P.C., van Erp P.E., Woestenenk R., Joosten I., Koenen H.J. Foxp3+ Regulatory T Cells of Psoriasis Patients Easily Differentiate into IL-17A-Producing Cells and Are Found in Lesional Skin. J Invest Dermatol. 2011;131(9):1853-1860. doi: 10.1038/ jid.2011.139.
20. Shu Y., Hu Q., Long H., Chang C., Lu Q., Xiao R. Epigenetic Variability of CD4+CD25+ Tregs Contributes to the Pathogenesis of Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 2017;52(2):260-272. doi:10.1007/ s12016-016-8590- 10.1007/s12016-016-8590-3.
Информация об авторах:
Соболев Владимир Васильевич, к.б.н., старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; 105064, Россия, Москва, Малый Казенный пер., д. 5; старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук»; 109029, Россия, Москва, ул. Средняя Калитниковская, д. 30; SPIN-код: 3035-8570; e-mail: vlsobolew@gmail.com
Денисова Елена Валерьевна, к.м.н., старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук»; 109029, Россия, Москва, ул. Средняя Калитниковская, д. 30; e-mail: evdenissova@rambler.ru
Корсунская Ирина Марковна, д.м.н., профессор, заведующая лабораторией физико-химических и генетических проблем дерматологии; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук»; 109029, Россия, Москва, ул. Средняя Калитниковская, д. 30; SPIN-код: 3335-2019; e-mail: marykor@bk.ru
Information about the authors:
Vladimir V. Sobolev, Cand. of Sci. (Bio.), Senior Researcher, Federal State Budget Scientific Institution "Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera"; 5a, Malyy Kazenny Lane, Moscow, 105064, Russia; Senior Researcher, Federal State Budgetary Institution of Science "Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences"; 30, Srednyaya Kalitnikovskaya St., Moscow, 109029, Russia; e-mail: vlsobolew@gmail.com
Elena V. Denisova, Cand. of Sci. (Med.), Senior Researcher, Federal State Budgetary Institution of Science "Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences"; 30, Srednyaya Kalitnikovskaya St., Moscow, 109029, Russia; e-mail: evdenissova@rambler.ru
Irina M. Korsunskaya, Dr. of Sci. (Med.), Professor, Head of the Laboratory for Physicochemical and Genetic Problems in Dermatology; Federal State Budgetary Institution of Science "Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences"; 30, Srednyaya Kalitnikovskaya St., Moscow 109029, Russia; e-mail: marykor@bk.ru
