CC BY
45
DOI: 10.24411/0235-2451-2019-11012
УДК 636.082.12
Изменение биологических параметров семени петухов при генетической модификации сперматогенных клеток семенников in vivo
Л. А. ВОЛКОВА, Б. С. ИОЛЧИЕВ, А. Н. ВЕТОХ, Н. А. ВОЛКОВА, Н. А. ЗИНОВЬЕВА
Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Создание генетически модифицированной птицы с качественно новыми признаками - одно из перспективных направлений современной науки. Важным элементом технологии служит возможность получения трансгенного потомства. В связи с этим представляет интерес изучение показателей качества половых клеток самцов после внесения генетических модификаций. Работу проводили с целью определения влияния трансгенеза на качество половых клеток петухов при трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo. Объект исследований - трансгенные и нетрансгенные петухи породы русская белая. Модифицированная птица получена с использованием лентивирусного вектора. Препарат вводили непосредственно в семенники взрослых особей однократно в возрасте 3 мес. (группа I, n = 5) и двукратно в возрасте 3 и 4 мес. (группа II, n = 5). По достижении половозрелости исследовали в динамике показатели качества семени трансгенных петухов, в сравнении с контролем, в частности, определяли долю живых сперматозоидов в эякуляте и их подвижность, долю сперматозоидов с анормальной морфологией и криорезистентность семени. Некоторые показатели качества спермы у трансгенных петухов при двукратном введении вирусного препарата (группа II) существенно снижались, по сравнению с контролем: в возрасте 6 мес. доля живых спермиев в эякуляте и их подвижность были ниже, чем в контрольной группе, на 4,1 и 10,6 %, соответственно. В возрасте 9 мес. эти различия нивелировались и не превышали 2,4 %. При однократном введении вирусного препарата (группа I) разница с контрольной группой по изучаемым показателям была незначительной, как в возрасте 6 мес, так и в 9 мес. - до 2,0 %. При этом сперма трансгенных петухов обеих опытных групп характеризовалась меньшей криоустойчивостью, по сравнению с контролем: разница в опытной группе I достигала 4 %, в группе II - 5 %.
Ключевые слова: петухи, криоконсервация, сперматозоиды, замораживание-оттаивание.
Сведения об авторах: Л. А. Волкова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: natavolkova@inbox.ru); Б. С. Иолчиев, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник; А. Н. Ветох, научный сотрудник; Н. А. Волкова, доктор биологических наук, зав. лабораторией; Н. А. Зиновьева, доктор биологических наук, академик РАН, директор. Для цитирования: Изменение биологических параметров семени петухов при генетической модификации сперматогенных клеток семенников in vivo / Л. А. Волкова, Б. С. Иолчиев, А. Н. Ветох и др. // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 10. С. 54-57. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-11012.
Change in Biological Parameters of the Rooster's Semen during Genetic Modification of Spermatogenous Testicle Cells In Vivo
L. A. Volkova, B. S. Iolchiev, A. N. Vetokh, N. A. Volkova, N. A. Zinovieva
Federal Scientific Center of Animal Husbandry - L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Abstract. The creation of genetically modified poultry with qualitatively new traits is one of the promising areas of modern science. An important element of the technology is the possibility to obtain transgenic offspring. In this regard, the study of the quality indicators of male reproductive cells after genetic modifications is of particular interest. The work was conducted to determine the effect of transgenesis on the quality of roosters' reproductive cells during the transformation of spermatogenic testicular cells in vivo. The object of the study was the transgenic and non-transgenic Russian white roosters. The modified poultry was obtained using a lentiviral vector. In the first group of 5 birds, the preparation was injected directly into the testicles of adults once at the age of 3 months. In the second group of 5 birds, the preparation was injected twice at the age of 3 and 4 months. Upon reaching maturity, the dynamics of the seed quality of transgenic roosters was compared with the control. In particular, we determined the proportion of live spermatozoa in the ejaculate and their motility, the proportion of spermatozoa with abnormal morphology and seed cryoresistance. With a double injection of the viral preparation, a number of indicators of sperm quality in transgenic roosters (the second group) significantly decreased compared to the control. At the age of 6 months, the proportion of live sperm in the ejaculate and their motility were lower than in the control group by 4.1% and 10.6%, respectively. At the age of 9 months, these differences were leveled and did not exceed 2.4%. With a single injection of the viral preparation, the difference between the test group and the control group in the studied parameters was insignificant. Both at the age of 6 months and at 9 months, it was up to 2.0%. Moreover, the sperm of transgenic roosters from both test groups was characterized by less cryostability compared to the control. The difference in the first experimental group reached 4%; in the second group, it reached 5%.
Keywords: roosters; cryopreservation; sperm; freezing-thawing.
Author Details: L. A. Volkova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; B. S. Iolchiev, D. Sc. (Biol.), leading research fellow; A. N. Vetokh, research fellow; N. A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; N. A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director. For citation: Volkova L. A., Iolchiev B. S., Vetokh A. N., Volkova N. A., Zinovieva N. A. Change in Biological Parameters of the Rooster's Semen during Genetic Modification of Spermatogenous Testicle Cells In Vivo. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No. 10. Pp. 54-57 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-11012.
Клетки гонад самцов - удобные мишени для введения рекомбинантной ДНК с целью создания генетически модифицированных особей с заданными признаками [1, 2]. Для направленной трансформации используют как зрелые половые клетки [3], так и их предшественников: примордиальные зародышевые клетки [4, 5, 6] и сперматогонии [7, 8]. Рекомбинантную ДНК вводят в клетки-мишени в куль-
туре in vitro с последующей трансплантацией в органы-мишени [9, 10] или непосредственно в орган-мишень in vivo в виде генной конструкции [11, 12]. Перспективу применения таких технологий определяет эффективность использования трансформированных половых клеток для получения трансгенного потомства. Сохранение биологического материала от трансгенных особей с целью дальнейшего их воспроизводства
возможно посредством криоконсервации. Чаще всего для этой цели используют сперматозоиды. Замораживание спермиев и последующее оттаивание оказывает влияние на жизнеспособность половых клеток: в ряде случаев это может приводить к гибели значительной их части или вызывать повреждения отдельных органелл или сегментов [13].
Технология замораживания и оттаивания сперматозоидов сельскохозяйственной птицы имеет ряд особенностей [14], обусловленных строением спермиев. Половые клетки самцов птиц характеризуются длинным жгутиком, превосходящим по размеру головку почти в 8 раз [15]. Цикл замораживание-оттаивание включает несколько этапов, в процессе которых на сперматозоиды оказывают различное химическое и физическое воздействие, что приводит к изменениям отдельных структурных единиц с последующим снижением биологической полноценности половых клеток [13, 16]. В связи с этим результативность осеменения замороженно-оттаянным семенем, как правило, значительно ниже, чем при использовании свежеполученного семени [17]. Несмотря на эти проблемы, криоконсервация половых клеток самцов имеет большое экономическое и биологическое преимущество перед другими методами поддержания биоразнобразия генофонда сельскохозяйственной птицы. Такой подход широко используется ex situ для сохранения биологического материала от ценных особей. Поэтому изучение показателей качества мужских половых клеток сельскохозяйственной птицы после внесения генетических модификаций представляет интерес.
Цель исследований - определение влияния трансгенеза на качество половых клеток петухов при трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo.
Условия, материалы и методы. Работу проводили на базе Всероссийского института животноводства им. Л. К. Эрнста в 2018-2019 гг. Объект исследований - полновозрастные трансгенные петухи
дов в эякуляте, долю сперматозоидов с анормальной морфологией, в возрасте 9 мес. оценивали криоустой-чивость семени.
Сбор спермы осуществляли 3 раза в неделю методом спинно-брюшинного массажа. От каждого самца было получено и проанализировано не менее 10 эякулятов семени. Качество спермы оценивали с использованием программного обеспечения «Зоо-сперм 1.0». (ВидеоТесТ, Санкт-Петербург). Долю жизнеспособных сперматозоидов определяли с помощью суправитальной окраски с использованием 5 %-ного раствора эозина.
Эякуляты семени петухов разбавляли специализированной средой в соотношении 1:1 и проводили процедуру эквилибрации при температуре 5 °С в течение 180 мин. При криоконсервации семени в качестве криопротектора использовали диметилацетамид (ДМА), поэтапно доводя его концентрацию до 8 %. Семя замораживали в соломинках объемом 0,25 мл с использованием автоматического замораживателя.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием 1-теста. Данные в таблицах представлены в виде средних арифметических значений величин (Х) и их ошибок (х).
Результаты и обсуждение. Показатели качества семени петухов контрольной группы соответствовали норме как в возрасте 6 мес., так и 9 мес. (табл. 1). При однократном введении вирусного препарата (группа I) отмечено незначительное снижение подвижности сперматозоидов и доли живых клеток. Разница с контролем по величинам этих показателей составила в возрасте 6 мес. - соответственно 2,0 % и 1,1 %, в возрасте 9 мес. - 1,8 % и 1,5 %. Уменьшение подвижности сперматозоидов было обусловлено увеличением доли сперматозоидов с анормальной морфологией. В возрасте 6 мес. величина этого показателя в группе I составила 9,6 %, что было недостоверно выше контроля на 2,1 %. В 9 мес. доля сперматозоидов с анормальной морфологией в группе I достоверно превысила контроль на 2,4 % (Р > 0,95).
Таблица 1. Качественные показатели свежеполученного семени петухов
Показатель
Контроль Группа I Группа II
(n = 4) (n = 5) (n = 5)
86,0 ± 1,6 84,0 ± 1,2 75,4 ± 1,8*/*
89,3 ± 1,1 88,2 ± 1,1 85,2 ± 2,6
7,5 ± 1,0 9,6 ± 1,2 12,4 ± 1,5*/
84,8 ± 1,3 83,0 ± 2,0 82,4 ± 2,1
88,5 ± 0,6 87,0 ± 1,9 86,6 ± 2,4
7,6 ± 0,9 10,0 ± 0,7*/ 10,8 ± 1,1*/
6 мес.
Подвижность сперматозоидов, %
Доля живых сперматозоидов, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией, %
9 мес.
Подвижность сперматозоидов, % Доля живых сперматозоидов, % Доля сперматозоидов с анормальной морфологией, %
*разница достоверна при Р > 0,95; */ разница с контролем;/* разница с группой I
и их нетрансгенные аналоги породы русская белая. Самцов размещали в индивидуальных клетках. Условия содержания и кормления петухов контрольной и опытных групп были идентичными. Эксперименты проводили в соответствии с законодательной базой с соблюдением принципов гуманного обращения с животными.
Генетическую модификацию осуществляли с использованием лентивирусного вектора. Вирусный препарат вводили в семенники взрослой птицы однократно в возрасте 3 мес. (группа I, п = 5) и двукратно в возрасте 3 и 4 мес. (группа II, п = 5). Контролем служили нетрансгенные петухи (п = 4). У птиц в возрасте 6 и 9 мес. определяли качественные показатели семени: концентрацию и подвижность сперматозои-
При двукратном введении вирусного препарата в семенники петухов (группа II) различия по изучаемым показателям с контрольной группой были более выраженными. В возрасте 6 мес. в семени птиц этой группы отмечено недостоверное снижение доли живых спермиев, по сравнению с нетрансгенными аналогами, на 4,1 % и существенное уменьшение их подвижности на 10,6 % (Р > 0,95). При этом доля сперматозоидов с анормальной морфологией возрастала на 4,9 % (Р > 0,95). В возрасте 9 мес. трансгенные петухи из группы II уступали птице в контроле по количеству живых сперматозоидов и их подвижности на 1,9 и 2,4 % соответственно. При этом доля сперматозоидов с анормальной морфологией возрастала на 3,2 % (Р > 0,95).
100%
80 60 40
20 0
Контроль Группа I Группа II
Рисунок. Влияние цикла замораживание-оттаивание на содержание сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением в эякулятах семени петухов: □ - свежеполученное семя; □ - замороженно-оттаянное семя.
Оценивая качество семени петухов групп I и II, следует отметить существенные различия по величине изучаемых показателей между самцами этих групп в возрасте 6 мес. В таком возрасте у петухов из группы II, по сравнению с самцами из группы I, отмечено незначительное снижение доли живых сперматозоидов в эякуляте на 3,0 % и достоверное уменьшение их
вых сперматозоидов. После криоконсервации их доля существенно снизилась относительно значений, установленных для свежеполученного семени, и составила в контрольной группе 41,5 %, в опытных группах I и II - 35,6 и 34,2 % соответственно (табл. 2).
У трансгенных птиц отмечено увеличение доли сперматозоидов с анормальной морфологией. У петухов контрольной группы величина этого показателя составила 10,1 %, у самцов опытных групп I и II - 14,0 и 15,2 %, что было выше значений, установленных для свежеполученного эякулята, на 2,5, 4,0 и 4,4 %, соответственно. Наибольшие отклонения отмечены в области жгутика.
Генетическая модификация сперматогенных клеток петухов оказывала влияние на криоустойчивость семени и возникновение патологических нарушений в морфологии сперматозоидов. Разница по величинам этих показателей между трансгенными петухами групп I и II была незначительной. При этом у самцов обеих опытных групп, по сравнению с петухами в контроле, отмечено снижении доли жизнеспособных клеток после криоконсервации на 6...7 % и увеличение процента сперматозоидов с анормальной морфологией на 4.5 % (Р > 0,95).
Таблица 2. Влияние цикла замораживание-оттаивание на содержание сперматозоидов с анормальной морфологией у 9-мес. петухов
Показатель Контроль (П = 4) Группа I (П = 5) Группа II (П = 5)
Свежеполученное семя
Доля живых сперматозоидов, % 88,5 ± 0,6 87,0 ± 1,9 86,6 ± 2,4
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией, 7,6 ± 0,9 10,0 ± 0,7* 10,8 ± 1,1*
всего, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 1,8 ± 0,3 2,2 ± 0,2 2,4 ± 0,5
головки, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 2,3 ± 0,3 2,8 ± 0,4 3,0 ± 0,6
средней части, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 3,5 ± 0,5 5,0 ± 0,3* 5,4 ± 0,4*
жгутика, %
Замороженно-оттаянное семя
Доля живых сперматозоидов, % 41,5 ± 1,3 35,6 ± 1,8 34,2 ± 1,9
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией, 10,1 ± 1,1 14,0 ± 1,4* 15,2 ± 1,2*
всего, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 2,3 ± 0,3 3,0 ± 0,4 3,6 ± 0,4*
головки, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 2,8 ± 0,8 3,6 ± 0,7 3,8 ± 0,2
средней части, %
Доля сперматозоидов с анормальной морфологией 5,0 ± 0,4 7,4 ± 0,9* 7,8 ± 1,2*
жгутика, %
*разница с контролем достоверна при Р > 0,95
подвижности на 8,6 % (Р > 0,95), при увеличении доли сперматозоидов с анормальной морфологией на 2,8 %. С возрастом различия нивелировались. В 9 мес. показатели качества семени трансгенных петухов в группах I и II существенно не различались, что, возможно, связано с обновлением популяции половых клеток самцов из группы II в процессе сперматогенеза. Снижение качественных показателей семени у петухов группы II в возрасте 6 мес. могло быть результатом двукратных генно-инженерных манипуляций по введению лентивирусного вектора.
В процессе эквилибрации доля живых сперматозоидов в исследованных эякулятах семени снижалась. В процессе дальнейшей криоконсервации значительно уменьшалась доля сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением. После оттаивания семени величина этого показателя снизилась у петухов контрольной группы на 46 %, I и II опытных групп - на 52 % и 49 %, соответственно (см. рисунок).
Цикл замораживание-оттаивание отрицательно влиял не только на активность, но и на количество жи-
Результаты проведенного исследования следует учитывать при получении трансгенного потомства. Для повышения результативности при осеменении самок необходим контроль качества криоконсервации половых клеток, включающий оценку замороженно-оттаянных эякулятов на количество жизнеспособных клеток и долю клеток с анормальной морфологией.
Выводы. Качество семени трансгенных петухов, по сравнению с нетрансгенными аналогами, ухудшается. Достоверные различия отмечены в группе II при двукратном введении вирусного препарата в семенники петухов. В возрасте 6 мес. у трансгенных петухов из группы II, по сравнению с их нетрансгенными аналогами, отмечено недостоверное снижение доли живых спермиев на 4,1 и существенное уменьшение их подвижности на 10,6 % (Р > 0,95). При этом доля сперматозоидов с анормальной морфологией возрастала на 4,9 % (Р > 0,95). В возрасте 9 мес. у петухов группы I не отмечено существенных различий с контролем по подвижности и доле живых сперматозоидов в исследованных эякулятах семени, а по доле анормальных
сперматозоидов разница достигала 3,2 %. Различия по изучаемым показателям между контролем и группой I (однократное введение вирусного препарата) не превышали 2,4 % как в возрасте 6 мес., так и 9 мес. При этом независимо от способа введения лентивирусного
вектора у трансгенных петухов семя характеризовалось более низкой криоустойчивостью. В процессе криоконсервации семени доля живых сперматозоидов после оттаивания в опытных группах снижалась на 51...52 %, в то время как в контроле - на 47 %.
Литература.
1. Brinster R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 2002. Vol. 296. P. 2174-2176. doi: 10.1126/ science.1071607.
2. Dobrinski I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Anim. Reprod. Sci. 2005. Vol. 89. P. 137-145. doi: 10.1016/j.anireprosci.2005.06.020.
3. Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cells /J. Kalina, F. Senigl, A. Micakova, et al.// Reproduction. 2007. Vol. 134 (3). P. 445-453. doi: 10.1530/rep-06-0233.
4. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells/ J. Macdonald, J. D. Glover, L. Taylor, et al. // PLoS ONE. 2010. Vol. 5. P. e15518. doi: 10.1371/journal.pone.0015518.
5. A new method for producing transgenic birds via direct in vivo transfection of primordial germ cells / S. G. Tyack, K. A. Jenkins, T. E. O'Neil, et al. // Transgenic Res. 2013. Vol. 22 (6). P. 1257-1264. doi: 10.1007/s11248-013-9727-2.
6. Naito M., Harumi T., Kuwana T. Long term in vitro culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and incorporation into germline of recipient embryo. J. Poult. Sci. 2010. Vol. 47 (1). P. 57-64. doi: 10.2141/jpsa.009058.
7. Spermatogonial stem cells from domestic animals: Progress and prospects / Y. Zheng, Y. Zhang, R. Qu, et al. // Reproduction. 2014. Vol. 147. P. 65-74. doi: 10.1530/REP-13-0466.
8. McLean D. J. Spermatogonial stem cell transplantation and testicular function. Cell Tissue Res. 2005. Vol. 322 (1). P. 21-31. doi 10.1007/s00441-005-0009-z.
9. Transgenic sperm produced by electrotransfection and allogeneic transplantation of chicken fetal spermatogonial stem cells / F. Yu, L. J. Ding, G. B. Sun, et al. //Mol. Reprod. Dev. 2010. Vol. 77. P. 340-347. doi: 10.1002/mrd.21147.
10. Efficient generation of transgenic chickens using the SSCs in vivo and ex vivo transfection / B. Li, G. Sun, H. Sun, et al.// Science in China Series C: Life Sciences. 2008. Vol. 51 (8). P. 734-742. doi: 10.1007/s11427-008-0100-2.
11. Optimization of conditions for recombinant DNA injection into spermatogenic cells of the chicken in vivo / N. A. Volkova, L. А. Volkova, I. K. Fomin, et al. //Agricultural Biology. 2012. Vol. 6. P. 56-60. doi: 10.15389/agrobiology.2012.6.56eng.
12. Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo / S. Min, S. Q. Qing, Y. Y. Hui, et al.//African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10 (70). P. 15678-15683. doi: 10.5897/AJB11.040.
13. Amann R., Pickett B. Principles of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. J. Equine Vet. Sci. 1987. Vol. 7 (3). P. 145-173. doi: 10.1016/S0737-0806(87)80025-4.
14. Криоконсервация семени петухов: основные принципы и методические подходы/И. П. Новгородова, М. А. Жилинский, Н. А. Волкова и др. // Птицеводство. 2016. № 8. C. 2-7.
15. Recent advances in bird sperm morphometric analysis and its role in male gamete characterization and reproduction technologies / J. Santiago-Moreno, M. C. Esteso, S. Villaverde-Morcillo, et al. //Asian J Androl. 2016. Vol. 18 (6). P. 882-888. doi: 10.4103/1008-682X.188660.
16. Effect of freeze-thawing procedure on chromatin stability, morphological and membrane integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men / M. E. Hammadeh, A. S. Askari, T. Georg, et al. // Int. J. Androl. 1999. Vol. 22. P. 155-162. doi:10.1046/j.1365-2605.1999.00162.x.
17. Cryopreservation in different concentrations of glycerol alters boar sperm and their membranes / M. M. Buhr, P. Fiser, J. L. Bailey, et al. //Androl. 2001. Vol. 22. P. 961-969. doi:10.1002/j.1939-4640.2001.tb03436.x.
References
1. Brinster RL. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 2002;296:2174-6. doi: 10.1126/science.1071607.
2. Dobrinski I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Anim. Reprod. Sci. 2005;89:137-45. doi: 10.1016/j.anireprosci.2005.06.020.
3. Kalina J, Senigl F, Micakova A, et al. Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cell. Reproduction. 2007;134(3):445-53. doi: 10.1530/rep-06-0233.
4. Macdonald J, Glover JD, Taylor L, et al. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS ONE. 2010;5:e15518. doi: 10.1371/journal.pone.0015518.
5. Tyack SG, Jenkins KA, O'Neil TE, et al. A new method for producing transgenic birds via direct in vivo transfection of primordial germ cells. Transgenic Res. 2013;22(6):1257-64. doi: 10.1007/s11248-013-9727-2.
6. Naito M, Harumi T, Kuwana T. Long term in vitro culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and incorporation into germline of recipient embryo. J. Poult. Sci. 2010;47(1):57-64. doi: 10.2141/jpsa.009058.
7. Zheng Y, Zhang Y, Qu R, et al. Spermatogonial stem cells from domestic animals: Progress and prospects. Reproduction. 2014;147:65-74. doi: 10.1530/REP-13-0466.
8. McLean DJ. Spermatogonial stem cell transplantation and testicular function. Cell Tissue Res. 2005;322(1):21-31. doi 10.1007/ s00441-005-0009-z.
9. Yu F, Ding LJ, Sun GB, et al. Transgenic sperm produced by electrotransfection and allogeneic transplantation of chicken fetal spermatogonial stem cells. Mol. Reprod. Dev. 2010;77:340-7. doi: 10.1002/mrd.21147.
10. Li B, Sun G, Sun H, et al. Efficient generation of transgenic chickens using the SSCs in vivo and ex vivo transfection. Science in China Series C: Life Sciences. 2008;51(8):734-42. doi: 10.1007/s11427-008-0100-2.
11. Volkova NA, Volkova LA, Fomin IK, et al. Optimization of conditions for recombinant DNA injection into spermatogenic cells of the chicken in vivo. Agricultural Biology. 2012;6:56-60. doi: 10.15389/agrobiology.2012.6.56eng.
12. Min S, Qing SQ, Hui YY, et al. Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo. African Journal of Biotechnology. 2011;10(70):15678-83. doi: 10.5897/AJB11.040.
13. Amann R, Pickett B. Principles of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. J. Equine Vet. Sci. 1987;7(3):145-73. doi: 10.1016/S0737-0806(87)80025-4.
14. Novgorodova IP, Zhilinskii MA, Volkova NA, et al. Kriokonservatsiya semeni petukhov: osnovnye printsipy i metodicheskie podkhody [Roosters' semen cryopreservation: basic principles and methodological approaches]. Ptitsevodstvo. 2016;8:2-7. Russian.
15. Santiago-Moreno J, Esteso MC, Villaverde-Morcillo S, et al. Recent advances in bird sperm morphometric analysis and its role in male gamete characterization and reproduction technologies. Asian J Androl. 2016;18(6):882-8. doi: 10.4103/1008-682X.188660.
16. Hammadeh ME, Askari AS, Georg T, et al. Effect of freeze-thawing procedure on chromatin stability, morphological and membrane integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men. Int. J. Androl. 1999;22:155-62. doi:10.1046/j.1365-2605.1999.00162.x.
17. Buhr MM, Fiser P, Bailey JL, et al. Cryopreservation in different concentrations of glycerol alters boarsperm and their membranes. Androl. 2001;22:961-9. doi:10.1002/j.1939-4640.2001.tb03436.x.
