CC BY
46
УДК 577.1-02:615.322-451.16]-092.9(045)
ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ МЫШЕЙ-САМЦОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ НА НИХ ЭКСТРАКТА ЧИСТОТЕЛА БОЛЬШОГО
© 2010 г. М.П. Чомаев1, А.А. Свистунов2, В.Б. Бородулин2, И.А. Горошинская3
1Саратовская областная клиническая больница, Смирновское ущелье, д.1, г. Саратов, 410001
2Саратовский государственный медицинский университет, ул. Большая Казачья, 112, г. Саратов, 410012, meduniv@sgmu. т
3Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, rnioi@list.ru
1Saratov Regional Clinical Hospital, Smirnovskoe ushelie, 1, Saratov, 410001
2Saratov State Medical Univercity, B. Kazachja St., 112, Saratov, 410012, meduniv@sgmu.ru
3Rostov Cancer Research Institute, 14 liniya, 63, Rostov-on-Don, 344037,
rnioi@list.ru
Изучено действие экстракта чистотела на основные биохимические показатели белых беспородных мышей-самцов.
Ключевые слова: экстракт чистотела большого, ферменты сыворотки крови, метаболиты сыворотки крови.
In the given work the action of an extract Chelidonium majus on the basic biochemical parameters of white not purebred mices was studied. Keywords: extract of Chelidonium majus, serum blood enzymes, metabolits of serum.
Алкалоиды чистотела большого оказывают болеутоляющее и бактерицидное действие. Сок чистотела применяют для прижигания бородавок, кандилом, для лечения полипоза кишечника. Настойки Chelidonium та^ используют при заболеваниях печени и желчного пузыря. В народной медицине чистотел используется при желтухе, подагре, как мочегонное, слабительное и анестезирующее средство; при язвах, ранах, кожных заболеваниях [1]. Исследование изменений биохимических показателей у белых беспородных мышей-самцов при действии на них экстракта чистотела большого проводили на сборе чистотела большого в районе Кумысной поляны г. Саратова. Сбор проводили в начале цветения (май), так как именно в этот период в растении содержится наибольшее количество алкалоидов [2]. Собранные растения подвергали естественной сушке в тени. Отделяли листья и измельчали в фарфоровой ступке. Для получения водного экстракта навеску растительного материала 1 г заливали 10 мл дисти-лированной воды. Экстракция осуществлялась в течение 15 мин при температуре 80 °С.
Методика количественного определения суммы алкалоидов в настойке чистотела состояла в следующем.
20 мл настойки чистотела помещают в круглодон-ную колбу вместимостью 100 мл и упаривают под вакуумом на ротационном испарителе до 1/4 исходного объема. Полученный остаток количественно переносят в делительную воронку вместимостью 50-100 мл, прибавляют 8 мл 25%-го раствора аммиака и алкалоиды трижды извлекают хлороформом (порциями по 20, 20 и 10 мл соответственно). Объединенные хлороформные извлечения дважды обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты в делительной воронке вместимостью 50-100 мл порциями по 20 мл. К объединенным сернокислым извлечениям прибавляют 8 мл 25%-го раствора аммиака. Основания алкалоидов вновь трижды
экстрагируют хлороформом в делительной воронке вместимостью 50-100 мл порциями по 20, 20 и 10 мл соответственно. Объединенные хлороформные извлечения переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 и 250 мл и отгоняют хлороформ досуха под вакуумом.
Сухой остаток количественно переносят в стакан для титрирования последовательно с помощью 5 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл ацетонитрила и титрируют потенциометрически раствором хлорной кислоты (0,05 моль/л). Параллельно проводят контрольный опыт.
Массовую долю Х, %, суммы алкалоидов в пересчете на сангвинарин и хелеретрин в препарате вычисляют по формуле:
X = (У-У1У0,01765-100 .
40
где 0,01765, г - количество суммы алкалоидов в пересчете на сангвинарин и хелеретрин, соответствующее 1 мл раствора хлорной кислоты (0,05 моль/л); V, мл -объем хлорной кислоты (0,05 моль/л), пошедшей на титрирование суммы алкалоидов; VI, мл - объем хлорной кислоты (0,05 моль/л) на титрирование в контрольном опыте.
Разработанная методика была апробирована на 5 образцах настойки чистотела, заложенных на хранение для изучения стабильности содержания алкалоидов и других показателей качества данного препарата. При этом содержание суммы алкалоидов в настойке колеблется в пределах 1 %.
Произведем подсчет концентрации алкалоидов (по всей вероятности сангвинарина и хелеретрина), содержащихся в экстракте чистотела. Поскольку навеска составляла 1 г, а количество алкалоидов - 1 %, легко рассчитать количество алкалоидов в х 1 г травы чистотела большого: х = 1-1/100 = 10~2 г.
Известно, что молярная масса сангвинарина составляет 353 г/моль, а хелеретрина - 367 г/моль. Можно рассчитать концентрацию алкалоидов в 10 мл растворителя (исходный объем растворителя для экстракта чистотела большого). Усредним молярные массы сангвинарина и хелеретрина: (353 + 367)/2 = 360 г/моль.
1
г =■
М Vn
где СМ - концентрация алкалоидов,
моль/л; т - масса алкалоида, г; М - молярная масса алкалоидов, г/моль; У0 - объем используемого растворителя, л.
КГ2 1
г =-
СМ
<2,8-1(Г3 моль/л.
360 1(Г2
Такая концентрация алкалоидов обнаруживается в 10 мл раствора, приготовленного описанным выше методом.
Контрольные и экспериментальные группы животных формировали из самцов. Возраст животных составлял 3-4 мес., вес - 20±3 г. Рассмотрено 5 групп (1 контрольная и 4 экспериментальных). Каждая включала 5 животных.
Животным 1-й группы перорально вводили экстракт чистотела в объеме 25 мкл, 2-й группе - в объеме 50, 3-й - 100, 45-й - 150 мкл. Животные контрольной группы не подвергались никаким воздействиям. Дозы вводили в течение 7 дней.
В клинико-лабораторных исследованиях анализировалась сыворотка крови. Для этого в ходе процедуры декапитации собиралась смешанная кровь с горлового среза в сухую чистую пробирку без использования антикоагулянтов. Для ускоренного образования кровяного тромба пробирку со смешанной кровью помещали на 10 мин в термостат с температурой 37 °С. Затем, используя тонкую стеклянную палочку, тромб аккуратно отделяли от стенок пробирки. После этого пробирку помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 10 мин. Полученную сыворотку переносили в сухую чистую пробирку и использовали для дальнейшего проведения клинико-лабораторного исследования.
Для этого использовали прибор «ИоБрИех» - полуавтоматический анализатор, включающий фотометр, микропроцессор, в котором запрограммирован алгоритм проведения 60 биохимических тестов, инкубатор, обеспечивающий температуру +37 °С. Все определения биохимических параметров проводили по конечной точке.
Прибор представляет собой спектрофотометр со стандартным набором реагентов, предназначенных конкретно для определения одного из изучаемых биохимических параметров крови: глюкозы, общего белка, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), мочевины, щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АдАТ), креатинина, холестерина, у-глутамилтрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактата, альбумина, а-амилазы, креатинкиназы (КК). Методы являются унифицированными [3].
Препарат применяли в дозах, рекомендованных Фармакологическим комитетом [4]: 25, 50, 100 и 150 мкл. При
введении животному дозы, превышающей 150 мкл, наблюдали токсическое действие экстракта: тошноту, рвоту.
Результаты исследований
Для оценки влияния экстракта на ткани печени, почек, поджелудочной железы, сердца in vivo было проведено определение активности трансаминаз в сыворотке крови белых мышей.
В контрольной группе животных активность АлАТ в сыворотке крови составила 50 ед./л. Экстракт в дозах 25, 50, 100, 150 мкл вызывает увеличение активности АлАТ в сыворотке крови мышей. По степени увеличения активности АлАТ в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (580 %) > 100 мкл (420 %) > 50 мкл (240 %) > 25 мкл (200 %).
В контрольной группе животных АсАТ сыворотки крови составила 120 ед./л. Экстракт в дозе 25 мкл не вызывал достоверных изменений активности АсАТ; в дозах 50 и 150 мкл отмечено увеличение активности АсАТ до 330 и 490 % от контрольной величины; в дозе 100 мкл наблюдалось самое большое увеличение активности АсАТ - до 816 %.
В контрольной группе животных активность КК сыворотки крови составила 129 ед./л. По степени увеличения активности КК в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (1300 %) > 100, 50 мкл (387 %) > 25 мкл (321 %).
Таким образом, по активности АлАТ и АсАТ можно предположить, что наибольший вклад в увеличение активности этих ферментов сыворотки крови вносят клетки печени.
В контрольной группе животных активность амилазы сыворотки крови составила 1444 ед./л. Самая высокая - 149 % от контроля - наблюдается после введения экстракта в дозе 150 мкл. При введении 25, 50 и 100 мкл активность амилазы уменьшается. Полученные экспериментальные данные показывают, что экстракт во всех 4 дозах оказывает влияние на панкреатические клетки.
В контрольной группе животных активность ГГТ составила 27 ед/л. Экстракт во всех 4 дозах вызывал увеличение активности ГГТ в сыворотке крови. По степени увеличения активности ГГТ в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (370 %) > 100 мкл (296 %) > 50, 25 мкл (222 %).
Необходимо отметить, что для всех доз экстракта установлено увеличение содержания азотистых продуктов белкового обмена (креатинина) и для 150 мкл экстракта увеличение мочевины. Для доз 25 и 50 мкл отмечено пониженное содержание мочевины, для 100 мкл достоверных отличий от контроля не выявлено. По степени содержания креатинина в сыворотке крови в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (3017 %) > 100 мкл (2125 %) > > 50 мкл (1162 %) > 25 мкл (737 %).
Повышение уровня креатинина и мочевины крови -признак почечной недостаточности. В то же время определение содержания креатинина - более надежный тест, так как повышение его концентрации в крови
происходит раньше, чем повышение концентрации мочевины. Образование креатинина не связано с метаболизмом экзогенного белка, в то время как мочевина -основная катаболическая форма белка пищи. Мочевина образуется в печени, фильтруется гломерулярным фильтром и активно реабсорбируется в тубулярные части нефрона, поэтому содержание мочевины в крови зависит не только от нефрогенных факторов.
Проведенные исследования показали, что содержание альбумина в сыворотке крови не отличается от контроля, а содержание общего белка незначительно увеличивается после введения животным 100 и 150 мкл экстракта.
Нами была определена активность ЩФ в сыворотке крови контрольных животных, которая составила 396 ед./л.
Экстракт чистотела в дозах 50 и 100 мкл не вызывал достоверного отличия от контрольной величины, а в дозах 25 и 150 мкл активность ЩФ в сыворотке крови увеличивалась до 134 и 194 % от контроля соответственно.
В клинической биохимии активность ЩФ сыворотки часто используют в диагностике патологии ге-патобилиарной системы и костной ткани. Активность ЩФ сыворотки крови часто повышена при обструк-тивных заболеваниях печени, холестазе, гепатите, явлениях гепатотоксичности [5].
Проводили определение еще одного биохимического теста - активности ЛДГ в сыворотке крови. У животных контрольной группы ЛДГ составила 2301 ед./л. 25, 50 и 100 мкл экстракта не оказывают достоверного влияния на активность ЛДГ в сыворотке крови мышей. Доза 150 мкл вызывает повышение активности ЛДГ до 276 % по сравнению с контролем (100 %), ЛДГ - цин-ксодержащий фермент, обратимо катализирующий окисление лактата в пируват, участвует в окислении лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты), ЛДГ оптимизирована природой для превращения пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень), ее активность в сыворотке крови - чувствительный индикатор гепатоцел-люлярного поражения [5].
С целью тестирования степени повреждающего действия экстракта чистотела проведено исследование содержания глюкозы в крови как чувствительного показателя выраженности деструктивных процессов в ткани поджелудочной железы. В контрольной группе животных содержание глюкозы в сыворотке крови составило 5,5 ммоль/л. Экстракт в дозах 25 и 50 мкл не оказывал достоверного влияния на содержание глюкозы в сыворотке крови, в дозах 100 и 150 мкл - повышал содержание глюкозы до 152 и 248 % соответственно по сравнению с контролем (100 %).
Поступила в редакцию_
В контрольной группе животных содержание лак-тата в сыворотке крови составило 5,5 ммоль/л. По степени его увеличения в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 50 мкл (260 %) > 100 мкл (246 %) > 150 мкл (200 %) > 25 мкл (148 %).
В результате проведенных исследований обнаружено повышение активности ферментов, локализованных преимущественно в печени (АсАТ, АлАТ, ГГТ, ЩФ). Это может быть результатом повышения проницаемости клеточных мембран под действием экстракта чистотела большого. Биосинтетическая функция печени при этом не нарушается, так как содержание альбумина остается в норме. Увеличение содержания креатинина в сыворотке крови говорит о влиянии экстракта чистотела большого на функции почек. Обнаруженные изменения содержания глюкозы и лактата в сыворотке крови свидетельствуют о развитии гипоксического состояния. При этом основным путем превращения глюкозы становится анаэробный гликолиз, идущий с накоплением молочной кислоты.
При анализе внутренних органов, извлеченных из мышей, которые получали 100 мкл экстракта чистотела в разведении 1:10 и 1:100 от исходного раствора, обнаруживаются изменения как в размере органа, так и в его консистенции и цвете.
Происходит увеличение в размерах поджелудочной железы. Увеличивается размер печени. Изменяется консистенция и ее цвет. Этот орган становится темно-вишневого цвета, рыхлый на ощупь, что по всей вероятности указывает на застойные и цитоли-тические явления в нем. Почки также увеличиваются в размерах. Таким образом, экстракт чистотела действует на все основные органы белых беспородных мышей, изменяя их метаболизм, что отражается как на изменении биохимических показателей, так и на морфологии ткани органов.
Литература
1. Лекарственные растения в научной и народной медици-
не / Б.Г. Волынский [и др.]. Саратов, 1978. 360 с.
2. Изменчивость качественного и количественного состава
алкалоидов чистотела большого в течение вегетации
/ Г.Н. Бузук [и др.] // Хим.-фарм. журн. 1990. Т. 4, № 5.
С. 50-53.
3. Лабораторные методы исследования в клинике
/ В.В. Меньшиков [и др.]. М., 1987. 386 с.
4. Методические рекомендации по оценке иммунотоксиче-
ских свойств фармакологических средств / Г.П. Кудрина [и др.]. М., 1992. 385 с.
5. Клиническая биохимия / А.П. Добровольский [и др.].
М., 2002. 360 с.
18 февраля 2009 г.
