13https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-03-07
Изменение биогенеза митохондрий в ткани головного мозга у животных в условиях церебральной ишемии
Д.И. Поздняков, доцент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии,
ORCID 0000-0002-5595-8182; А.В. Мамлеев, доцент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии,
ORCID 0000-0001-9657-2246; К.Х. Саркисян, доцент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии,
ORCID 0000-002-1756-0026 Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО Волгоградский государственный медицинский университет (357532, Россия, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)
Е- mail: pozdniackow.dmitry@yandex. ru
Резюме. Митохондриальная дисфункция представляет собой универсальный патогенетический механизм, играющий существенную роль в ишемическом повреждении головного мозга. В то же время изучение митохондри-ального биогенеза позволит значительно улучшить эффективность целенаправленного терапевтического воздействия на митохондрии клетки.
Цель исследования. Оценить изменение митохондриального биогенеза в ткани головного мозга крыс в условиях перманентной фокальной ишемии.
Материал и методы. Церебральную ишемию моделировали у крыс-самцов путем необратимой правосторонней коагуляции средней мозговой артерии. Митохондриальный биогенез оценивали по изменению активности сук-цинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы у крыс в динамике спектрофотометрическим методом. Также у крыс определяли изменение величины зоны некроза головного мозга по степени восстановления формазана трифенил-тетразолия хлористого.
Результаты. Проведенное исследование показало, что наиболее выраженные изменения активности сукцинат-дегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы отмечены спустя 72 ч с момента моделирования ишемии. При этом в сравнении с ложнооперированными животными активность ферментов уменьшилась на 53,1% (р<0,05) и 60% (р<0,05) соответственно. Стоит отметить, что изменение ферментативной активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы коррелировало с увеличением зоны некроза головного мозга со значениями коэффициентов корреляции г=0,71324 и г=0,83629 соответственно.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, митохондриальная дисфункция, митохондриальный биогенез.
Для цитирования: Поздняков Д.И., Мамлеев А.В., Саркисян К.Х. Изменение биогенеза митохондрий в ткани головного мозга у животных в условиях церебральной ишемии. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 03: 58-62. https://doi.org/10/29926/2618723X-2021-03-07
Changes in the biogenesis of mitochondria in brain tissue in animals under conditions of cerebral ischemia
Pozdnyakov D. I., Associate professor of the Department of Pharmacology with a course of clinical pharmacology
(the author responsible for correspondence), ORCID 0000-0002-5595-8182; Mamleev A.V., Associate Professor of the Department of Pharmacology with the course of clinical Pharmacology,
ORCID 0000-0001-9657-2246; Sarkisyan K. H., Associate Professor of the Department of Pharmacology with the course of Clinical Pharmacology,
ORCID 0000-002-1756-0026 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute-branch of the Volga State Medical University 357532, Russia, Stavropol Territory, 11 Kalinin Ave., Pyatigorsk Е-mail: [email protected]
Abstract. Mitochondrial dysfunction is a universal pathogenetic mechanism that plays an essential role in ischemic brain damage. At the same time, the study of mitochondrial biogenesis will significantly improve the effectiveness of targeted therapeutic effects on the mitochondria of the cell.
2021 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE №3
®
The aim of the study was to evaluate changes in mitochondrial biogenesis in rat brain tissue under conditions of permanent focal ischemia.
Material and methods. Cerebral ischemia was modeled in male rats by irreversible right-sided coagulation of the middle cerebral artery. Mitochondrial biogenesis was assessed by changes in the activity of succinate dehydrogenase and cytochrome-c oxidase in rats in the dynamics by the spectrophotometric method. Also, in rats, the change in the size of the brain necrosis zone was determined by the degree of recovery of formazan triphenyltetrazolium chloride.
Results. The study showed that the most pronounced changes in the activity of succinate dehydrogenase and cyto-chrome-c oxidase were noted 72 hours after the simulation of ischemia. At the same time, in comparison with sham-operated animals, the activity of enzymes decreased by 53.1% (p<0.05) and 60% (p<0.05), respectively. It is worth noting that changes in the enzymatic activity of succinate dehydrogenase and cytochrome-c oxidase correlated with an increase in the brain necrosis zone with the values of correlation coefficients r=0.71324 and r=0.83629, respectively.
Key words: brain ischemia, mitochondrial dysfunction, mitochondrial biogenesis
For citation: Pozdnyakov D.I., Mamleev A.V., Sarkisyan K.H. Changes in the biogenesis of mitochondria in brain tissue in animals under conditions of cerebral ischemia. Laboratory Animals for Science. 2021; 03: 58-62. https://doi.org/10/29926/2618723X-2021-03-07
Введение
Ишемический инсульт - заболевание с высоким уровнем летальности и инвалидизации населения. Ежегодно отмечается >50 млн случаев инсульта, из которых 6 млн оказываются летальными в острой фазе заболевания [1]. Во многом значимая медико-социальная и экономическая роль ишемиче-ского инсульта связана со сложным патогенезом данного состояния, который вовлекает целый каскад взаимосвязанных реакций. На сегодняшний день установлено, что весомой составляющей патогенеза церебральной ишемии является митохон-дриальная дисфункция, которая непосредственно связана с нарушением оптимального хода метаболических реакций, индукцией окислительного стресса, апоптоза и нейровоспаления [2]. Во многом негативные сдвиги, опосредующие развитие дисфункции митохондрий, связаны с нарушением их биогенеза. Известно, что в условиях ишемии клетки, испытывающие дефицит кислорода, не способны синтезировать достаточное количество белка, в том числе и митохондриального, что ведет к снижению интенсивности репаративных процессов в митохондриальной мембране и уменьшению синтеза митохондрий de novo [3]. Основными маркерами митохондриального биогенеза является изменение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы. Сукцинатдегидрогеназа как составляющая цикла Кребса окисляет сукцинат до фумарата и как компонент митохондриальной дыхательной цепи - убихинон до убихинола [4]. Цитохром-с-оксидаза - терминальная оксидаза митохондриальной дыхательной цепи, катализирующая реакцию переноса электронов от ферроци-
тохрома С к молекулярному кислороду, создающая электрохимический градиент, необходимый для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) [5]. Несмотря на то, что существенная роль изменения функциональной активности митохондрий в патогенезе ишемического инсульта не вызывает сомнений, временной промежуток развития митохондри-альной дисфункции при ишемии головного мозга в настоящее время не установлен, тогда как определение начала деструктивных процессов в «энергетических станциях» позволит оптимизировать стратегии нейропротекторной терапии.
Цель исследования - оценить изменение митохондриального биогенеза в ткани головного мозга крыс в условиях перманентной фокальной ишемии.
Материал и методы
Исследование выполнено на 160 крысах-самцах линии Wistar, которые были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» и на время исследования содержались в контролируемых условиях вивария в соответствии с требованиями ARRIVE 2.0 [6]. Ишемию головного мозга моделировали путем постоянной окклюзии средней мозговой артерии под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг, внутрибрюшинно), как описано A. Tamura и соавт. [7]. У ложнооперированных (ЛО, n=20) животных использовали все последовательные процедуры, за исключением коагуляции артерии. Активность митохондриального биогенеза оценивали через 6, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч с момента ишемии. Количество животных в каждой контрольной точке равнялось 20 особям. В качестве биоматериала брали головной мозг экспериментальных животных. 10 крыс из группы декапитиро-
Время ишемии, ч — СОХ -СДГ
Рис. 1. Изменение активности сукцинатдегидро-геназы и цитохром-с-оксидазы в головном мозге у крыс в условиях церебральной ишемии в динамике. СДГ - сукцинатдегидрогеназа; СОХ - ци-тохром-с-оксидаза; * - статистически достоверно относительно животных ЛО
40 -35 -
£ 30 " я 25 -
О
20-
х 15 " о
т 10 -5 -0
ЛО 6 12 24 48 72 96 120
Время ишемии, ч
Рис. 2. Изменение величины зоны некроза мозга у крыс в условиях церебральной ишемии в динамике. * - статистически достоверно относительно показателя зоны некроза мозга на 3-й день после моделирования ишемии
вали под хлоралгидратнои анестезиеи, извлекали головной мозг, который гомогенизировали в фос-фатно-солевом буфере (рН 7,4). Митохондриальную фракцию получали путем дифференциального центрифугирования в градиенте 10% перколла [8]. Активность цитохром-с-оксидазы определяли в ми-тохондриальной фракции по изменению оптической плотности среды реакции окисления ци-тохрома С (II) в присутствии KCN при 500 нм [9]. Активность сукцинатдегидрогеназы оценивали спектрофотометрически в реакции сукцинатзави-симого восстановления дихлорфенолиндофенола при добавлении в анализируемую среду ротенона при 600 нм [10]. Оптическую плотность смесей регистрировали на спектрофотометре ПРОМЭКОЛАБ ПЭ-5300В в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Активность ферментов выражали в Единицах на 1 мг белка. Концентрацию белка в анализируемом образе оценивали по методу Бредфорда в реакции аминокислотных остатков с красителем Coomasie Brilliant Blue (кумасси голубой). Изменение зоны некроза оценивали у 10 оставшихся животных из группы, используя трифенилтетразолиевый метод [11]. Полученные результаты статистически обрабатывали и выражали в виде M±SEM (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). Сравнение средних осуществляли методом одно-факторного дисперсионного анализа с постобработкой тестом Ньюмена-Кейлса при уровне значимости p<0,05. Корреляционный анализ выполнен по Спирмену. Статистическую обработку данных проводили в прикладном программном пакете Statistica 6.0 (Statsoft, США).
Результаты
В ходе исследования было установлено, что активность сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-ок-сидазы у животных ЛО составляла 3,2±0,2 и 1,5±0,4
Ед на 1 мг белка (рис. 1). У крыс с ишемией головного мозга через 6 ч с момента воспроизведения ишемического повреждения головного мозга отмечено снижение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы в сравнении с аналогичными показателями животных ЛО на 15,6% (р<0,05) и 13,3% (р<0,05) соответственно. В дальнейшем у ишемизированных крыс отмечалось прогрессирующее уменьшение ферментативной активности ци-тохром-с-оксидазы и сукцинатдегидрогеназы. Так, через 12 ч ишемии активность сукцинатдегидрогеназы снизилась на 25% (р<0,05), цитохром-с-окси-дазы - на 26,6% (р<0,05). Спустя сутки ишемического периода активность митохондриальных энзимов цитохром-с-оксидазы и сукцинатдегидрогеназы уменьшилась по отношению к группе крыс ЛО на 26,1% (р<0,05) и 27,8% (р<0,05) соответственно, аналогично спустя 48 ч активность ферментов снизилась на 40,0% (р<0,05) и 35,5% (р<0,05) соответственно. Наибольшее падение ферментативной активности отмечено на 3-й день исследования, когда активность цитохром-с-оксидазы уменьшилась относительно группы животных ЛО на 60% (р<0,05), сукцинатдегидрогеназы - на 53,1% (р<0,05). На 4-й и 5-й день исследования активность ферментов митохондриального происхождения имела тенденцию к увеличению, при этом активность ци-тохром-с-оксидазы была ниже относительно показателя крыс ЛО на 40,1% (р<0,05) и 26,2% (р<0,05) соответственно, а сукцинатдегидрогеназы - на 40,6% (р<0,05) и 27,2% (р<0,05) соответственно.
Оценка изменения зоны некроза головного мозга показала, что по мере увеличения ишемиче-ского периода с 6 до 72 ч отмечается неуклонный рост некротического очага, когда зона некроза мозга у животных с ишемией составляла 33,2%. В дальнейшем рост области инфаркта мозга не отмечался (рис. 2).
3433, 33,6 33,4£ 33,2
8 33 I 32,8 ■ « 32,6 й 32,432,2 32 31,831,6
и
..... .......
5
...
о Corellation: г = 0.83629
•••
—
0,44 0,46 0,48 0,5 0,52 0,54 0,56 0,58 0,6 0,62 0,64 0,66 0,68 0,7 0,72 0,74 СОХ, Ед на 1 мг белка
Рис. 3. Корреляционная зависимость между изменением активности цитохром-с-оксидазы и зоны некроза мозга у крыс
34 -|
33,8 33,6 33,4 2S 33,2 33
I 32,8 | 32'6
т 32,4 32,2 32 31,8 31,6
о *" О
-•"'о
.-о *'.........
.........X у'..... Corellation: г = 0,71324 ;
о/
1,36 1,38 1,4 1,42 1,44 1,46 1,48 1,5 1,52 1,54 1,56 1,58 СДГ, Ед на 1 мг белка
Рис. 4. Корреляционная зависимость между изменением активности сукцинатдегидрогеназы и зоны некроза мозга у крыс
Учитывая, что максимальные изменения не только маркеров митохондриального биогенеза, но и величины зоны инфаркта мозга отмечены через 72 ч с момента воспроизведения ишемии, корреляции рассчитывали между результатами, полученными на 3-й день исследования. Проведенный корреляционный анализ показал, что имеется сильная корреляция (рис. 3) между величиной некротического очага и снижением активности цитохром-с-ок-сидазы (г=0,83629).
Также умеренная корреляционная зависимость выявлена между уменьшением активности сукцинатдегидрогеназы (рис. 4) и увеличением зоны некроза мозга (г=0,71324).
Обсуждение
Митохондрии - клеточные органеллы, чрезвычайно чувствительные к дефициту кислорода и субстратов окисления. Однако в условиях ишемии могут активироваться репаративные процессы, где в ходе последовательных реакций митофагии/био-генеза дефектные митохондрии заменяются на нормальной функционирующие, что чрезвычайно важно для сохранения жизнеспособности непролифера-тивных нейронов [12]. Проведенное исследование показало, что по мере прогрессирования ишемиче-ского процесса с 6 до 72 ч наблюдается стойкое снижение митохондриального биогенеза, сопровождаемое увеличением зоны некроза мозга, что может быть связано с критическим снижением синтеза АТФ и инициацией апоптотической программы в нейронах ишемической «пенумбры» [13]. На пике наблюдаемых изменений (72 ч с момента индукции ишемии) отмечалась стойкая корреляционная зависимость между изменениями зоны инфаркта мозга и маркерами митохондриального биогенеза - активностью цитохром-с-оксидазы и сук-цинадегидрогеназы, причем более сильная
корреляция установлена в случае цитохром-с-окси-дазы, что, вероятно, связано с многогранной ролью данного энзиматического комплекса в совокупной митохондриальной функции, включая регуляцию апоптоза и продукции активных форм кислорода. В дальнейшем процессы митохондриального биогенеза стабилизировались и несколько увеличились, отражая активацию компенсаторных биогенетических процессов, зависимых от 1а-коактиватора у-рецептора, активируемого пролифератором пе-роксисом (Р60-1а), на уровне генома, регулирующего экспрессию митохондриального белка [14].
Заключение
Данные, полученные в ходе исследования, позволяют говорить о снижении митохондриального биогенеза в мозговой ткани при увеличении зоны некротического очага с пиком спустя 72 ч ишемиче-ского периода и последующим восстановлением биогенетических процессов митохондрий.
Сокращения
СОХ - цитохром-с-оксидаза;
СДГ - сукцинатдегидрогеназа;
АТФ - аденозинтрифосфат;
ЛО- ложнооперированные животные
Р00-1а - 1а ко-активатор у рецептора, активируемого пролифератором пероксисом
Вклад авторов
Д.И. Поздняков - разработка концепции исследования, проведение экспериментов, написание рукописи.
А.В. Мамлеев - постановка экспериментов, сбор данных, участие в анализе результатов
К.Х. Саркисян - статистическая обработка данных, подготовка конченого варианта рукописи и ее критическая оценка.
Сведения о конфликте интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflicts of interest.
Литература
1. Rabinstein A.A. Update on Treatment of Acute Ischemic Stroke // Continuum (Minneap Minn). 2020. Vol.26. №.2. P. 268-286.
2. Yang J.L., Mukda S., Chen S.D. Diverse roles of mitochondria in ischemic stroke // Redox Biol. 2018. Vo.16. P. 263-275.
3. Andrabi S.S, Parvez S., Tabassum H. Ischemic stroke and mitochondria: mechanisms and targets // Protoplasma. 2020. Vol.257. № 2. P.335-343.
4. Huang S., Millar A.H. Succinate dehydrogenase: the complex roles of a simple enzyme // Curr Opin Plant Biol. 2013. Vol.16. № 3. P.344-349.
5. Rak M., Bénit P., Chrétien D. Mitochondrial cytochrome c oxidase deficiency // Clin Sci (Lond). 2016. Vol. 130. №6. P.393-407.
6. Percie du Sert N., Hurst V., Ahluwalia A. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research // PLoS Biol. 2020. Vol.18.№7.P.e3000410.
7. Tamura A., Graham D.I., McCulloch J., Teasdale G.M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion // J Cereb Blood Flow Metab. 1981. Vol.1. № 1. P.53-60
8. Spinazzi M., Casarin A., Pertegato V., Salviati L., Angelini C. Assessment of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities on tissues and cultured cells // Nat Protoc. 2012. Vol.7. № 6. P.1235-1246
9. Li Y., D'Aurelio M., Deng J.H. An assembled complex IV maintains the stability and activity of complex I in mammalian mitochondria // J Biol Chem. 2007. Vol.282. № 24.P.17557-17562.
10. Wang H., Huwaimel B., Verma K. Synthesis and Antineoplastic Evaluation of Mitochondrial Complex II (Succinate Dehydrogenase) Inhibitors Derived from Atpenin A5 // ChemMedChem. 2017. Vo.12. № 13. P.1033-1044.
11. Pozdnyakov D. I., Zolotych D. S., Larsky M. V. Correction of mitochondrial dysfunction by succinic acid derivatives under experimental cerebral ischemia conditions // Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences. 2021. Vol. 34. №. 1. P. 42-48.
12. Anzell A.R., Maizy R., Przyklenk K, Sanderson TH. Mitochondrial Quality Control and Disease: Insights into Ischemia-Reperfusion Injury // Mol Neurobiol. 2018. Vol.55. № 3. P. 2547-2564.
13. Uzdensky A.B. Apoptosis regulation in the penumbra after ischemic stroke: expression of pro- and antiapoptotic proteins // Apoptosis. 2019. Vol.24. № 9-10. P. 687-702.
14. Jia L., Wang J., Cao H., Zhang X., Rong W., Xu Z. Activation of PGC-1a and Mitochondrial Biogenesis Protects Against Prenatal Hypoxic-ischemic Brain Injury // Neuroscience. 2020. Vol.432. P.63-72.
2021 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE №3
®
