CC BY
97
Изменение активности аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в крови и почках цыплят в ходе развития стресс-реакции
С.Ю. Харлап, аспирантка, М.А. Дерхо, д.б.н., профессор, Т.И. Середа, к.б.н., ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГаУ
В последние годы воспроизводство высокопродуктивных кроссов птиц на птицефабриках России происходило в основном за счёт импорта прародительских и родительских форм цыплят. Однако в новых экономических условиях резко ограничился ввоз импортной продукции, что побуждает птицеводческие племрепродукторы использовать в производстве племенного инкубационного яйца собственные ресурсы. В связи с этим возникла необходимость оценить биологический потенциал импортных и отечественных цыплят родительского стада.
Для реализации генетического потенциала большое значение имеют адаптационные способности птиц, которые можно оценить по характеру формирования стресс-реакции под действием стрессоров. Известно, что для птиц, содержащихся в промышленных условиях, одним из самых распространённых стресс-факторов является транспортировка и перегруппировка [1]. Например,
время нахождения цыплят в транспортной таре определяет уровень снижения массы тела [2]. Первичной эффекторной мишенью стресса являются надпочечники, состояние которых тесно взаимосвязано с функциональной активностью почек [3]. Так, под действием стрессоров в почках животных протекают компенсаторно-приспособительные процессы, в которые вовлекаются все отделы и компоненты нефрона, а также сосудистая система [4]. Это служит доказательством участия почек в реализации адаптационной стратегии организма.
Одним из чувствительных биоиндикаторов действия стрессоров различного происхождения являются ферменты, отражающие физиологобиохимическое состояние организма и его адаптационные возможности [1, 5]. При этом в основном изучена информативность сывороточных ферментов [5, 6]. В то же время ферментативные изменения клеток внутренних органов, в том числе и почек, недостаточно отражены в литературе, что и определило тему нашего исследования.
Целью исследования явилось изучение динамики активности АсАТ, АлАТ и ЩФ в крови и
супернатанте почек импортных и отечественных цыплят кросса Ломан белый в ходе стресс-реакции, развивающейся на фоне моделированного производственного стресса перегруппировки и транс -портировки.
Материал и методы исследования. Экспериментальная часть работы выполнена на базе вивария и кафедры органической, биологической и физколлоидной химии ФГБОУ ВО «Южно-Уральский ГАУ» в 2014–2015 гг. Объектом исследования служили 40-суточные цыплята кросса Ломан белый, принадлежащие ОАО «Челябинская птицефабрика». Птиц подбирали в группы по принципу аналогов с учётом происхождения, живой массы и клинического состояния. До начала эксперимента их выдерживали в условиях вивария в течение двух недель, поддерживая условия содержания в соответствии с технологией выращивания кросса.
Для проведения опыта было сформировано две группы (n=25): I гр. (контрольная) состояла из цыплят, полученных на птицефабрике от птиц родительского стада. Во II гр. (опытную) вошли импортные цыплята, завезённые на птицефабрику в суточном возрасте. Для моделирования производственного стресса перегруппировки и транспортировки и инициации стресс-реакции использовали шуттелирование на шуттель-аппарате при частоте механических движений 160 в мин. в течение двух часов [2] (эксперимент проводили в утренние часы (с 9 до 11 час.).
Материалом исследований служили кровь и почки, которые получали после декапитации цыплят, выполненной под наркозом эфира с хлороформом с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ ЕЕС) и Хельсинкской декларации, до шуттели-рования (фон), сразу, через 1, 4 и 24 часа после шуттелирования. После декапитации кровь собирали в пробирки, подвергали центрифугированию и получали плазму крови. Почки перфузировали охлаждённым физраствором, гомогенизировали в среде выделения, содержащей 0,005н Tris, 0,1н KQ в соотношении 1:50. Полученный гомогенат центрифугировали. В супернатанте и плазме крови определяли активность АсАТ (аспартатаминотранс-феразы), АлАТ (аланинаминотрансферазы) и ЩФ (щелочной фосфатазы) при помощи стандартных наборов реактивов «Абрис», «Эко-сервис». В почках активность ферментов рассчитывали на 1 г ткани. Для оценки цитолитической реакции клеток почек определяли соотношение между уровнем энзимов в плазме крови и супернатанте почек по формуле:
Ф
= кР°ви .1000,
Ф
^почек
где КЦР — коэффициент цитолитической реакции, усл. ед.;
Фкрови — активность ферментов в плазме крови, мкмоль/(ч-мл);
Фпочек — активность ферментов в супернатанте почек, мкмоль/(ч-мл) на 1 г ткани;
1000 — нормализующий коэффициент.
Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики на ПК с помощью табличного процессор «Microsoft Ехсе1 - 2003» и пакета прикладной программы «Биометрия». Достоверность различий между группами оценивали с учётом непараметрического критерия Манна — Уитни.
Результаты исследования. Мы установили, что отечественные и импортные цыплята до моделирования экспериментального стресса отличались по уровню ферментов в плазме крови и супернатанте почек (табл. 1), что свидетельствовало о различиях в метаболическом состоянии клеток организма и их энергетических возможностях. Так, в плазме крови и супернатанте почек импортных цыплят активность ферментов АлАТ и АсАТ была значительно меньше, чем у отечественных. АлАТ и АсАТ являются метаболонами цикла Кребса [7]. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что в организме цыплят опытной группы значительно меньшее количество аминокислотных остатков вовлекалось в энергетический обмен. Возможно, одной из причин этого являлось нарушение соотношения между константой Михаэлиса ферментов и концентрацией субстрата [5]. В данных условиях, вероятно, ЩФ способствовала образованию и высвобождению энергии за счёт транспорта фосфатов через плазматические мембраны, что проявлялось более высокой активностью фермента в клетках почек импортных цыплят.
Результаты наших исследований показали, что ферменты являются одним из быстро реагирующих звеньев биохимического гомеостаза на действие стресс-фактора. Динамика изменений их активности в ходе развития стресс-реакции соответствовала следующим её фазам [8]: 1) латентная фаза с критическим минимумом; 2) фаза реабилитации; 3) фаза мобилизации.
В почках отечественных цыплят данные фазы обнаруживались в течение первых 24 часов после шуттелирования, являющегося для птиц, согласно данным [1], стресс-фактором при частоте механических движений 160 в мин. Первая фаза ответной реакции организма была максимально выражена для АлАТ и АсАТ через 1 час, а ЩФ — сразу после действия стрессора (табл. 1) и проявилась уменьшением активности ферментов в супернатанте почек до минимума за счёт подавления их биосинтеза. Возможно, это было результатом изменений транскрипционной активности генов почки, контролирующих синтез данных каталитических белков [9]. Одним из путей поддержания концентрации ферментов в клетках органа явилось уменьшение количества каталитических белков, мигрирующих из почек в кровь. Об этом свидетельствовало увеличение величины КЦР (табл. 2),
отражающей соотношение ферментов в крови и супернатанте почек, что сказывалось на уровне каталитических белков в крови цыплят (табл. 1). Аналогичные данные были получены ранее [6].
Фаза реабилитации стресс-реакции для исследуемых ферментов в супернатанте почек была очень короткой и не зарегистрирована нами в ходе эксперимента. Однако через 1 час после шуттелирования было уже установлено резкое повышение активности ЩФ, что свидетельствовало о наступлении фазы мобилизации стресс-реакции для физиологических систем, контролирующих уровень энзима в почках (табл. 1). Для ферментов переаминирования данная фаза обнаруживалась через 4 часа после действия стрессора, при этом активность АсАТ преобладала над АлАТ (коэф. де Ритиса 2,42±0,05). Однако к 24-му часу эксперимента соотношение аминотрансфераз выравнивалось (коэф. де Ритиса 1,25±0,07), что отражало повышение роли глюконеогенеза в поддержании энергетического баланса в организме птиц. На фоне роста биосинтетической активности клеток почек увеличивался выход ферментов из органа в кровь (величина КЦР (табл. 2) снижалась для АлАТ, АсАТ, ЩФ), обеспечивая возрастание их активности в плазме крови цыплят. Результаты наших исследований согласуются с данными [1, 6].
Таким образом, характер динамики ферментов в супернатанте почек и крови отечественных цыплят в ходе развития стресс-реакции свидетельствовал, что она протекала по пути, обеспечивающему адекватную мобилизацию энергетических и пластических ресурсов организма, что соответствует представлениям об эустрессе. Следовательно, организм птиц обладал высоким адаптационным потенциалом.
В группе импортных цыплят наступление и выраженность соответствующих фаз стресс-реакции отличалась от контроля. Так, в течение 24 часов после шуттелирования состояние внутриклеточных систем, обеспечивающих активность аминотранс-фераз в клетках почек, соответствовало латентной фазе стресс-реакции с критическим минимумом. При этом наименьшая активность АсАТ была установлена в конце эксперимента, а АлАТ – через 1 час после шуттелирования (табл. 1). В клетках почек в большей степени подавлялся биосинтез аланинаминотрансферазы, что сказывалось на значениях коэффициента де Ритиса. Следовательно, в организме импортных птиц резко ограничивалось использование аминокислот в процессах глюко-неогенеза, что было результатом изменения проницаемости плазматических мембран, как клеток почек, так и митохондрий, о чём свидетельствовало повышение величины КЦР и изменение уровня ферментов в крови (табл. 1, 2). Логично предположить, что организм птиц обладал значительно меньшим запасом пластических и, как следствие, энергетических ресурсов, обеспечивающим его адаптацию к действию стресс-фактора. Этот вывод согласуется с данными [1], согласно которым реализация срочного этапа адаптации возможна только благодаря тем резервам организма, которые обусловлены генетически, за счёт ранее сформированных физиолого-биохимических механизмов.
Активность щелочной фосфатазы в супернатанте печени имела минимальное значение сразу после шуттелирования (табл. 1), что соответствовало латентной фазе с критическим минимумом в структуре стресс-реакции. В ходе дальнейшего эксперимента концентрация фермента постепенно увеличивалась, что можно расценивать как про-
1. Ферменты крови и супернатанта почек ^±Sx)
Показатель Груп- До шутте- После воздействия вибрации
па (фон), (n=5) сразу (n=5) через 1 ч(n=5) через 4 ч (n=5) через 24 ч (n=5)
Плазма крови
АсАТ, I 5,91±0,21 4,99±0,13* 2,43±0,14*** 7,20±0,22* 9,28±0,22**
мкмоль / ч-мл II 1,51±0,03 6,36±0,24*** 6,95±0,31*** 6,08±0,17*** 5,26±0,31***
АлАТ, I 2,45±0,11 0,92±0,03*** 0,83±0,05*** 5,55±0,33*** 7,71±0,09***
мкмоль / ч-мл II 0,75±0,02 9,75±0,37*** 7,10±0,33*** 5,88±0,24*** 4,38±0,18***
Коэф. де Ритиса, I 2,51±0,23 5,55±0,37*** 3,03±0,25 1,33±0,09** 1,26±0,01**
усл. ед. II 1,95±0,02 0,66±0,03*** 1,00±0,06*** 1,05±0,04*** 1,21±0,08***
ЩФ, Е/л I 2057,05±20,89 1626,00±40,15*** 1143,29±57,28*** 1383,60±20,06*** 1562,08±23,17***
II 1950,08±9,31 1729,49±27,59*** 1015,79±11,19*** 575,71±10,41*** 558,98±15,72***
Супернатант почек
АсАТ, мкмоль / ч-мл I 126,06±2,42 90,46±2,07*** 51,11±1,82*** 297,11±6,22*** 293,55±8,97***
на 1 г ткани II 19,30±0,26 18,04±0,39 17,34±0,27* 9,61±0,19*** 6,91±0,22***
АлАТ мкмоль / ч-мл I 57,32±3,22 33,75±1,24*** 17,39±0,63*** 123,07±2,31** 233,75±2,45***
на 1 г ткани II 16,27±0,21 4,85±0,18*** 3,76±0,11*** 4,27±0,07*** 4,56±0,10***
Коэф. де Ритиса, I 2,19±0,16 2,68±0,09* 2,94±0,24* 2,42±0,05* 1,25±0,07***
усл. ед. II 1,19±0,02 3,72±0,16*** 4,61±0,15*** 2,25±0,07*** 1,52±0,06***
ЩФ, Е/л I 399,41±10,76 252,52±5,52*** 1508,13±51,27*** 4054,55±87,80*** 5091,67±138,49***
на 1 г ткани II 1790,17±25,52 434,72±7,31*** 647,89±17,43*** 675,96±11,78*** 619,73±8,43***
Примечание: * – Р<0,05; ** – Р<0,01; *** – Р<0,001 по сравнению с величиной «фон»
2. Коэффициент цитолитической реакции ферментов (X±Sx)
Показатель Груп- До шутте- После воздействия вибрации
па (фон), (n=5) сразу (n=5) через 1 ч (n=5) через 4 ч (n=5) через 24 ч (n=5)
Плазма крови
КЦР(АсАТ), I 46,89±2,19 55,57±2,37 47,22±1,48 24,31±0,27*** 33,31±2,09**
усл. ед. II 78,23±2,11 352,54±11,61*** 400,81±6,56*** 632,66±13,53*** 761,22±41,82***
КЦР(АлАТ), I 38,74±0,87 27,16±0,98*** 48,00±0,41** 45,09±2,16 32,89±0,39***
усл. ед. II 46,10±2,14 2010,31±153,18*** 1888,29±182,09*** 1377,05±46,33*** 960,52±60,37***
КЦР(ЩФ), I 5150,22±115,24 6439,09±54,66*** 758,08±37,76*** 341,24±7,21*** 306,79±5,77***
усл. ед. II 1089,32±35,63 3978,39±151,90*** 1567,84±98,39*** 851,69±38,89*** 901,97±36,15***
текание фазы реабилитации. Однако и через 24 часа после шуттелирования активность ЩФ была меньше фоновой величины в 2,88 раза (р< 0,001). Аналогичные данные получены [3] при длительной насильственной иммобилизации крыс. Возможно, одной из причин снижения активности ЩФ в супернатанте почек было увеличение скорости выхода фермента из клеток почек в кровь за счёт повышения проницаемости плазматических мембран или уменьшения их стабильности в результате гипертрофии частей нефрона на фоне нарушения кровообращения [4]. Об этом свидетельствовала динамика значения КЦР (ЩФ) (табл. 2). Изменение проницаемости клеточных мембран при действии стрессоров различной этиологии наблюдали [10]. Однако уменьшение уровня ЩФ в супернатанте печени на фоне увеличения выхода фермента в кровь не приводило к возрастанию его активности в плазме крови цыплят (табл. 1).
Совокупность изменений активности ферментов в исследуемых биосредах импортных цыплят свидетельствовала, что клетки почек в ходе развития стресс-реакции после шуттелирования испытывали дефицит энергии за счёт недостаточного запаса белковых субстратов. Поэтому стресс-реакция по сравнению с контролем была более длительной во времени и менее активной, что характерно для организмов с низким уровнем резистентности [6]. В этих условиях достаточно высока вероятность перехода стресс-реакции в дистресс.
Выводы. Результаты наших исследований показали, что динамика изменения активности ферментов в крови и супернатанте почек отечествен-
ных цыплят после воздействия шуттелирования соответствовала классической картине развития этапа срочной адаптации в общем адаптационном синдроме. В группе импортных цыплят формирование адаптивной реакции было модифицировано, что свидетельствовало о низких адаптационных возможностях как белоксинтезирующих систем, так и организма в целом.
Литература
1. Ковтутнеко А.Ю. Адаптационные реакции у кур при транс-опртировке и шумовом воздействии: автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Белгород: БГСХА, 2009. 22 с.
2. Плященко С.И., Сидоров В.Т. Стрессы у сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1987. 192 с.
3. Тупикин В.Д., Полина Ю. В., Уварова И.А. и др. Эффекты низкоинтенсивного электромагнитного излучения в структуре почек и надпочечников изолированно и при стрессе // Астраханский медицинский журнал. 2010. № 1. С. 282—285.
4. Тупикин В.Д., Родзаевская Е.Б., Уварова Н.А. и др. Гистофункциональная характеристика кортикальных и околомозговых нефронов почки при реакции на экспериментальный стресс // Известия Саратовского университета. Серия «Химия. Биология. Экология». 2013. Т. 13. Вып. 4. С. 58—65.
5. Ковалев Н.Н. Холинэстеразы — биохимические маркеры механизма адаптации гидробионотов: автореф. дисс. . докт. биол. наук. Владивосток: Тихоокеанский НИИ, 2003. 40 с.
6. Хижнева О. А., Дерхо М.А., Середа Т.И. Ферменты крови животных, подвергнутых комбинированному воздействию сульфата кадмия и вибрации // Актуальные проблемы научной мысли: сб. статей междунар. науч.-практич. конф. 24.04.14. Уфа: Аэтерна, 2014. С. 54—57.
7. Середа Т.И., Дерхо М.А. Оценка роли аминотрансфераз в формировании продуктивности у кур-несушек // Сельскохозяйственная биология. 2014. № 2. С. 72—77.
8. Беньковская Г.В. Стресс-реакция как механизм реализации адаптивного потенциала особей и популяции насекомых: автореф. дисс. ... докт. биол. наук. Новосибирск: ИСиЭЖ СО РАН, 2009. 40 с.
9. Пыльник Т.О. Изменение экспрессии генов в почках крыс НИСАГ в покое и под воздействием эмоционального стресса // Студент и научно-технический прогресс: тез. докладов конф. Новосибирск: НГАУ, 2011. С. 199.
10. Boya P., Kroema G. Lysosomal membrane permeabilization in cell death // Oncogene. 2008. Vol. 50. № 22. Р 6434—6451.
