CC BY
36
О.В. Ваулин, И.К. Захаров
ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА ADH В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ DROSOPHILA MELANOGASTER
Работа поддержана грантом РФФИ № 05-04-48838 и Программой Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов»
Изучено разнообразие последовательностей ДНК фрагмента гена алкогольдегидрогеназы (Adh) в природных популяциях Drosophila melanogaster России, Украины и Киргизии. Отмечено наличие F-формы фермента во всех изученных популяциях. Выявлен один вариант последовательности ДНК, соответствующий F-форме Adh, и три, соответствующих S-форме. Два из трех аллелей S-формы Adh не аннотированы в базе данных ДНК и, вероятно, появились в результате кроссинговера и мутационного процесса. Третий аллель, описанный нами как вариант S, может представлять собой нуль-аллель.
Особенности генетического полиморфизма в популяциях определяются отбором, мутационным и миграционным процессами, дрейфом генов. Вклад каждого из этих факторов в изменчивость различных генетических локусов варьирует в зависимости от функциональной нагрузки гена (или нуклеотидной последовательности). Изменчивость нуклеотидных последовательностей зависит от их функциональной нагрузки и эффектов попутного отбора [1]. Известно, что в особенности изменчивости микросателлитных участков ДНК основной вклад вносит мутационный процесс, тогда как в изменчивость по хромосомным перестройкам - отбор.
Высокая изменчивость при подверженности действию отбора показана для гена алкогольдегидрогеназы (Adh), хорошо изученного методом изоферментного анализа [2]. Так как развитие личинок Drosophila melanogaster происходит в условиях повышенной концентрации этанола (в бродящих субстратах), то эффективность утилизации этого вещества, определяемая активностью алкогольдегидрогеназы, важна для их выживания. Показана долготная клинальная изменчивость частот быстрой (Fast, F) и медленной (Slow, S) - по электрофоретической подвижности форм соответствующего фермента [3]. Активность фермента определяется не только единичной аминокислотной заменой, приводящей к изменению форе-тических и каталитических свойств фермента, но и особенностями последовательности ДНК соответствующего гена [4, 5].
Полиморфизм по Adh для популяций Drosophila melanogaster большей части территорий Азии и Восточной Европы не был описан. В ходе данной работы был изучен полиморфизм нуклеотидной последовательности фрагмента гена Adh в природных популяциях Drosophila melanogaster России, Украины и Киргизии, а также оценено соотношение S- и F-форм Adh.
Материал и методы
Изучены нуклеотидные последовательности фрагмента гена Adh в выборках из популяций Drosophila melanogaster России, Украины и Киргизии (таблица).
В анализ бралась 1 особь-имаго из изосамочьей линии. Каждая изосамочья линия представляет потомство оплодотворенной в природе самки, которое поддерживается с момента основания линии в фонде лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. При исследовании одной выборки (Томск, 2006) в анализ брались дрозофилы, отловленные непосредственно в популяции. Выделение ДНК производилось по стандартной методике [6]. Выделенную ДНК растворяли в 50 мкл бидистиллированной воды. Для работы использовались специфичные к фрагменту гена Adh праймеры состава: 5’-ATTGCCGTCAACTACACTGG-3’ (forvard) и 5 ’ -GGTTCGCGAACCCTATGAAC-3 ’ (reverse). Синтез праймеров был осуществлен в секторе химии нуклеиновых кислот ИЦиГ СО РАН. Данные праймеры фланкируют участок гена, включающий в себя интрон 3 и экзон 4 гена Adh.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл. Реакционная смесь для ПЦР фрагмента гена Adh содержала: ^PCR-buffer, 4 мМ MgCl2, 0,1 мМ каждого dNTP, 0,3 мМ каждого праймера и 2,5 ед Taq-полимеразы. На одну реакцию по 1 мкл исходного раствора ДНК. ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 94°C - 1 мин.; отжиг при 57°C - 1 мин; полимеризация при 72°C - 1 мин; в последнем цикле стадия полимеризации продолжалась 5 мин при 72°C. Продукт реакции очищали путем электрофореза в 1% агарозном геле. Реакцию секвенирования проводили с помощью реактива Big Dye 3.1. Продукты секвениро-вания разделяли электрофоретически и строили соответствующие хроматограммы в межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН. Учитывали нуклеотиды, начиная от 49-го после сайта посадки праймера forvard. Различные варианты последовательностей S-формы Adh, выявленные в ходе работы, маркировались как Sb S2 ... Sn. Единственный вариант Fast-формы Adh маркировался как F.
Полученные последовательности были сравнены с таковыми из базы данных ДНК DDBJ (http://www.ddbj. nig.ac.jp); номера последовательностей: M22210, M17827, M17828, M17830, M17831, M17832, M17833, M17834, M17835, M17836, M17837 M19547, M36580, X04454, X60791, X60792, X60793 и U20765.
Популяция (год, регион) Линия Генотип особи
Умань, 1984, Черкасская область, Украина U84101 F/F
U84399 F/F
U84413 F/F
U84526 F/F
Умань, 1993, Черкасская область, Украина U93011 F/F
U93014 F/F
U93033 F/F
U93080 F/F
Никополь, 1997, Днепропетровская область Украина N97003 F/F
N97011 F/S,
N97021 F/F
N97025 F/S
Бийск, 1993, Алтайский край, Россия B93235 F/F
B93343 S/S
B93350 F/F
B93351 F/F
B93397 F/S
B93364 F/F
Белокуриха, 2000, Алтайский край, Россия B14 F/F
B15 F/F
B16 F/F
B20 F/F
B37 F/F
Горно-Алтайск, 1993, Республика Горный Алтай, Россия GA93010 S/S
GA93066 F/F
GA93080 F/F
GA93124, F/F
GA93146 S/S
Сочи, 2004, Краснодарский край, Россия S406 F/F
S407 F/F
S415 F/F
S421 F/F
S426 F/F
S431 F/F
Ижевск, 2002, Удмуртия, Россия I295 F/F
I329 F/F
I336 F/F
I341 F/F
I343 F/F
Нальчик, 2006, Кабардино-Балкария, Россия N1-2 F/F
N1-3 F/F
N1-4 F/F
N2-2 F/F
N3-4 F/F
Бишкек, 2004, Киргизия Bi 1 S/S
Bi3 F/S і
Bi31 S,/S,
Bi62 F/F
Томск, 2006, Россия Tif1 F/F
Tif2 S/S
Tif3 F/S
Tm1 S/S
Tm2 F/S
Tm3 F/F
Результаты
Отмечено сохранение гетерозиготности по нуклеотидной последовательности фрагмента в линиях, дли-
тельно культивируемых в лабораторных условиях. В частности, отмечены гетерозиготы в линии из Бийска (1993 г.) Бишкека (2004 г.) и Никополя (1997 г.), три из шести изученных особей из г. Томска были также гете-
розиготами. Для выборок с Украины, Кавказа и Урала показано преобладание Б-формы (исключение составляют две линии из Никополя, полиморфные по этому признаку); В-форма отмечается в выборках популяций Алтая, Бишкека и Томска (см. таблицу).
Изученные последовательности у гомозигот по Ліік оказались сходными с приведенными в базе данных ДНК (рис. 1). Последовательности Б выявлены во всех выборках и идентичны как друг другу, так и последовательностям, аннотированным в базе данных под номерами М17833, М17834, М17835, М17836, Х60791 и Х60792. Для образцов М17833, М17834, М17835 и
M17836 указано, что они происходят из разных частей ареала Drosophila melanogaster (Северная Америка, Западная Европа, Африка). Выявленный в нашей работе вариант последовательности Adh F, по-видимому, является наиболее широко распространенным в мире. Отмеченные в нашем исследовании последовательности Adh S более разнообразны. Выявлено 3 варианта последовательности Adh S, при этом один из них (S3) соответствует аннотированному варианту. Вариант Sj отмечен на Украине и в Киргизии; S2 - на Украине, Алтае, в Киргизии и Томске; S3 - на Алтае, в Киргизии и Томске.
Вариабельные сайты 111111222222233333444
15234 677 8 0012 690337 8 67 8
Линии/образцы 498974245006875320215800
M18733 CCCGGACGATCTGTCTCCCGGCCA
F ........................
N97011 (F/S1) Y. ....SYMYY.MR.M..
N97025 (F/S2) SR ....SYMYY.MR...M
GA93010 (S2/S2) GA ....CCACT.AA...C
B93397 (F/S3) ....S.M
Bi31 (S1/S1) T. ....CCACT.AA.A..
M36580 TT ....C.A
M17832 ....C.A.T..A....
M17837 ...G..
X04454 A...
M22210 T.A
M17830 ....CCACT.AA.A..
M17827 T. ACA...TAACCCACT.A..A..
M17831 ....CCACT.A
X60793 GA ....CCACT.AA....
U20765 ....C.A
Рис. 1. Вариабельные сайты в аннотированных и изученных последовательностях ДНК участка гена Adh Drosophila melanogaster. Позиции выровнены относительно начала изученных образцов ДНК. Жирным шрифтом выделен сайт, замены по которому определяют электрофоретическую подвижность фермента (S- и F-формы). Полиморфные позиции у гетерозигот обозначены 15-буквенным кодом. Среди групп, аннотированных и изученных в работе последовательностей ДНК, приведены только неповторяющиеся варианты
Обсуждение
Как было отмечено выше, ген алкогольдегидрогена-зы Drosophila melanogaster характеризуется выраженной клинальной изменчивостью. Быстрая форма фермента более активна и менее стабильна, чем медленная. В тропических популяциях Drosophila melanogaster (примерно до 25° с.ш.) доля S-формы наиболее велика, составляя в популяции 70-100%. С увеличением широты доля S-формы фермента в популяциях падает. При этом в изученных популяциях восточного побережья Северной Америки на широте 50° доля F-формы составляет около 75%, а в популяциях той же широты из Европы доля F-формы составляет 90-100% [3]. Кли-нальная изменчивость по Adh в популяциях Drosophila melanogaster выявлена на территории Северной Америки, Европы, Африки, а также Японии и Индии [7]. Таким образом, выявленное нами преобладание F-формы фермента в популяциях Северной Евразии - это предсказуемый результат. Тем не менее отмечено наличие S-формы в популяциях Томска и Алтая, расположенных к северу от 50-й параллели. В то же время есть данные, что межаллельные отношения продуктов гена Adh носят характер выраженного сверхдоминирования [8], при значениях равновесной частоты F-формы
(в лабораторных условиях) 40-70%. Этот факт может способствовать длительному сохранению полиморфизма по электрофоретически выявляемым аллелям Adh.
Показано, что относительно низкое разнообразие последовательностей Б-аллелей Adh связано с их недавним происхождением и с ассоциацией с инверсией [9]. Тем не менее можно было ожидать широкого распространения нескольких вариантов нуклеотидных последовательностей Adh Б. Единообразие последовательностей Б Adh, выявленное в данной работе, по-видимому, объясняется адаптивностью именно данной последовательности гена (или кластера генов) к условиям среды Северной Евразии, так как какое-либо действие миграционного процесса должно было привести к распространению иных вариантов последовательности БаБ^формы Adh, а действие генетического дрейфа, приводящее к единообразию различных популяций по набору аллелей, маловероятно.
Последовательность 81 имеет набор нуклеотидных замен, описанный для различных аннотированных последовательностей Adh 8. По-видимому, его происхождение связано с кроссинговером. В частности, при кроссинговере между аннотированными последовательностями М17830 и М17827 (эти последовательно-
сти описаны для Drosophila melanogaster из Западной Европы (Франции) и Северной Америки, соответственно) в области 4-58 п.н., должен образоваться продукт, идентичный Si (см. рис. 1). Последовательности S2 и X60793 отличаются друг от друга одной нуклеотидной заменой, не отмеченной у других аннотированных последовательностей. S2-последовательность является дочерней по отношению к X60793.
Последовательность S3, встреченная в ходе работы только в гетерозиготном состоянии, идентична соот-
ветствующему фрагменту U20765, которая описана в базе данных как нуль-аллель. Не известно, являются ли выявленные последовательности S3 нуль-аллелями, так как ни стоп-кодоны, ни микроделеции в кодирующей части изученного фрагмента гена Adh нами не обнаружены. Однако мы не можем исключить их наличие в не изученной нами части гена. Если же S3 -нуль-аллель, то он является распространенной летальной мутацией в азиатских популяциях Drosophila melanogaster.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гундерина Л.И. Полиморфизм ДНК генов Drosophila и определяющие его факторы // Генетика. 2003. Т. 39, № 7. С. 888-899.
2. Singh R.S. Population genetics and evolution of species related to Drosophila melanogaster // Annu. Rev. Genet. 1989. Vol. 23. P. 425-453.
3. David J.R., Capy P. Genetic variation of Drosophila melanogaster natural populations // Trends in Genetics. 1988. Vol. 4, № 4. P. 106-111.
4. Laurie C.C., Birdgham J.T., Choudhary M. Associations between DNA sequence variation in expression of the Adh gene in natural populations of
Drosophila melanogaster // Genetics. 1991. Vol. 129, № 2. P. 489-499.
5. Dunn R.C., Laurie C.C. Effects of transposable element insertion on alcohol dehydrogenase expression in Drosophila melanogaster // Genetics. 1995.
Vol. 140, № 2. P. 667-677.
6. Bender W., Pierre S., Hognes D.S. Chromosome walking and jumping to isolate DNA from Ace and rosy loci of bithorax complex in Drosophila
melanogaster // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 168. P. 17-33.
7. Shamina, Parkash R. Adh allozymic variation in D. melanogaster popuations from India // Drosophila Inf. Serv. 1993. № 72. P. 97-98.
8. Bijlsma-Meels F., Bijilsma R. The alcohol dehydrogenase polymorphism in Drosophila melanogaster: Fitness measurements and predictions under
conditions with no alcohol stress // Genetics. 1988. Vol. 120, № 3. P. 743-753.
9. Veuille M., Benassi V., Aulard S. et al. Allele-specific structure of Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase at molecular level // Genetics.
1998. Vol. 149, № 2. P. 971-981.
Статья поступила в редакцию журнала 12 сентября 2006 г., принята к печати 5 декабря 2006 г.
