CC BY
49
— КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ ---
УДК 597.553.2: 575.2
ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИКРОСАТЕЛЛИТИЫХ ЛОКУСОВ В ПОПУЛЯЦИИ НЕРКИ ONCORHYNCHUS NERKA (WALBAUM) ОЗ. КУРИЛЬСКОЕ
О. А. Пильганчук, Н. В. Варнавская
М. н. с., вед. н. с., Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии 683000 Петропавловск-Камчатский, Набережная, 18 Тел., факс: (415-2) 41-27-01; (415-22) 5-25-92 E-mail: pilqanchuk. o. a@kamniro. ru
НЕРКА, МИКРОСАТЕЛЛИТЫ, ТЕМПОРАЛЬНАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ
В работе представлены результаты анализа уровня межгодовой изменчивости частот микросателлит-ных локусов ядерной ДНК нерки оз. Курильское за период времени в 11 лет (с 1989 по 2000 гг.). Был выполнен анализ частот аллелей 14 локусов — Ots2, Ots3, 0ts100, 0ts103, 0ts107, 0ts108, One8, 0my77, 0ki1a, 0ki1b, 0ki6, 0ki10, 0ki16, 0ki29. Выявлена темпоральная стабильность аллельных частот микросателлитных локусов в течение анализируемого периода. Полученные результаты позволили заключить, что данная система маркеров может служить эффективным инструментом мониторинга генофонда, а также использоваться при определении популяционной принадлежности отдельных особей, на основе ранее созданных баз генетических данных.
VARIATIONS OF MICROSATELLITE LOCI IN THE SOCKEYE SALMON ONCORHYNCHUS NERKA (WALBAUM) POPULATION OF KURILSKOYE LAKE О. А. Pilganchuk, N. V. Varnavskaya
Junior scientist, leader scientist, Kamchatka Research Institute of Fisheries and 0ceanography 683000 Petropavlovsk-Kamchatsky, Naberejnaya, 18 Tel., fax: (415-2) 41-27-01; (415-22) 5-25-92 E-mail: pilqanchuk. o. a@kamniro. ru
S0CKEYE SALM0N, MICRISA TELLITE, TEMP0RAL STABILITY
The results of the analysis of the interannual nuclear DNA micrisatellite locus variation level for sockeye salmon in Kurilskoye Lake for the period of 11 years (from 1989 to 2000) have been demonstrated. Analysis of the allelic frequencies for 14 loci, including 0ts2, 0ts3, 0ts100, 0ts103, 0ts107, 0ts108, 0ne8, 0my77, 0ki1a, 0ki1b, 0ki6, 0ki10, 0ki16, 0ki29 has been provided. Temporal stability of the allelic frequencies of the microsatellite loci for analyzed period has been revealed. The results we have obtained allow to make the conclusion that mentioned system of markers can be an efficient tool in the monitoring of the pool of genes and also can be used for population identification of individuals on the base of genetic data colleted before.
Нерка 0ncorhynchus nerka (Walbaum) — один из ценнейших промысловых видов тихоокеанских лососей, особенности биологии которого связаны с наличием хоминга — возврата производителей к местам нереста их родителей (Hartman, Raleigh, 1966; Варнавский, Варнавская, 1985). Благодаря значительной пространственной подразделенности нерестовых площадей, различным типам нерестилищ и времени нереста, у нерки отмечена дифференциация на сезонные и экологические формы (Бугаев, 1995; Варнавская, 2006). На Камчатке наиболее важное в промысловом отношении стадо данного вида воспроизводится в оз. Курильское. Несмотря на то, что данная популяция является одной из наиболее изученных, многие вопросы, связанные с ее биологией и особенностями внут-рипопуляционной структуры, остаются неясными.
Изучение изменчивости популяции во временном аспекте даст возможность лучше понять ее адаптивную стратегию, охарактеризовать генетическое своеобразие, выработать рекомендации для рационального промысла, проводить идентификацию в смешанных уловах.
В настоящее время для изучения популяционной структуры нерки успешно используется методика анализа микросателлитной ядерной ДНК. Микросателлиты представляют собой фрагменты ДНК с большим количеством — до сотни тандемных повторов — коротких последовательностей, имеющих длину от 1 до 6 пар нуклеотидов (Та^2, 1989). В нашей работе была проведена оценка аллельной изменчивости микросателлитных локусов в локальных популяциях нерки оз. Курильское.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом для исследований послужили 16 субпопуляций (855 особей) нерки оз. Курильское, отобранных на основных нерестилищах в 1989 и 2000 гг. (табл. 1, рис. 1). Для изучения уровня межгодовой изменчивости были проанализированы 4 выборки производителей нерки в количестве 214 экземпляров, собранные на одних и тех же нерестилищах — б. Оладочная (литоральная форма позднего времени хода) и р. Кирушутк (речная форма раннего хода) в разные годы. Образцы грудных плавников отрезали от свежевыловленных рыб и фиксировали в 96% этиловом спирте.
Методика выявления частот аллелей была описана ранее (Beacham, 2006a,b; Варнавская, 2006). В качестве маркеров использовали секвенирован-ные ранее микросателлитные локусы 0ts2, 0ts3 (Banks et al., 1999), 0ts100, 0ts103, 0ts107, 0ts108 (Beachem et al., 1998; Nelson, Beachem, 1999); 0ne8 (Scribner et al., 1996); 0my77 (Morris et al., 1996); 0ki1 (2 локуса), 0ki6, 0ki9, 0ki16, 0ki29 (Smith et al., 1998). Продукты PCR были фракционированы методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (Miller et al., 2000), число нуклеотидных последовательностей выявляли с помощью ABI 377 автоматизированного ДНК-секвенатора. Размер аллелей определяли, используя компьютерное программное обеспечение Genescan 3.1 и Genotyper 2.5 (PE Byosystems, Foster City, Ca). Биохимические анализы выполняли на базе лаборатории молекулярной биологии Тихоокеанской биологической станции Нанаймо в Канаде.
Рис. 1. Локализация сбора проб нерки оз. Курильское в 1989, 2000 гг., исследованных при анализе микросател-литной ядерной ДНК (1 — р. Выченкия, 2 — р. Кирушутк, 3 — б. Южная, 4 — б. Озерная, 5 — б. Северная ближняя, 6 — р. Г аврюшка, 7 — б. Г аврюшка, 8 — б. Г ав-рюшка, мыс Тугумынк, 9 — р. Этамынк, 10 — б. Северная дальняя, 11 — б. Хакыцин, 12 — б. Оладочная)
Таблица 1. Локализация сбора и объем материала для исследования изменчивости микросателлитных локусов
у нерки бас. оз. Курильское
№ Локальность Дата Год Количество, экз.
1 Р. Выченкия 28 июля 2QQQ 1QQ
2 Р. Кирушутк 15 августа 19S9 ?2
З Р. Кирушутк 31июля 2QQQ 5Q
4 Б. Южная (литораль) 24 августа 2QQQ 5З
5 Б. Южная (литораль) 8 октября 19S9 5Q
б Б. Озерная 9 октября 2QQQ 5Q
? Б. Северная ближняя 9 октября 2QQQ 5Q
S Б. Гаврюшка 2 августа 2QQQ 5Q
9 Б. Гаврюшка 23 августа 19S9 З5
1Q Б. Гаврюшка 17 августа 2QQQ 5Q
11 Б. Гаврюшка, мыс Тугумынк 18 августа 2QQQ 5Q
12 Р Этамынк 5 августа 2QQQ 5Q
1З Б. Северная дальняя 30 августа 2QQQ 5Q
14 Б. Хакыцин 31 августа 2QQQ 5Q
15 Б. Оладочная 23 августа 19S9 45
1б Б. Оладочная 8 октября 2QQQ 5Q
Всего S55
Для статистической обработки результатов биохимических исследований применяли стандартные методы статистической обработки частот аллелей (Ли, 1978; Животовский, 1991; Хедрик, 2003). Сравнение аллельных распределений в выборках из различных группировок проводили с помощью критерия С-тест и V (Лакин, 1990; 8ока1, 1981).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общее число аллелей в локусах для всех исследованных выборок колебалось в пределах 4-69 (табл. 2). Суммарно по всем локусам было обнаружено 245 аллелей. В таблице 2 также представлены предельные числа нуклеотидных тандемов и показатели гетерозиготности; Н — средняя гете-розиготность субпопуляции и Н — ожидаемая частота гетерозигот, рассчитанные по каждому из исследованных локусов. Средние значения Н, и Н( для озера Курильское составили, соответственно, 0,637 и 0,646.
Результаты исследований, проведенных ранее в бас. оз. Курильское на основе мечения (Се-лифонова, 1978), анализа биологических признаков и структуры чешуи (Бугаев, 1976, 1995; Пильганчук, 2005), а также биохимического анализа частот ферментных генов (Мацак, 1989; Варнавская, 1988а,б; Уатау8кауа, 1994), позволили сделать заключение о гетерогенности данной популяции. При помощи исследований изменчивости
Таблица 2. Число аллелей, показатели гетерозиготности, предельные числа нуклеотидных повторов в 14 микро-сателлитных локусах нерки оз. Курильское
Локус Число аллелей BBA Hs Ht
Oki1a 4 94-i22 0,481 0,488
Oki1b 5 i3 i-1?8 Q,69? 0,?0б
0Ыб ii 80-1б4 0,4б2 0,4б8
Oki10 б9 150-530 0,922 0,93?
Oki 1 б i? 2?5-4Q3 0,4?? 0,483
Oki29 2Q 30б-4б5 0,б82 0,б91
Omy77 10 89-i2? 0,489 0,495
One8 12 i?5-259 0,?33 0,?4б
Ots2 i5 13Q-185 0,?4б 0,?59
Ots3 9 13Q-185 0,314 0,319
0ts100 2З 125-215 0,823 0,835
0ts103 2З i14-234 0,912 0,922
0ts107 ? 80-138 0,283 0,285
0ts108 2Q 9?-2ii 0,893 0,904
Среднее i8 0,б3? 0,б4б
Суммарно 245
Hs — средняя гетерозиготность субпопуляции, Ht — ожидаемая частота гетерозигот. BBA (Bottom base pair of allele bin) — предельные числа нуклеотидных тандемов, характерные для данного аллеля
микросателлитной ядерной ДНК была обнаружена дифференциация нерки озера Курильское раннего и позднего хода (БеасЬат et а1., 2006а; Варнавская, 2006).
Для выявления внутрипопуляционной структуры мы сгруппировали выборки по времени нереста (раннего хода, позднего хода) и по локализации (речные и литоральные). Таким образом, был проведен анализ пространственной, сезонно-экологической и темпоральной подразделенности популяции.
Проведенный нами анализ частот 14 микроса-теллитных локусов в 1989 году выявил значимую гетерогенность между выборками речной формы раннего хода и литоральной формы позднего хода (табл. 3). В 2000 году также выявлена гетерогенность между выборками различных сезонно-экологических группировок (табл. 4). Полученные результаты свидетельствуют о сложной популяционной структуре и наличии сезонно-экологических группировок у нерки озера Курильское.
Для оценки стабильности и воспроизводимости результатов, получаемых на основе изменчивости микросателлитной ядерной ДНК, мы проанализировали межгодовую изменчивость нерки из двух различных сезонно-экологических группировок б. Оладочная и р. Кирушутк, взятых с интервалом в 11 лет. В результате проведенных исследований выявлена темпоральная стабильность в распределении аллельных частот микросателлит-ных локусов анализируемого периода (табл. 5). Между выборками 1989 и 2000 гг., отобранными на нерестилище нерки б. Оладочная, статистически
Таблица 3. Оценка внутрипопуляционной гетерогенности по частотам микросателлитных локусов ядерной ДНК у представителей разных сезонно-экологических форм популяции нерки озера Курильское в 1989 г. по критерию X2 (число степеней свободы — с/)
Локус Речные раннего хода - литоральные позднего хода df
Oki1a 8,53* 3
Oki1b 6,24 3
0Ыб 9,27 ?
Oki10 41,13 34
0Ы1б 22,19 14
Oki29 29,47* 1б
Omy77 3,50 б
One8 10,35 10
Ots2 12,26 10
Ots3 6,43 ?
0ts100 25,00* 15
0ts103 22,11 18
Ots107 10,70 5
0ts108 39,88* i?
Примечание: * — p < 0,05
Таблица 4. Оценка внутрипопуляционной гетерогенности частот микросателлитных локусов ядерной ДНК у представителей разных сезонно-экологических форм популяции нерки озера Курильское в 2000 г. по критерию X2 (число степеней свободы — ё/)
Локус Речные раннего хода -литоральные раннего хода / Речные раннего хода -литоральные позднего хода / Литоральные раннего хода -литоральные позднего хода /
Окіїа 4,75 3 9,04* 3 7,35 4
ОкіїЬ 1,4 3 15,00* 4 8,90 4
Окі6 10,74 8 19,92* 7 17,80* 7
ОкіїО 98,09* 55 86,09* 62 67,74 55
Окі 16 21,73 13 48,43* 14 27,30* 12
Окі29 19,54 17 19,54 17 40,02* 18
Оту77 16,64* 7 37,40* 8 11,92 6
Опе8 56,44* 11 62,81* 11 22,15* 10
Ots2 36,57* 13 37,70* 11 25,70* 12
Ots3 17,59* 8 15,50* 8 7,73 6
0ts100 29,5 19 66,90* 20 35,70* 17
0ts103 30,49 21 49,75* 22 39,29* 20
0ts107 4,47 5 10,28 6 7,36 6
0ts108 26,4 17 32,46* 16 28,80* 17
Примечание: * — р < 0,05
Таблица 5. Оценка темпоральной изменчивости частот микросателлитных локусов ядерной ДНК у представителей одних и тех же сезонно-экологических форм нерестовых субпопуляции нерки оз. Курильское, взятых с интервалом в 11 лет (1989, 2000 гг.), по в-тесгу (число степеней свободы — ё/)
Локус Б. Оладочная / Р. Кирушутк /
Окі1а 0,07 1 1,14 1
Окі 16 3,2 4 5,39 3
Окі6 0,89 2 2,89 2
0кі10 8,28 9 29,58* 12
Окі1Ь 0,19 1 1,58 1
Окі29 3,89 5 8,98 6
Оту77 0,17 2 1,37 2
Опе8 1,97 4 3,58 4
0ts2 5,53 4 7,84 4
0ts100 6,31 6 13,51 8
0ts103 10,94 11 3,35 10
0ts107 0,76 2 3,35 2
Оз3 4,8 3 0,48 3
0ts108 18,31 8 17,2 11
Примечание: * — р < 0,05
подтверждено отсутствие гетерогенности по всем частотам исследованных локусов. Сравнительный анализ проб, взятых на нерестилище р. Кирушутк в те же годы, также показал отсутствие гетерогенности по 13 из исследуемых локусов. Изменчивость в распределении аллельных частот выявлена лишь по локусу 0кл10.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты позволили заключить, что данная система маркеров может служить эффективным инструментом мониторинга генофонда, а
также использоваться при определении популяционной принадлежности отдельных особей, на основе ранее созданных баз генетических данных (БеасЬат et а1., 2006а,Ь; Варнавская, 2006).
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам ФГУП «КамчатНИРО» И.В. Шатило, О.Н. Сараванскому, А.Г. Стегару за помощь в сборе генетических проб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бугаев В.Ф. 1995. Азиатская нерка. М.: Колос. 464 с.
Бугаев В.Ф. 1976. К вопросу о дифференциации субизолятов красной в бассейне Курильского озера // Исследования по биологии рыб и промысловой океанографии. Владивосток. Вып. 7. С. 88-101.
Варнавская Н.В. 1988а. Пространственная и темпоральная генетическая структура в популяционной системе нерки оз. Курильского (Камчатка) // Тез. докл. III Всес. совещ. по лососевидным рыбам (Тольятти, март 1988). Тольятти: ИЭВБ. С. 49-51.
Варнавская Н.В. 1988б. Генетические закономерности возрастной дифференциации у нерки оз. Курильского // Тез. докл. III Всес. совещ. по лососевидным рыбам (Тольятти, март 1988). Тольятти: ИЭВБ. С. 48-49.
Варнавская Н.В. 2006. Генетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей. Петропав-ловск-Камчатский: КамчатНИРО, 488 с.
Варнавский B.C., Варнавская Н.В. 1985. Оценка миграции между внутрипопуляционными группировками ранненерестующей расы нерки оз. Начи-кинское (Камчатка) // Вопр. ихтиологии. Т. 25. Вып. 1. С. 157-159.
Животовский Л.А. 1991. Популяционная биометрия. М.: Наука. 267 с.
Лакин Г.Ф. 1990. Биометрия. М.: Высш. шк. 352 с.
Ли Ч. 1978. Введение в популяционную генетику. М.: Мир, 526 с.
Мацак Е.А. 1989. Генетический анализ популяции нерки (Oncorhynchus nerca) (Walb.) озера Курильского (Камчатка) // Генетика в аквакультуре. Л.: Наука. С. 50-57.
Селифонова М.Ф. 1978. Распределение красной по нерестилищам бассейна реки Озерной // Исследования по биологии рыб и промысловой океанографии. Владивосток. Вып. 9. С. 129-133.
Хедрик Ф. 2003. Генетика популяций. М.: Техносфера, 592 с.
Banks M.A., Blouin M.S., Baldwin B.A., Rash-brook V.K., Fitzgerald H.A., Blankenship S.M., Hedgecock D. 1999. Isolation and inheritance of novel microsatellites in chinook salmon (Oncorhynchus tschawytscha) // Journal of Heredity. V. 90. P. 281-288.
Beacham T.D., Candy J.R., McIntosh B., Mac-Connachie C., Tabata A., Kaukinen K., Deng L., Miller K.M., Withler R.E., Varnavskaya N.V 2005. Estimation of stock composition and individual identification of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) on a Pacific Rim basis using microsatellite and major histocompatibility complex variation // Trans. Amer. Fish. Soc.
Beacham T.D., Margolis L., Nelson R.J. 1998. A comparison of methods of stock identification for sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) in Barkley Sound, British Columbia // N. Pac. Andr. Fish Comm. Bull. No. V. 1. P. 227-239.
Beacham T.D., McIntosh B., MacConnachie C., Miller K.M., Withler R.E., Varnavskaya N.V. 2006a. Pacific Rim population structure of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) as determined from microsatellite analysis // Trans. Amer. Fish. Soc. V. 135. P. 174-187.
Beacham T.D., Varnavskaya N.V, McIntosh B., MacConnachie C. 2006b. Population structure of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) from Russia determined with microsatellite DNA variation // Trans. Amer. Fish. Soc.
Hartman W.L., Raleigh R.F. 1966. Tributary homing of sockeye salmon at Brooks and Karluk Lakes, Alaska // J. Fish. Res. Board Canada. V. 21. P. 485-504.
Miller K.M., Ming T.J., Shulze A.D., Kaukinen K.H., Bucklin K. and Calavetta M. 2000. Update to: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE): A Rapid and Sensitive Technique to Screen Nucleotide Sequence Variation in Populations / In: Polymorphism Detection and Analysis [ed. by J.D. Burczak and E. Mardis]. Eaton Publishing, Natick, MA.
Morris D., Richard K.R., Wright J.M. 1996. Microsatellites from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their use for genetic study of salmonids // Can. J. Fish. Aquat. Sci. V. 53. P. 120-126.
Nelson R.J., Beacham T.D. 1999. Isolation cross species amplification of microsatellite loci useful for study of Pacific salmon // Animal Genetic. V. 30. P. 228-229.
Scribner K.T., Gust J.R., Fields R.L. 1996. Isolation and characterization of novel microsatellite loci: cross-species amplification and population genetic applications // Can. J. Fish. Aquat. Sci. V. 53. P. 833-841.
Smith C.T., KoopB.F, NelsonR.J. 1998. Isolation and characte-rization of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) microsatellites and their use in other salmonids // Molecular Ecology. V. 7. P. 1613-1621.
Sokal R.R., Rohlf FG. 1981. Biometry // 2nd ed. W.H. Freemen & Co., San-Francisco, CA, 859 p.
Tautz D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Res. 17. P. 6463-6471.
Varnavskaya N.V., Wood C.C., Everett R.J., Wilmot R.L., Varnavsky VS., Midanaya VV, Quinn T.P. 1994. Genetic differentiation of subpopulations of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) within lakes of Alaska, British Columbia and Kamchatka // Can. J. Fish Aquat. Sci. V. 51 (Suppl.). P. 147-157.
