Исследования тепловых режимов работы при проведении ПЦР, направленные на улучшение характеристик приборов АНК-16/32 Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2007, том 17, № 3, c. 46-53

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК547.963.32: 621.3.082.63

© О. А. Леонтьева, А. И. Петров

ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕПЛОВЫХ РЕЖИМОВ РАБОТЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПЦР, НАПРАВЛЕННЫЕ НА УЛУЧШЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИБОРОВ АНК-16/32

Рассмотрены тепловые режимы работы прибора АНК-16/32 (анализатора нуклеиновых кислот). Исследована зависимость напряжения, подаваемого на элемент Пельтье, и скорости проведения ПЦР-РВ. Произведен анализ разности температур планшета и реакционной смеси.

ВВЕДЕНИЕ

В 1983 г. сотрудник фирмы "Сйш" Кагу Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР стал одним из крупнейших методологических открытий в современной молекулярной биологии. Применяемый при анализе ДНК, он позволяет сегодня решать такие научно-исследовательские и диагностические задачи, как диагностика социально значимых заболеваний, например гепатитов В и С, туберкулеза, СПИД; анализ онкологических и генетических заболеваний; гено-типирование (в медицине используется, например, для определения антибиотико-резистентных штаммов); в криминалистике — идентификация личности; в сельском хозяйстве — селекция ценных пород животных и сортов растений; идентификация генных мутаций; мониторинг экспрессии генов при разработке новых лекарственных средств и многие другие.

К разработке оборудования для проведения ПЦР приступили практически одновременно с разработкой самого метода. За два десятилетия в про-мышленно развитых странах создано много вариантов устройств для реализации ПЦР — амплифи-каторов ДНК. Наша статья посвящена оптимизации параметров рабочих процессов анализатора нуклеиновых кислот (АНК-16, АНК-32).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Анализаторы нуклеиновых кислот АНК-16 и АНК-32 (рис. 1) — одни из первых отечественных амплификаторов ДНК для количественного анализа в реальном времени. В состав приборов входят блоки тепловой и оптический. Тепловой блок ам-плификатора обеспечивает экспоненциальное увеличение продукта ПЦР-реакции. Оптический блок

обеспечивает возбуждение и детекцию сигнала флуоресценции реакционной смеси, находящейся в пробирке. Изменение сигнала флуоресценции позволяет проследить кинетику ПЦР, рассчитать исходное количество ДНК и сравнить образцы между собой.

Четырехцветное измерение сигнала флуоресценции дает возможность наблюдать четыре независимых реакции в одном образце одновременно.

Температура, °С

92 87 82

72 67 62 57

1 39 77 115 153 191 229 267 305 343 381 419 457 495 533 571 609 647 685 723 761

Время, с

Рис. 2. Классическая циклограмма

97

О 92

°

С 87

сЗ

£82

о. 77

g 72

е

^ 67 62 57

0 200 400 600 800

Время, с

Рис. 3. Циклический двухэтапный режим работы

Количество ячеек для образцов — 16/32 (0.2 мл). Типовая скорость нагрева—охлаждения 1.21.5 °С/с. Классическая циклограмма показана на рис. 2. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов.

1)Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95 °С, в результате чего двухцепочеч-ные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2) Отжиг. На втором этапе праймеры (искусственно синтезированные олигонуклеотиды) комплементарно присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (по англ. "annealing"). Отжиг проходит при температуре 50-60 °С. Подбор праймеров осуществляется таким образом, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементар-ности Чаргаффа, означающим, что в двухцепо-чечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цито-зин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. После отжига праймеров Taq-полимераза (термостабильный фермент) начинает комплементарное достраивание второй цепи ДНК.

3) Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы (72-75 °С), во время чего осуществляется фетментативное удлинение прай-меров и построение таким образом новых комплементарных цепей ДНК.

Часто, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию (рис. 3). Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, накапливаются в геометрической прогрессии

, Тепловая крышка

1 I

\

'Планшет

- Внешний датчик -Внутренний датчик

Элемент Пельтье Радиатор

Вентилятор

Рис. 4. Схема исследуемой системы

и начинают доминировать среди продуктов амплификации.

На приборе АНК-16 (АНК-32) в среднем время анализа составляет 1 ч 40 мин (40 циклов). На один цикл затрачивается 110 с, а именно: на переходные процессы нагрев—охлаждение и охлаждение—нагрев необходимо в сумме около 40 с, плюс 20 с — время нахождения "на полке" 95 °С и 50 с — время нахождения "на полке" 60 °С. Сокращение времени переходного процесса дает возможность проведения большего количества ПЦР-реакций за период рабочего дня.

Рассмотрим упрощенную модель теплового блока АНК-16 (рис. 4). Расчетная область модели включает:

— планшет для пробирок (рис. 5), выполненный из алюминиевого сплава;

— температурный датчик (внутренний датчик температуры);

— элемент Пельтье;

95 °С •

60 °С ■

60 с

60 с

Рис. 6. Циклический режим работы прибора

радиатор; вентилятор.

Элемент Пельтье является источником тепловой энергии при реализации температурного протокола. Термостатируемый объем ограничен тепловой крышкой, выполненной из алюминиевого сплава. В приборах АНК-16/32 температура тепловой крышки устанавливается 104 / 106 °С соответственно. Параметры работы элемента Пельтье — 16 В, 6 А.

В наших исследованиях использовались два типа датчиков температуры — внешний и внутренний. Внешний датчик температуры размещался в пробирке объемом 0.2 мл (фирма "Axygen", PCR-0.2D-C), в которой находилось 25 мкл вазелинового масла. Внутренний температурный датчик изначально установлен в приборе АНК. Типы датчиков: внутренний — AD590JF; внешний — HEL700-U-1-A фирмы HONEYWELL, 1 кОм, 1.65 х 1.27 мм.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Режим измерений

Анализатор нуклеиновых кислот (АНК-16) работал в циклическом режиме. Время нахождения "на полке" 60-95 °С составляло 60 секунд (рис. 6). Использование двухэтапного ПЦР и выбор температур соответствовал стандартным значениям при проведении полимеразной цепной реакции на наборах ЗАО "Синтол".

Напряжение на элементе Пельтье с помощью внешнего регулируемого блока питания марки "Ма81ееЬ НУ3020" изменяли в интервале от 10 до 31 В при токе до 20 А.

97 92 ^ 87

s 82 &

if 77

200

400 Время, с

600

800

Рис. 7. График зависимости температуры от времени (напряжение 29 В). —▲— показания внешнего датчика;

-♦— показания внутреннего датчика

Данные, полученные датчиками, обрабатывались с помощью персональной ЭВМ. Для каждого датчика была получена зависимость температуры от времени с шагом по времени в одну секунду. После обработки полученных данных получили семейство графиков вида рис. 7. Проанализируем полученные данные.

Анализ результатов

Скорость

По полученным данным рассчитали скорость нагрева (60-95 °С) и охлаждения (95-60 °С) по обоим датчикам, выбрав интервал на линейном участке графика (в переходном процессе); разницу между конечными точками интервала делим на количество точек в нем.

На графике рис. 8 видно, что при увеличении подводимого к системе напряжения линейно ускоряется процесс нагрева. В тоже время иная ситуация с охлаждением: увеличение напряжения не приводит к увеличению скорости охлаждения.

Рассмотрим процесс переноса тепла в нашей системе. Процессы в элементе Пельтье основаны на том, что носители заряда (электроны или дырки), пройдя через спай, попадают в область с меньшей энергией, передают избыток энергии кристаллической решетке, в результате чего вбли-

72

67

0

зи контакта происходит выделение теплоты Пель-тье > 0) и температура контакта повышается. При этом на другом спае носители, переходя в область с большей энергией, заимствуют недостающую энергию от решетки; происходит поглощение теплоты Пельтье < 0) и понижение температуры. Таким образом, в зависимости от направления тока выделяется или поглощается некоторое количество тепла QП, пропорциональное прошедшему через контакт заряду (1):

Qn = П ■ I ■ t,

(1)

где П — коэффициент Пельтье, зависящий от природы материалов элемента; I — сила тока; I — время.

При прохождении тока в цепи происходит выделение джоулева тепла:

,жоуль

1 ^ПельтБе? (2)

где ДПельтье — омическое сопротивление элемента Пельтье.

Также присутствует и явление Томсона, которое заключается в том, что если вдоль проводника, по которому течет ток, существует перепад температур, то в дополнение к теплоте Джоуля будет выделяться или поглощаться некоторое количество теплоты, пропорциональное прошедшему заряду

Qт = т (Т - пуп. (3)

Коэффициент Томсона т зависит от природы материала.

На радиаторе, обдуваемом вентилятором, происходит рассеяние тепла ОрассеяНия, величина которого зависит от площади радиатора и производительности вентилятора. Процессы переноса тепла в нашей системе можно описать уравнениями (4) при нагреве

Q = ^+Qд

жоуль + QТ Qрассеяния (4)

и (5) — при охлаждении

Q = QП — ^Джоуль + QТ + Qрассеяния. (5)

Когда Qджоуль становится сравнимо по величине с QП и Qт, скорость охлаждения начинает зависеть только от Qрассеяния и не зависит от работы элемента Пельтье.

Снижение скорости охлаждения происходит из-за того, что при увеличении подводимой мощности увеличивается рост потерь в самом элементе Пельтье, что согласуется с моделью процессов, происходящих в нем.

При нагревании Qрассеяния практически не зависит от процессов в элементе Пельтье, и мы получаем рост эффективности нагрева с увеличением тока через элемент Пельтье.

(Скорость), °С/с

4.0 -,

3.5

З.О

2.5

О. О

Э.О 11.0 13.0 15.0 17,0 1Э.О 21.0 23.О 25.0 27.0 2Э.О 31.0

Напряжение, В

Рис. 8. График зависимости скорости нагрева—охлаждения от напряжения на элементе Пельтье.

—♦— скорость при нагревании (внутренний датчик), —▲— скорость при нагревании (внешний датчик),

- скорость при охлаждении (внутренний датчик), скорость при охлаждении (внешний датчик)

Эта информация дает возможность исследования тепловых режимов работы прибора АНК, а также произвести оценку датчиков. В среднем скорость нагревания планшета по внутреннему датчику равна 2.2 °С/с (+/- 0.1 °С/с ) при и = 19 В, при охлаждении — 1.3 °С/с (+/- 0.1 °С/с) при и = 12 В; скорость нагревания реакционной смеси, по внешнему датчику, равна 13 °С/с (+/- 0.1°С/с), скорость охлаждения — 1 °С/с (+/- 0.1 °С/с).

Время установления

Введем понятие "время установления". Под временем установления /уст будем понимать время (в секундах) достижения заданной температуры планшета и реакционной смеси, что соответствует показаниям датчиков температуры.

Рассчитать время установления можно следующим образом. Выбираем передний фронт циклограммы (рис. 9, а). Момент времени, когда на-

Рис. 9. Графики зависимости температуры от времени. Ряд1 — показания внешнего датчика, ряд2 — показани

чинаются изменения показаний обоих датчиков, принимаем за нулевое. Когда внутренний датчик достигает отметки 94 °С (+/- 0.5 °С), фиксируем время Аналогично выбираем точку по внешнему датчику, получая время /2. Таким образом, время установления — это

/уст " = /2 - /1 ,

где — время нагревания планшета по внутреннему датчику (с), /2 — время нагревания реакционной смеси по внешнему датчику (с).

Таким же способом можно рассчитать /уст для 60 °С (+/- 0.5 °С) (рис. 9, б).

Рассчитав /уст при каждом напряжении, рассмотрим графики зависимости времени установления температуры в пробирке в зависимости от изменения напряжения (рис. 10, 11).

внутреннего датчика

* Ряд) Ряд 2 А РяД-3

Напряжение, В

Рис. 10. График зависимости времени установления нагревания от напряжения.

Ряд1 — время установления температуры 95 °С (+/- 0.5 °С) в реакционной смеси в зависимости от напряжения на элементе Пельтье; ряд2 — время нагревания планшета по внутреннему датчику от напряжения; ряд3 — время нагревания реакционной смеси по внешнему датчику от напряжения

■ Ряд1

Ряд2

—А— РядЗ

Напряжение, В

Рис. 11. График зависимости времени установления охлаждения от напряжения. Ряд1 — время установления температуры 60 °С (+/- 0.5 °С) в реакционной смеси в зависимости от напряжения на элементе Пельтье; ряд2 — время охлаждения реакционной смеси (по внешнему датчику) от напряжения; ряд3 — время охлаждения планшета (по внутреннему датчику) от напряжения

Из графика рис. 10 видно, что при напряжении на элементе Пельтье 10 В время нагревания исследуемой системы составляет 65-80 с, при напряжении 30 В — время находится в диапазоне 10-40 с. Учитывая ¿уст, делаем вывод, что увеличение подаваемого напряжения больше 19 В бессмысленно, т. к. увеличение мощности не дает выигрыша во времени.

При охлаждении (рис. 11) наиболее возможным видится уменьшение напряжения на элементе Пельтье до 14 В.

Разность температур

Разность температур в нашей системе — это разность в показаниях внешнего и внутреннего температурных датчиков, находящихся в приборе АНК, в фиксированный момент времени. Мы будем рассматривать два случая:

первый — когда внешний датчик достиг отметки 95 °С (+/- 0.5 °С);

второй — когда внутренний датчик достиг отметки 95 °С (+/- 0.5 °С).

Первый случай будем экстраполировать, т. к. реального эксперимента система не выдержит. Для этого (рис. 12) температурным уровнем Т2 ~ 95 °С выделяем начальный квазилинейный участок кривой ряд1 (« 65-95 °С). Его проекция на кривую ряд2 дает соответствующий ему начальный участок на кривой ряд2 до соответственной точки с температурным уровнем Т1. Когда планшет нагрет до заданной температуры Т2 (95 °С (+/- 0.5 °С)), то температура пробы в пробирке достигла 80 °С (точка Т1). Линейно аппроксимируем выделенные начальные участки на обеих кривых и экстраполируем полученные прямые: для ряд2 — до пересечения с уровнем Т2, для ряд1 — до точки-проекции полученного пересечения (с получением соответственного температурного уровня Т3). Когда температура

Время, с

Рис. 12. График зависимости температуры от времени.

Ряд1 — показания внутреннего датчика; ряд2 — показания внешнего датчика

в пробирке достигнет Т2, тогда прибор будет нагрет до температуры Т3 (около 115 °С). Повышение температуры до такой высокой отметки губительно для реакционной смеси.

Таким образом, речь идет о двух случаях разности температур: Т - Т2 и Т2 - Т3. Первый (Т1 -- Т2) показывает разницу температур между планшетом и реакционной смесью в пробирке, когда планшет нагрелся до заданной температуры. Второй — скорее теоретический, для иллюстрации картины, которая возможна при установлении температуры в пробирке 95 °С (+/- 0.5 °С).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

<1

45 40

35 ЗФ 25 20

10 5 0

■

V = 27,4"1х -11,757 V

. 2

4

у к \\

'v.

(1(1

ОгОО 0.5Q 1.01} 1,50 2,0 t Скорость нагрева (внешний датчик), °С/с

0 12 3 4

Скорость нагрева (внутренний датчик), °С/с

Рис. 13. Оценка разности температур АТ в зависимости от скорости нагревания внешнего датчика (а) и внутреннего (б)

Оценив зависимость разности температур от скорости нагрева (рис. 13), делаем вывод: чем быстрее происходит нагрев пробирки, тем больше разность температур между планшетом и реакционной смесью. В нашем опыте она составляет 12.2 °С (рис. 13).

Из-за наличия разности температур мы не можем гарантировать поддержание заданной температуры в реакционной смеси. Для уверенности в том, что заданная температура в пробирке установилась, необходимо после окончания нагревания ждать /уст. Увеличение скорости нагревания приводит к увеличению разности температур, что в свою очередь требует большего времени установления заданной температуры в пробирке.

Проведенные исследования позволили разобраться в механизме тепловых рабочих процессов прибора АНК, что позволило сформулировать ряд рекомендаций для оптимизации параметров прибора. В частности, рекомендованы параметры режимов питания элементов Пельтье в режиме нагрева—охлаждения: инагр = 19 В, иохл = 14 В, что позволило увеличить скорость нагрева в 2 раза, а охлаждения в 1.2 раза. Общее время анализа при этом сократилось на 10-15 мин.

Было получено значение времени установления (равномерного прогрева реакционной смеси) для пробирок фирмы "Axygen" с объемом реакционной смеси 25 мкл и рекомендовано значение задержки начала измерений в 12 с от момента времени прогрева планшета до заданной температуры.

Анализ разности температур планшета и реакционной смеси показал, что дальнейшее увеличение скорости нагрева более 2 °С/с (+/-0.1 °С/с) приводит к большому значению разности температур (больше 10 °С) и, следовательно, к увеличению неоднородности температуры реакционной смеси, тем самым ухудшая качество проведения ПЦР-реакций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Чернышев А.В. Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР-диагностики. Автореф. дис. ... д-ра техн. наук. М., 2006.

2. Иоффе А.Ф. Полупроводниковые элементы. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1960. 188 с. (С. 5758).

3. Лемаренко М., Хоронжук Р. и др. Лабораторная работа по эффекту Пельтье. М.: СПбГУ, 2002. С. 8-9.

4. Воробьев А.А. ДНК-технология. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. М.: Изд-во ООО "Медицинское информационное агентство", 2005. С. 15-17.

5. Чернышев А.В., Бакай Д.А., Курочкин В.Е., Соколов В.Н., Скоблилов Е.Ю. Моделирование теплового состояния микропробирок с образцами в ходе полимеразной цепной реакции // Научное приборостроение. 2005. T. 15, № 3. С.54-62.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург

Материал поступил в редакцию 20.06.2007.

а

б

INVESTIGATION OF PCR THERMAL CONDITIONS AIMED AT IMPROVEMENT OF CHARACTERISTICS OF DEVICES "ANK-16/32"

O. A. Leonteva, A. I. Petrov

Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

The paper considers the NAA (Nuclear Acid Analyzer) thermal operating conditions. The dependence of voltage applied to the Peltie element and Real-Time PCR rate has been studied. The difference in temperatures of the tablet and reaction mix has been analyzed.