Научная статья на тему 'Исследования тепловых режимов работы при проведении ПЦР, направленные на улучшение характеристик приборов АНК-16/32'

Исследования тепловых режимов работы при проведении ПЦР, направленные на улучшение характеристик приборов АНК-16/32 Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

CC BY
85
17
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по химическим технологиям, автор научной работы — Леонтьева О. А., Петров А. И.

Рассмотрены тепловые режимы работы прибора АНК-16/32 (анализатора нуклеиновых кислот). Исследована зависимость напряжения, подаваемого на элемент Пельтье, и скорости проведения ПЦР-РВ. Произведен анализ разности температур планшета и реакционной смеси.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим технологиям , автор научной работы — Леонтьева О. А., Петров А. И.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

INVESTIGATION OF PCR thermal CONDITIONS AIMED AT improvement of characteristics OF devices "ANK-16/32"1

The paper considers the NAA (Nuclear Acid Analyzer) thermal operating conditions. The dependence of voltage applied to the Peltie element and Real-Time PCR rate has been studied. The difference in temperatures of the tablet and reaction mix has been analyzed.

Текст научной работы на тему «Исследования тепловых режимов работы при проведении ПЦР, направленные на улучшение характеристик приборов АНК-16/32»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2007, том 17, № 3, c. 46-53

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК547.963.32: 621.3.082.63

© О. А. Леонтьева, А. И. Петров

ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕПЛОВЫХ РЕЖИМОВ РАБОТЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПЦР, НАПРАВЛЕННЫЕ НА УЛУЧШЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИБОРОВ АНК-16/32

Рассмотрены тепловые режимы работы прибора АНК-16/32 (анализатора нуклеиновых кислот). Исследована зависимость напряжения, подаваемого на элемент Пельтье, и скорости проведения ПЦР-РВ. Произведен анализ разности температур планшета и реакционной смеси.

ВВЕДЕНИЕ

В 1983 г. сотрудник фирмы "Сйш" Кагу Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР стал одним из крупнейших методологических открытий в современной молекулярной биологии. Применяемый при анализе ДНК, он позволяет сегодня решать такие научно-исследовательские и диагностические задачи, как диагностика социально значимых заболеваний, например гепатитов В и С, туберкулеза, СПИД; анализ онкологических и генетических заболеваний; гено-типирование (в медицине используется, например, для определения антибиотико-резистентных штаммов); в криминалистике — идентификация личности; в сельском хозяйстве — селекция ценных пород животных и сортов растений; идентификация генных мутаций; мониторинг экспрессии генов при разработке новых лекарственных средств и многие другие.

К разработке оборудования для проведения ПЦР приступили практически одновременно с разработкой самого метода. За два десятилетия в про-мышленно развитых странах создано много вариантов устройств для реализации ПЦР — амплифи-каторов ДНК. Наша статья посвящена оптимизации параметров рабочих процессов анализатора нуклеиновых кислот (АНК-16, АНК-32).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Анализаторы нуклеиновых кислот АНК-16 и АНК-32 (рис. 1) — одни из первых отечественных амплификаторов ДНК для количественного анализа в реальном времени. В состав приборов входят блоки тепловой и оптический. Тепловой блок ам-плификатора обеспечивает экспоненциальное увеличение продукта ПЦР-реакции. Оптический блок

обеспечивает возбуждение и детекцию сигнала флуоресценции реакционной смеси, находящейся в пробирке. Изменение сигнала флуоресценции позволяет проследить кинетику ПЦР, рассчитать исходное количество ДНК и сравнить образцы между собой.

Четырехцветное измерение сигнала флуоресценции дает возможность наблюдать четыре независимых реакции в одном образце одновременно.

Температура, °С

92 87 82

72 67 62 57

1 39 77 115 153 191 229 267 305 343 381 419 457 495 533 571 609 647 685 723 761

Время, с

Рис. 2. Классическая циклограмма

97

О 92

°

С 87

сЗ

£82

о. 77

g 72

е

^ 67 62 57

0 200 400 600 800

Время, с

Рис. 3. Циклический двухэтапный режим работы

Количество ячеек для образцов — 16/32 (0.2 мл). Типовая скорость нагрева—охлаждения 1.21.5 °С/с. Классическая циклограмма показана на рис. 2. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов.

1)Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95 °С, в результате чего двухцепочеч-ные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2) Отжиг. На втором этапе праймеры (искусственно синтезированные олигонуклеотиды) комплементарно присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (по англ. "annealing"). Отжиг проходит при температуре 50-60 °С. Подбор праймеров осуществляется таким образом, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементар-ности Чаргаффа, означающим, что в двухцепо-чечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цито-зин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. После отжига праймеров Taq-полимераза (термостабильный фермент) начинает комплементарное достраивание второй цепи ДНК.

3) Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы (72-75 °С), во время чего осуществляется фетментативное удлинение прай-меров и построение таким образом новых комплементарных цепей ДНК.

Часто, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию (рис. 3). Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, накапливаются в геометрической прогрессии

, Тепловая крышка

1 I

\

'Планшет

- Внешний датчик -Внутренний датчик

Элемент Пельтье Радиатор

Вентилятор

Рис. 4. Схема исследуемой системы

и начинают доминировать среди продуктов амплификации.

На приборе АНК-16 (АНК-32) в среднем время анализа составляет 1 ч 40 мин (40 циклов). На один цикл затрачивается 110 с, а именно: на переходные процессы нагрев—охлаждение и охлаждение—нагрев необходимо в сумме около 40 с, плюс 20 с — время нахождения "на полке" 95 °С и 50 с — время нахождения "на полке" 60 °С. Сокращение времени переходного процесса дает возможность проведения большего количества ПЦР-реакций за период рабочего дня.

Рассмотрим упрощенную модель теплового блока АНК-16 (рис. 4). Расчетная область модели включает:

— планшет для пробирок (рис. 5), выполненный из алюминиевого сплава;

— температурный датчик (внутренний датчик температуры);

— элемент Пельтье;

95 °С •

60 °С ■

60 с

60 с

Рис. 6. Циклический режим работы прибора

радиатор; вентилятор.

Элемент Пельтье является источником тепловой энергии при реализации температурного протокола. Термостатируемый объем ограничен тепловой крышкой, выполненной из алюминиевого сплава. В приборах АНК-16/32 температура тепловой крышки устанавливается 104 / 106 °С соответственно. Параметры работы элемента Пельтье — 16 В, 6 А.

В наших исследованиях использовались два типа датчиков температуры — внешний и внутренний. Внешний датчик температуры размещался в пробирке объемом 0.2 мл (фирма "Axygen", PCR-0.2D-C), в которой находилось 25 мкл вазелинового масла. Внутренний температурный датчик изначально установлен в приборе АНК. Типы датчиков: внутренний — AD590JF; внешний — HEL700-U-1-A фирмы HONEYWELL, 1 кОм, 1.65 х 1.27 мм.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Режим измерений

Анализатор нуклеиновых кислот (АНК-16) работал в циклическом режиме. Время нахождения "на полке" 60-95 °С составляло 60 секунд (рис. 6). Использование двухэтапного ПЦР и выбор температур соответствовал стандартным значениям при проведении полимеразной цепной реакции на наборах ЗАО "Синтол".

Напряжение на элементе Пельтье с помощью внешнего регулируемого блока питания марки "Ма81ееЬ НУ3020" изменяли в интервале от 10 до 31 В при токе до 20 А.

97 92 ^ 87

s 82 &

if 77

200

400 Время, с

600

800

Рис. 7. График зависимости температуры от времени (напряжение 29 В). —▲— показания внешнего датчика;

-♦— показания внутреннего датчика

Данные, полученные датчиками, обрабатывались с помощью персональной ЭВМ. Для каждого датчика была получена зависимость температуры от времени с шагом по времени в одну секунду. После обработки полученных данных получили семейство графиков вида рис. 7. Проанализируем полученные данные.

Анализ результатов

Скорость

По полученным данным рассчитали скорость нагрева (60-95 °С) и охлаждения (95-60 °С) по обоим датчикам, выбрав интервал на линейном участке графика (в переходном процессе); разницу между конечными точками интервала делим на количество точек в нем.

На графике рис. 8 видно, что при увеличении подводимого к системе напряжения линейно ускоряется процесс нагрева. В тоже время иная ситуация с охлаждением: увеличение напряжения не приводит к увеличению скорости охлаждения.

Рассмотрим процесс переноса тепла в нашей системе. Процессы в элементе Пельтье основаны на том, что носители заряда (электроны или дырки), пройдя через спай, попадают в область с меньшей энергией, передают избыток энергии кристаллической решетке, в результате чего вбли-

72

67

0

зи контакта происходит выделение теплоты Пель-тье > 0) и температура контакта повышается. При этом на другом спае носители, переходя в область с большей энергией, заимствуют недостающую энергию от решетки; происходит поглощение теплоты Пельтье < 0) и понижение температуры. Таким образом, в зависимости от направления тока выделяется или поглощается некоторое количество тепла QП, пропорциональное прошедшему через контакт заряду (1):

Qn = П ■ I ■ t,

(1)

где П — коэффициент Пельтье, зависящий от природы материалов элемента; I — сила тока; I — время.

При прохождении тока в цепи происходит выделение джоулева тепла:

,жоуль

1 ^ПельтБе? (2)

где ДПельтье — омическое сопротивление элемента Пельтье.

Также присутствует и явление Томсона, которое заключается в том, что если вдоль проводника, по которому течет ток, существует перепад температур, то в дополнение к теплоте Джоуля будет выделяться или поглощаться некоторое количество теплоты, пропорциональное прошедшему заряду

Qт = т (Т - пуп. (3)

Коэффициент Томсона т зависит от природы материала.

На радиаторе, обдуваемом вентилятором, происходит рассеяние тепла ОрассеяНия, величина которого зависит от площади радиатора и производительности вентилятора. Процессы переноса тепла в нашей системе можно описать уравнениями (4) при нагреве

Q = ^+Qд

жоуль + QТ Qрассеяния (4)

и (5) — при охлаждении

Q = QП — ^Джоуль + QТ + Qрассеяния. (5)

Когда Qджоуль становится сравнимо по величине с QП и Qт, скорость охлаждения начинает зависеть только от Qрассеяния и не зависит от работы элемента Пельтье.

Снижение скорости охлаждения происходит из-за того, что при увеличении подводимой мощности увеличивается рост потерь в самом элементе Пельтье, что согласуется с моделью процессов, происходящих в нем.

При нагревании Qрассеяния практически не зависит от процессов в элементе Пельтье, и мы получаем рост эффективности нагрева с увеличением тока через элемент Пельтье.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

(Скорость), °С/с

4.0 -,

3.5

З.О

2.5

О. О

Э.О 11.0 13.0 15.0 17,0 1Э.О 21.0 23.О 25.0 27.0 2Э.О 31.0

Напряжение, В

Рис. 8. График зависимости скорости нагрева—охлаждения от напряжения на элементе Пельтье.

—♦— скорость при нагревании (внутренний датчик), —▲— скорость при нагревании (внешний датчик),

- скорость при охлаждении (внутренний датчик), скорость при охлаждении (внешний датчик)

Эта информация дает возможность исследования тепловых режимов работы прибора АНК, а также произвести оценку датчиков. В среднем скорость нагревания планшета по внутреннему датчику равна 2.2 °С/с (+/- 0.1 °С/с ) при и = 19 В, при охлаждении — 1.3 °С/с (+/- 0.1 °С/с) при и = 12 В; скорость нагревания реакционной смеси, по внешнему датчику, равна 13 °С/с (+/- 0.1°С/с), скорость охлаждения — 1 °С/с (+/- 0.1 °С/с).

Время установления

Введем понятие "время установления". Под временем установления /уст будем понимать время (в секундах) достижения заданной температуры планшета и реакционной смеси, что соответствует показаниям датчиков температуры.

Рассчитать время установления можно следующим образом. Выбираем передний фронт циклограммы (рис. 9, а). Момент времени, когда на-

Рис. 9. Графики зависимости температуры от времени. Ряд1 — показания внешнего датчика, ряд2 — показани

чинаются изменения показаний обоих датчиков, принимаем за нулевое. Когда внутренний датчик достигает отметки 94 °С (+/- 0.5 °С), фиксируем время Аналогично выбираем точку по внешнему датчику, получая время /2. Таким образом, время установления — это

/уст " = /2 - /1 ,

где — время нагревания планшета по внутреннему датчику (с), /2 — время нагревания реакционной смеси по внешнему датчику (с).

Таким же способом можно рассчитать /уст для 60 °С (+/- 0.5 °С) (рис. 9, б).

Рассчитав /уст при каждом напряжении, рассмотрим графики зависимости времени установления температуры в пробирке в зависимости от изменения напряжения (рис. 10, 11).

внутреннего датчика

* Ряд) Ряд 2 А РяД-3

Напряжение, В

Рис. 10. График зависимости времени установления нагревания от напряжения.

Ряд1 — время установления температуры 95 °С (+/- 0.5 °С) в реакционной смеси в зависимости от напряжения на элементе Пельтье; ряд2 — время нагревания планшета по внутреннему датчику от напряжения; ряд3 — время нагревания реакционной смеси по внешнему датчику от напряжения

■ Ряд1

Ряд2

—А— РядЗ

Напряжение, В

Рис. 11. График зависимости времени установления охлаждения от напряжения. Ряд1 — время установления температуры 60 °С (+/- 0.5 °С) в реакционной смеси в зависимости от напряжения на элементе Пельтье; ряд2 — время охлаждения реакционной смеси (по внешнему датчику) от напряжения; ряд3 — время охлаждения планшета (по внутреннему датчику) от напряжения

Из графика рис. 10 видно, что при напряжении на элементе Пельтье 10 В время нагревания исследуемой системы составляет 65-80 с, при напряжении 30 В — время находится в диапазоне 10-40 с. Учитывая ¿уст, делаем вывод, что увеличение подаваемого напряжения больше 19 В бессмысленно, т. к. увеличение мощности не дает выигрыша во времени.

При охлаждении (рис. 11) наиболее возможным видится уменьшение напряжения на элементе Пельтье до 14 В.

Разность температур

Разность температур в нашей системе — это разность в показаниях внешнего и внутреннего температурных датчиков, находящихся в приборе АНК, в фиксированный момент времени. Мы будем рассматривать два случая:

первый — когда внешний датчик достиг отметки 95 °С (+/- 0.5 °С);

второй — когда внутренний датчик достиг отметки 95 °С (+/- 0.5 °С).

Первый случай будем экстраполировать, т. к. реального эксперимента система не выдержит. Для этого (рис. 12) температурным уровнем Т2 ~ 95 °С выделяем начальный квазилинейный участок кривой ряд1 (« 65-95 °С). Его проекция на кривую ряд2 дает соответствующий ему начальный участок на кривой ряд2 до соответственной точки с температурным уровнем Т1. Когда планшет нагрет до заданной температуры Т2 (95 °С (+/- 0.5 °С)), то температура пробы в пробирке достигла 80 °С (точка Т1). Линейно аппроксимируем выделенные начальные участки на обеих кривых и экстраполируем полученные прямые: для ряд2 — до пересечения с уровнем Т2, для ряд1 — до точки-проекции полученного пересечения (с получением соответственного температурного уровня Т3). Когда температура

Время, с

Рис. 12. График зависимости температуры от времени.

Ряд1 — показания внутреннего датчика; ряд2 — показания внешнего датчика

в пробирке достигнет Т2, тогда прибор будет нагрет до температуры Т3 (около 115 °С). Повышение температуры до такой высокой отметки губительно для реакционной смеси.

Таким образом, речь идет о двух случаях разности температур: Т - Т2 и Т2 - Т3. Первый (Т1 -- Т2) показывает разницу температур между планшетом и реакционной смесью в пробирке, когда планшет нагрелся до заданной температуры. Второй — скорее теоретический, для иллюстрации картины, которая возможна при установлении температуры в пробирке 95 °С (+/- 0.5 °С).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

<1

45 40

35 ЗФ 25 20

10 5 0

V = 27,4"1х -11,757 V

. 2

4

у к \\

'v.

(1(1

ОгОО 0.5Q 1.01} 1,50 2,0 t Скорость нагрева (внешний датчик), °С/с

0 12 3 4

Скорость нагрева (внутренний датчик), °С/с

Рис. 13. Оценка разности температур АТ в зависимости от скорости нагревания внешнего датчика (а) и внутреннего (б)

Оценив зависимость разности температур от скорости нагрева (рис. 13), делаем вывод: чем быстрее происходит нагрев пробирки, тем больше разность температур между планшетом и реакционной смесью. В нашем опыте она составляет 12.2 °С (рис. 13).

Из-за наличия разности температур мы не можем гарантировать поддержание заданной температуры в реакционной смеси. Для уверенности в том, что заданная температура в пробирке установилась, необходимо после окончания нагревания ждать /уст. Увеличение скорости нагревания приводит к увеличению разности температур, что в свою очередь требует большего времени установления заданной температуры в пробирке.

Проведенные исследования позволили разобраться в механизме тепловых рабочих процессов прибора АНК, что позволило сформулировать ряд рекомендаций для оптимизации параметров прибора. В частности, рекомендованы параметры режимов питания элементов Пельтье в режиме нагрева—охлаждения: инагр = 19 В, иохл = 14 В, что позволило увеличить скорость нагрева в 2 раза, а охлаждения в 1.2 раза. Общее время анализа при этом сократилось на 10-15 мин.

Было получено значение времени установления (равномерного прогрева реакционной смеси) для пробирок фирмы "Axygen" с объемом реакционной смеси 25 мкл и рекомендовано значение задержки начала измерений в 12 с от момента времени прогрева планшета до заданной температуры.

Анализ разности температур планшета и реакционной смеси показал, что дальнейшее увеличение скорости нагрева более 2 °С/с (+/-0.1 °С/с) приводит к большому значению разности температур (больше 10 °С) и, следовательно, к увеличению неоднородности температуры реакционной смеси, тем самым ухудшая качество проведения ПЦР-реакций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Чернышев А.В. Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР-диагностики. Автореф. дис. ... д-ра техн. наук. М., 2006.

2. Иоффе А.Ф. Полупроводниковые элементы. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1960. 188 с. (С. 5758).

3. Лемаренко М., Хоронжук Р. и др. Лабораторная работа по эффекту Пельтье. М.: СПбГУ, 2002. С. 8-9.

4. Воробьев А.А. ДНК-технология. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. М.: Изд-во ООО "Медицинское информационное агентство", 2005. С. 15-17.

5. Чернышев А.В., Бакай Д.А., Курочкин В.Е., Соколов В.Н., Скоблилов Е.Ю. Моделирование теплового состояния микропробирок с образцами в ходе полимеразной цепной реакции // Научное приборостроение. 2005. T. 15, № 3. С.54-62.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург

Материал поступил в редакцию 20.06.2007.

а

б

INVESTIGATION OF PCR THERMAL CONDITIONS AIMED AT IMPROVEMENT OF CHARACTERISTICS OF DEVICES "ANK-16/32"

O. A. Leonteva, A. I. Petrov

Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

The paper considers the NAA (Nuclear Acid Analyzer) thermal operating conditions. The dependence of voltage applied to the Peltie element and Real-Time PCR rate has been studied. The difference in temperatures of the tablet and reaction mix has been analyzed.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.