CC BY
60
УДК 663.534
Д. А. Шарипова (асп.)1, Я. А. Масютин (инж.)1, А. А. Новиков (к.х.н.,зав.лаб.)1, А. А. Богданов (к.ф.-м.н.)2, В. А. Винокуров (д.х.н.,проф.)1
Исследование зависимости гидролизуемости целлюлозосодержащего сырья от условий его предобработки
1 Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии, 119991, г. Москва, Ленинский просп., д. 65, корп. 1, тел. (499) 2339589, e-mail: setchemist@gmail.com
2ООО «Центр «Атоммед», 115230, г. Москва, Варшавское шоссе, д.46
D. A. Sharipova1, Ya. A. Masyutin1, A. A. Novikov1, A. A. Bogdanov2, V. A. Vinokurov1
Study on cellulose-containing biomass hydrolysis depending of its pretreatment method
1 Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii pr., 119991, Moscow, Russia; ph. (499) 2339589, e-mail: setchemist@gmail.com
2Atommed Center LLC 46, Warshavskoye shosse, 115230, Moscow, Russia
Исследовано влияние условий и способа предобработки целлюлозосодержащего сырья на его гидролизуемость. Показано, что предобработка сырья ионными жидкостями увеличивает гидролизуемость целлюлозосодержащего сырья, а предобработка у-облучением увеличивает гидролизуемость целлюлозы только в отсутствие термообработки.
Ключевые слова: у-облучение; ионные жидкости; ферментативный гидролиз; целлюлоза.
Биомасса растений является одним из основных видов сырья для производства биотоп-лив. Получение топливного этанола гидролизом и сбраживанием непищевого растительного сырья позволяет снизить конкуренцию за посевные площади между техническими культурами топливного назначения и пищевыми культурами. Для эффективного использования целлюлозосодержащего сырья (ЦС) необходима его предобработка, проводимая с целью снижения степени кристалличности целлюлозы и увеличения удельной поверхности субстрата. Известны различные способы предобработки ЦС, основанные как на физико-химических, так и на химических и биологических процессах; для ознакомления рекомендуются обзоры *'2. Настоящая работа была посвящена изучению влияния предобработки ЦС на его гидролизуемость. В качестве критерия гидролизуемости была выбрана максимальная концентрация белка в культуральной жидкости целлюлолитических микроорганизмов.
Дата поступления 28.10.12
Influence of pretreatment method and conditions on cellulose-containing biomass susceptibility to hydrolysis was studied. It is shown that ionic liquid pretreatment increases cellulose-containing biomass susceptibility to hydrolysis. y-radiation pretreatment increases this susceptibility only in the absence of heat treatment.
Key words: cellulose; enzymatic hydrolysis; ionic liquids; y-radiation.
Экспериментальная часть
Культуры микроорганизмов Myceliophthora thermophila DSM1799 и Trichoderma viride DSM63065 были получены из коллекции института Лейбница (DSMZ, Германия). Культуры микроорганизмов выращивались на средах, рекомендованных для данных штаммов (Среды DSM90 и DSM129), эксперименты по наработке белка в культуральной жидкости проводились на среде состава (г/л дистиллированной воды) NaNO3 (3.0), KCl (0.5), KH2PO4 (1.0), (NH4)2Fe(SO4)2-6H2O (0.014), MgSO4-7H2O (0.5) при pH=5.0 для штамма DSM63065 и при pH=6.5 для штамма DSM1799. Сохранение чистоты культуры контролировалось высевами на среды DSM90 и DSM129 и исследованием морфологии мицелия и спор. Микрофотографии мицелия в раздавленной капле были получены на микроскопе Orthoplan (Leitz, Германия), оснащенном фазово-контрастным конденсором и камерой DS-Fi2 (Nikon, Япония), микроэлектронографии спор
с напылением углеродом были получены на сканирующем электронном микроскопе JIB-4501 (JEOL, Япония) с детектированием вторичных электронов. Примеры микрофотографий мицелия и микроэлектронографий спор штаммов DSM1799 и DSM63065 приведены на рис. 1. Концентрация белка в культуральной жидкости определялась по методу Бредфорд 3 в модификации Зора-Селингера 4 на приборе USB4000 (Ocean Optics, США) с использованием альбумина бычьей сыворотки в качестве внешнего стандарта. Для предобработки цел-люлозосодержащего сырья использовалась ионная жидкость хлорид 1-бутил-3-метилими-дазолия (BASF, Германия), в качестве модельных субстратов использовались микрокристаллическая целлюлоза марки Avicel дисперсностью около 50 мкм и карбоксиметилцеллюлоза (Sigma-Aldrich). Содержание анионов в водной вытяжке субстратов определялось методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель-105М» (Люмэкс, Россия; ввод пробы под давлением 30 мбар в течение 5 с, ведущий электролит приготовлен из расчета 10 мМ CrO3, 30 мМ диэтаноламина и 3.0 мМ гидро-ксида цетилтриметиламмония в деионизиро-ванной воде, напряжение — 17 кВ, детектирование на длине волны 374 нм).
Рие. 1. Примеры микрофотографий мицелия (слева) и электронографий спор (справа) МЛИегто-ркНа Ю8М1799 (верхний ряд) и T.viride 08М63065 (нижний ряд)
Для изучения влияния поглощенной дозы у-облучения на гидролизуемость целлюлозосо-держащих субстратов была проведена радиационная предобработка измельченных липовых опилок на радиационно-технологической установке на основе источника 60Со. Облучение проводили до достижения поглощенной дозы 10 МРад. Были использованы три режима облучения: только облучение, облучение с последующей термообработкой при 150—160 °С,
облучение во время термообработки при 150— 160 °С. Для проведения экспериментов была отобрана фракция 0.25—0.50 мм каждого из облученных образцов и контрольного образца (без облучения).
Предобработка микрокристаллической целлюлозы проводилась путем растворения навески целлюлозы в ионной жидкости при температуре 90 °С под вакуумом из расчета 10% мас. целлюлозы. Предобработанная целлюлоза выделялась из раствора осаждением водой.
Обсуждение результатов
При предобработке ЦС происходит снижение степени кристалличности целлюлозы и увеличение ее удельной поверхности. Однако, предобработанное сырье содержит остаточные количества ионной жидкости, которая может вызывать денатурацию целлюлаз 5. Для оценки остаточного содержания ионной жидкости был произведен анализ анионного состава водной вытяжки микрокристаллической целлюлозы марки Ау1се1 до и после предобработки. Примеры электрофореграмм приведены на рис. 2. По разнице в содержании хлорид-анионов в водных вытяжках определяли остаточное содержание ионной жидкости в предобра-ботанной целлюлозе, которое составило 71 ±4 млн-1. Для оценки ингибирования ионной жидкостью выработки белка микроорганизмами были поставлены опыты с использованием в качестве субстрата карбоксиметил-целлюлозы, в том числе с добавлением в среду для культивирования 1% мас. ионной жидкости. Параллельно были поставлены опыты с использованием в качестве субстрата целлюлозы марки Ауюе1 до и после предобработки ионной жидкостью, результаты опытов показаны на рис. 3. Наибольшее накопление белка в культуральной жидкости для обоих штаммов микроорганизмов наблюдается при использовании в качестве субстрата карбоксиметилцел-люлозы без добавления ионной жидкости. Добавление в среду ионной жидкости в количестве 1% мас. снижает максимальную концентрацию белка на 35% для МЛкетторкИа и на 24% для Т.ю1т1йе. Такое незначительное инги-бирование накопления белка в культуральной жидкости при содержании в ней 1% мас. говорит о несущественности влияния остаточного содержания ионной жидкости в предобработан-ных субстратах на их гидролиз. Предобработка целлюлозы марки Ауюе1 увеличивает максимальную концентрацию белка на 16.8% для М.ЬкетторНИа и на 4.3% для Т.ютёе.
45 40 35 30 25
< 20
Е
15 10 5 0
п
6 S ~
-у-¡J -& ¡Ё * ■
этот эффект, а термообработка во время облучения — снижает максимальную концентрацию белка на 32% по сравнению с контрольным опытом. Результаты показывают, что оптимальным способом радиационной предобработки сырья для ферментативного гидролиза является облучение без нагревания образца.
■í
е
ГО
(О <0
t 1
& •
i t
Рис. 2. Примеры электрофореграмм водной вытяжки целлюлозы Лу1ее1 до и после предобработки ионной жидкостью
Контроль
Облучение Нагревание после Нагревание во облучения время облучения
á 140 ■
II
I
кмц
КМЦ+ 1%ИЖ
Avtcel предобра йоганны и
Рис. 4. Зависимость максимальной концентрации белка в культуральной жидкости М. thermophila от режима облучения субстрата (липовых опилок)
Таким образом, предобработка целлюло-зосодержащего сырья ионными жидкостями не оказывает значительного ингибирующего действия на целлюлолитические ферменты и на их выработку микроорганизмами, но повышает гидролизуемость сырья. Предобработка цел-люлозосодержащего сырья у-облучением повышает его гидролизуемость только в отсутствие температурной обработки.
Литература
1. Taherzadeh M. J., Karimi K.//Int. J. of Molecular Sciences.- 2008.- №9.- P.1621.
2. Alvira P., Tomas-Pejy E., Ballesteros M., Negro M. J. // Bioresource Technology.- 2010.-№101.- P.4851.
3. Bradford M. M.// Anal. Biochem.- 1976.- 72.-P.248.
4. Zor T., Selinger Z. // Anal. Biochem.- 1996.236.- P.302.
5. Turner M. B., Spear S. K., Huddleston J. G., Holbrey J. D., Rogers R. D. // Green Chem.-2003.- №5.- P.443.
6. Kumakura M., Kaetsu I. // Biotechnol. and Bioeng.- 1978.- №20.- P.1309.
7. Kumakura M., Kaetsu I. // Int. J. of Appl. Rad. Isotop.- 1979.- №30.- P.139.
8. Kumakura M. Kaetsu I. // Biomass.- 1983.3.- P.199.
Авторы выражают благодарность M.C. Котелеву за выполнение сканирующей электронной микроскопии, А.В. Бескоровайному и Д.С. Копицыну за выполнение анализов по методу капиллярного электрофореза.
Исследование проводится в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 гг.».
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования РФ (Государственный контракт от «01» марта 2011 г. № 16.512.11.2166).
Рис. 3. Зависимость максимальной концентрации белка в культуральной жидкости М. thermophila и Т. viride от состава субстрата
Обработка целлюлозосодержащего сырья у-облучением приводит к случайному распаду связей между мономерными звеньями целлюлозы и увеличивает скорость ее гидролиза, как показано в ряде работ японских ученых 6-8. В ходе настоящей работы проводилось облучение липовых опилок в сочетании с термообработкой. Результаты экспериментов показаны на рис. 4. Облучение целлюлозосодержащего сырья приводит к увеличению максимального содержания белка в культуральной жидкости целлюлолитических микроорганизмов на 28%. Термообработка после облучения нивелирует
4
