CC BY
12
вающих процедур на детей дошкольного возраста. Автореферат дисс.. Л., 1952. — Маршак М. Е., Теория и прэкт. физич. культуры, 1946, т. 9, в. 10, стр. 482—493. — С л о н и м А. Д., в кн.: Сборник трудов Ленингр. научн.-исслед. ин-та физ. культуры, 1950, т. 5, стр. 84—95. М.—Л., — Смирнов К. М., Военно-мед. журнал, 1951, № 11, стр. 7—13.
Поступила 5/Х 1955 г.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ВОЗДУХА ПРИ ПОМОЩИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.
СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ОКИСИ УГЛЕРОДА НА ПРОЦЕСС ФЕРМЕНТАЦИИ И ЕЕ РОЛЬ В РЕАКЦИИ ПАСТЕРА
Эндр Иеней и Сандор Сцендрей
Из Института гигиены при Медицинском институте в Дебрецене (Венгрия)
Химические и физические методы исследования загрязненности воздуха в настоящее время значительно усовершенствованы; особенно это касается определения окиси углерода. Помимо старых методов карбокси-метрии, спектографического и химического, теперь появились новые — калориметрический и нефелометрический, а также методы, основанные <на изменении электропроводности и способности растворов карбокси-гемоглобина поглощать инфракрасные лучи. Значительным преимуществом физических методов определения является их исключительная чувствительность.
В горной и в других отраслях промышленности для установления загрязнения воздуха ядовитыми веществами используются мелкие птицы или белые мыши и крысы; о загрязненности воздуха судят по симптомам отравления этих животных. Вейхгардт пользовался также биологическим методом, насыщая загрязненным воздухом раствор Рингера и наблюдая за действием этого раствора на сердце лягушки (1931 —1932). С помощью биологических методов удавалось определить совсем малые количества загрязнений, которые нельзя было определить с помощью химических методов.
По нашему мнению, для биологического определения ядовитых веществ в воздухе могут быть применены клетки пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Способность этих организмов сбраживать углеводы с образованием С02 хорошо изучена и на основании этой реакции можно проводить исследования загрязнений воздуха.
Варбург (Warburg, 1926) и многие другие исследователи после него определяли окись углерода микрореспирационным методом с помощью дрожжей. Гозио (Gosio) описал микробиологический метод определения минимальных количеств мышьяка в воздухе, основанный на том, что грибок Pénicillium brevicaule при наличии мышьяка в воздухе образует пахнущий чесноком диэтиларсин.^ С помощью этого метода А. Плеши-церу и И. О. Преображенскому в 1935 г. удалось определить наличие мышьяка в воздухе, выдыхаемом животными, отравленными мышьяком.
Мы избрали значительно более простой метод, чем определение при помощи аппарата Баркрофта-Варбурга: мы устанавливали количество образующегося газа в бродильных пробирках Эшггорна. Сначала мы пользовались высушенными на воздухе пекарскими дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) не старше двух недель в количестве 0,1 г. В более поздних опытах мы брали 0,03 г промытых и отцентрифугированных дрожжей, выращенных в течение 48 часов «а агаре Майш (Maischagar).
В закрытую трубку стандартной бродильной трубочки Эйнгорна мы вводили 19,5 мл жидкости без пузырьков воздуха. Сахар необходимо вводить в таком количестве, чтобы был возможен последующий отсчет, так как образующийся при брожении газ нужно отсчитывать в объеме 10 мл по шкале, разделенной на 10 частей. После многих предварительных испытаний оказалось, Что для этой цели лучше всего подходит доза в 92,5 мг глюкозы. Мы отмеряли в трубочки 1,85 мл 5% раствора глюкозы (т. е. 92,5 мг ее), затем добавляли упомянутое количество дрожжей. Полученные таким образом дрожжевые эмульсии разбавляли фосфатным буфером (рН 6) до 19,5 мл и этот объем смеси сразу же вводили в за-
Рнс. 1. Действие БСЬ. Сухие дрожжи 0,1 г, глюкоза 92,5 мг, период брожения 12 часов, температура 26°.
крытую часть бродильной трубочки без пузырьков воздуха. Содержание глюкозы в приготовленной таким образом смеси составляло 0,474%. Проводили 2 ряда опытов с двумя видами дрожжей.
Мы изучали действие §02, КСМ и СО на процесс брожения и стремились определить содержание этих веществ в воздухе. Вещества, растворенные в воде, добавляли к эмульоии дрожжей перед выливанием ее в бродильные трубочки. Инкубация всегда длилась 12 часов частично при 24—26°, частично при 37°, так как при этом удавалось наблюдать образование максимального количества газа. Таким образом, мы готовили наши трубочки для «олпгоаэробных» опытов. В «анаэробных» опытах жидкость, находящаяся в бродильных трубочках, отделялась от воздуха слоем ртути весом 60 г. В этих опытах образовавшаяся в трубке Эйнгорна СОг оставалась в система без потерь. Количество газа отсчитывали в еще не остывших трубочхах. Для определения спирта и глюкозы бродильные трубки ставили в ледник. •
502 мы получали из сульфита натрия (Ма25 03) с помощью концен-тировамной Н250.|. Образовавшийся ангидрид сернистой кислоты адсорбировали водой и затем иодометрически определяли в «ей количество сернистой кислоты. В наших опытах мы применяли по 0,2—80 гамм сернистой кислоты в 1 мл.
0,1 м растворы KCN всегда применяли свежеприготовленными и в каждой серии опытов наблюдали действие концентраций в 0,015—2 мг/'мл KCN.
СО мы готовили из муравьиной кислоты (Acid, formicum puriss.) и концентрированной H2S04. Образующуюся СО очищали концентрированным раствором NaOH и затем пропускали в течение 6 часов через бидестиллированную воду при 20°. рН устанавливали в 6,6. Теоретически мы должны были получить насыщенный раствор, содержащий 2,3 объемных процента СО. Фактическое содержание СО каждый раз контроли-
S02 р/мл
80 л
70-
so-
so-
40-
зо-
го -
10-/\Онт-
- ......I I I » 1 | I I I I | I I 1 ■ Iм .
роль и
^^^^
СОг МЛ
Рис. 2. Действие БОг. Кривая опытов сбраживания (средние величины). Период брожения 12 часов, температура 26°.
0.5-
0.25.
ОМ. 0,062. 0.03/
С0г"»
Рис. 3. Действие КСЫ. Кривая опытов сбраживания (средние величины). Период брожения 12 часов, температура 24°.
ровали по методу Веннесланда (Wennesland), чтобы уточнить дозировку. В пересчете на насыщенный раствор мы вводили в бродильные трубочки 5; 10; 15; 17; 65 мл воды, содержащей СО в указанном количестве. Дополняя эти количества до 19,5 мл, мы получали дрожжевую эмульсию с содержанием в отдельных пробирках 0,0058; 0,0116; 0,0174; 0,0205 мл СО, что соответствует 0,0066, 0,0132, 0,0198, 0,0235 мг/мл СО.
Из рис. 1 и 2 видно, что с повышением дозировки S02 почти линейно падает количество образующегося С02. В течение многих лет считалось, что сернистая кислота угнетает брожение, но следы ее по Мейоснеру (Meissner) и Зейферту (Seifert) могут стимулировать этот процесс. Уже в первых наших опытах 2 j /мл, т. е. 2 мг/л, ухудшали брожение. Мы получали при этом на 0,7 мл газа меньше, чем в контрольной пробирке, а при 80 к/мл брожение совершенно прекращалось. Угнетение брожения линейно возрастало от 2 до 60 т/мл (рис. 1). Выше и ниже этих величин кривая брожения представляла собой деформированную параболу (рис. 2).
Для анализа пропускают воздух через импинджер, содержащий 20 мл б и дести л л и ров а н но й воды, и затем исследуют эту воду описанным методом на содержание S02.
Подавляющее действие KCN на брожение удалось выявить только при концентрации выше 15 7/мл (рис. 3).
Наш метод для определения окиси углерода существенно отличается от прежних методов. Все предыдущие исследователи (Варбург, Лазер) определяли этот газ в сосудиках, в которых он находился в очень высокой концентрации (70%). Мы поглощали чистую окись углерода биде-стиллированной водой. Уже первые опыты показали, что малые количества окиси углерода не подавляли процесса брожения, но, напротив, стимулировали его. Это действие усиливалось почти прямо пропорционально концентрации окиси углерода (рис. 4 и 5).
Рис. 4. Действие СО (в аэробных условиях). Сухие дрожжи 0,1 г, глюкоза 92,5 мг, период брожения 12 часов, температура 37°.
В концентрации 23,5 /мл брожение усиливалось примерно на 67%. Это действие было еще более резким, когда инкубацию проводили не при 24—26°, а при 37°. Для того чтобы учесть и то количество газа, которое может выделиться через открытую трубку бродильной трубочки Эйнгорна, мы поставили опыты, в которых закрывали их слоем ртути. Таким образом выяснили влияние анаэробных условий. В этих пробирках Эйнгорна продукция газа при 23,5 7/мл СО увеличилась на 70%. Если желательно ориентировочно установить это действие в отношении загрязнений воздуха, то основная трудность анализа, по нашим наблюдениям, состоит в противоположном действии на брожение окиси углерода и большинства других ядов: СО стимулирует процессы брожения дрожжевых клеток, в то время как другие яды ослабляют их. Это действие СО, содержащегося в воздухе, можно легко выявить лишь при условии отсутствия в воздухе других загрязнений, что в большинстве случаев не имеет места. С помощью нашего метода мы могли определить СО в количестве 0,0066 мг/мл, т. е. 6,6 мг/л.
Так как в большинстве случаев загрязнения в воздухе имеют смешанный характер, возникает вопрос об устранении нежелательного ингредиента. При смешении эффективных количеств окиси углерода и сернистого газа мы получали чрезвычайно неправильные кривые ферментации. Совсем небольшое количество БОг (10—60 т/мл) частично
СО мг/мл 0,026 0.0235 -
0,0198'
0.0132-
о.оове-
нарушало действие 0,23 мг/мл СО, но не подавляло его совсем. Так как окись углерода адсорбируется физически, а не связана химически, ее можно удалить с помощью взбалтывания (2 часа) или продувания (1 '/г часа при избыточном давлении в 'А атмосферы). Угнетающее действие очищенного таким образом раствора БОг на дрожжевые клетки проявляется полностью.
Удаление сернистого газа из газовой смеси СО и БОг производили предварительным пропусканием исследуемого воздуха через 50% раствор №ОН. С помощью такой «очищенной» воды, содержащей лишь
окись углерода, мы снова смогли доказать стимулирующее действие СО на брожение. Поэтому при одновременном присутствии СО и Б02 берут две пробы воздуха: одну пропускают через де-стиллированную воду, другую, сначала через крепкую щелочь, а затем через воду. Часть первой пробы, примерно половину, мы обрабатываем, как описано выше.
Ввиду того что нас особенно заинтересовала способность окиси углерода стимулировать брожение, мы дополнили наши наблюдения и другими методами исследования, в частности, определением бродильной энергии дрожжей по Мейсслю. Ферментационная энергия хороших пекарских дрожжей колеблется от у 75 до 80%. Энергию брожения
мы определяли с одной и той же пробой дрожжей в присутствии 0,4%' СО и без СО. Как видно из табл. 1, энергия брожения под влиянием 0,4% СО за 6 часов при 30° увеличилась на 10,5—12%.
Для того чтобы получить еще более резкую разницу в брожении, мы ставили опыты с ферментацией на 72 часа и улавливали углекислый газ, образующийся в бродильных колбах, при 26° в эвдиометрах. В качестве примера мы приводим один из таких опытов в табл. 2. К фосфатному буферу, содержащему 12% глюкозы (рН 6), добавляли 0,67% СО и 0,1 г влажных дрожжей. Таким образом, мы получили на 46% больше С02, чем в контрольных опытах.
Для определения механизма действия окиси углерода проводили опыты с помощью микрокалсриметрического метода.
Микрокалориметрические определения. Дыхание и брожение (ферментацию) можно изучить количественно и с помощью калориметрических методов. При аэробном окислении молекулы декстрозы до С02 и воды образуется 674 м/кал тепла. При спиртовом брожении из одной молекулы декстрозы образуется, помимо двух молекул этилового спирта и двух молекул С02, еще 36—50 м/кал. тепла. Это означает, что при сгорании 1 г декстрозы образуется 3,7 м/кал тепла, а при ферментации — 0,2 м/кал. При брожении для того, чтобы покрыть свою
I | I ' | I I | I I I ' М ' I' I ' 1 1 1 I 1 1 1 1 I 1 ' ' '
КОНТ- -ч
роль ^^
СО2 мл
Рис. 5. Действие СО (в аэробных условиях). Кривая опытов сбраживания (средние величины). Период брожения 12 часов, температура 37°.
Таблица 1
В контрольных опытах 74,8 76,5 76 75,8
В присутствии 0,4%. СО 86,8 88 87,7 86,3
Разница..... 12 11,5 11,7 10,5
Таблица 2
Опыт с эвдиометром
Колбы
Показатели I II III IV
Глюкоза (в г)...... 4 4 4 4
Дрожжи (в г)...... 0,1 0,1 0,1 0,1
Вода с 2% СО (в мл) . . . 10 10 — —
Фосфатный буфер с рН 6 20 20 20 20
Дестиллированная вода (в мл)......... — — 10 10
СОг (в мг), образовавшийся:
за 24 часа .... 23 24 20 21
» 48 часов .... 38 40 33 35-
» 72 часа .... 55 53 44 45
Несброженный сахар (в процентах) ...... 37,3 37,9 48,05 48,3
потребность в энергии, дрожжи расходуют приблизительно в 26 раз больше сахара по сравнению с тем, когда они осуществляют свои жизненные функции в присутствии достаточного количества воздуха.
В своих опытах мы наблюдали брожение 1 г декстрозы с добавлением 1 г пекарских дрожжей в диференциальном калориметре 5га1ау-ЛепеуэсЬ. Брожение наблюдали без добавления СО и при добавлении 2—4—6—9—10 мл воды, содержащей 2—2,3% СО. Воду, содержащую СО, добавляли после наступления теплового равновесия. Общее количество жидкости — 25 мл. Возникший благодаря теплу термоток записывали с помощью мультиплекс-гальванометра Ланге. Фотографическую кривую зарегистрированного фототока мы переносили на миллиметровую бумагу и пересчитывали планиметрические значения, полученные на основе предварительного пробного прогрева, с помощью интегрирования на граммкалории (Э. 5га1ау, Ь. Мес^есгку, Р. Meggyesi). 1 мм' поверхности между полученной тепловой кривой с основной линией соответствует 0,00101 г/кал.
Как видно из рис. 6, окислительное брожение 1 г декстрозы началось через несколько минут после смешивания. В течение 4 часов ферментация бурно усиливалась и протекала почти с одинаковой интенсивностью в течение еще 2 часов. Таким образом, резкое теплообразование длилось в этих условиях 6 часов. Затем интенсивность теплообразования с такой же скоростью падает и, начиная с 10-го часа, теплообразование продолжается с одинаковой очень слабой интенсивностью до 19-го часа, т. е. до конца опыта. После добавления СО не наблюдалось бурного повышения, а весьма незначительное увеличение теплообразования. Кривые становились более протяженными и долго оставались на низком уровне. Период теплообразования составлял 12—20 часов. Количество образовавшегося тепла также было меньше. После добавления 9 мл воды, содержащей 1,98% СО, количество образовавшегося тепла составляло 1,89 г/кал, после добавления 10 мл воды, содержащей 2,23% СО, оно составляло 2,22 г/кал.
Если к системе добавляли меньшие количества воды, содержащей СО, то отмечалось перекрещивание кривых теплообразования при дыхании и брожении. Исходя из калориметрических опытов, можно было заключить, что в присутствии СО дыхание подавляется, а ферментация усиливается. Доказательством последнего является образование пены е форме кольца на стенке стеклянного сосуда калориметра, а также на поверхности жидкости и значительно выше этого уровня.
/ \ Обсуждение
у Повышенную продукцию
/ ——^ ^ С02 нельзя было объяснить
тем, что углекислый газ высвободился после действия кислот на бикарбонаты. Смесь не содержала бикарбонатов; даже в средах с рН 7 получались такие же результаты. Также нельзя было думать, что имело место превращение СО в СОг в соответствии с известным уравнением для водяного газа (С0 + Н20 = Н2 + С02). Эта реакция, которой пользуются для очистки городского осветительного газа от СО, происходит только при высоких температурах (400—500°). Для того чтобы этот процесс начался, необходимо также добавление тепла. Так как окисление СО все же представляет собой экзотермическую реакцию, то высвобождающегося тепла в дальнейшем достаточно для аутотермического развития процесса. Предположению о том, что это превращение может происходить и при низких температурах, например, при температуре тела (хотя бы в небольших размерах), противоречит тот факт, что (см. ниже) количество введенного в систему СО очень незначительно по отношению к количеству образовавшегося С02.
Введенные количества СО (в мл) .... 0,115 0,23 0,34 0,4
Количество продуцированного СОг (в мл) 4 4,8 5,8 6,2
Независимо от этого у нас имеются наблюдения, которые показывают, что ткани высших организмов, например, мышцы скелета и сердечная мышца, могут окислить СО в С02. После первых сообщений Фенна и Кобба (1932) Стендард и Фенн (1950) доказали это с помощью опытов с длительно существующим изотопом См. Азид натрия или гидро-ксиламин полностью ушетали окисление СО тканями. По расчету этих исследователей взрослый человек способен сжигать 20 мл СО в час. Только вследствие одного этого наблюдения возникает вопрос о существовании эндогенной или эссекциальной карбоксемии, описанной впер-
яго'з ю п ш /5 /4 !3 /г п ш 9 в ? 6 $ 4 з г ! о
часы
18 171В /5 14 13 /2 II Ю 9 в
Г в 5 4 3 2 1
часы
201918 П 18 15 14 13 12 1! Ю 9 8 7 6 5 4 3 2 I О
Часы
Рис. 6. Микрокалориметрические опыты. 1 — декстроза 1 г, дрожжи 1 г, теплообразование 2,39 г/кал; // — декстроза 1 г, дрожжи 1 г. 9 мг воды содержанием 1,98% СО, теплообразование 1,89 г/кал; /// — декстроза 1 г, дрожжи 1 г. 10 мл воды с содержанием 1.98% СО. теплообразование 8.22 г/кал (стрелки указывают момент смешивания)
вые Ннхлу (1925). После усовершенствования методов исследования все большее количество ученых подтверждает это наблюдение (Фейль, 1949; Лепер, Бастар, Эчевери, Парие, Флерио, Зейферт, 1951; Р. Барте, 1954). Даже среди некурящих встречаются лица, в крови которых находят СО в момент их пребывания в хорошем, проветренном, свободном от СО, воздухе. Лепер нашел СО у больных сердечно-сосудистыми и легочными заболеваниями с дефицитом кислорода, а также при расстрой-ства! питания или дыхания при сахарной болезни. По мнению Фейля (1949), работа мышц повышает содержание СО в крови. Рюэль наблюдал высокие цифры содержания эндогенного СО в крови. Барте предполагает, что у каждого организма имеется своя константа фиксирования СО крови. Ф. Аммундсен доказал, что определенная часть гемоглобина в крови здорового человека не воспринимает СО. По сообщению психиатров, у больных с расстройствами психики иногда находят высокое содержание СО в крови. Эчевери считает, что эндогенная .карбоксие-мия может иметь место и без серьезных нарушений здоровья. Счестранду (1949) удалось определить 0,002% СО в воздухе, выдыхаемом людьми, которые в течение 5 часов дышали через воздушный фильтр, мешающий проникновению СО из воздуха.
В «настоящее время многие исследователи занимаются вопросом эндогенного образования окиси углерода. Это явление может иметь место лишь в том случае, если кислорода -недостаточно для полного сгорания углеродистых соединений или при угнетении окислительных процессов. Если же в организме возникают минимальные количества СО, то она реагирует с ферментом (Варбург), парализует тканевое дыхание и приводит в действие ферментативный обмен. Таким образом, организм получает энергию другим путем.
В данный момент мы не занимаемся вопросом о том, с какими известными, относящимися к эффекту Пастера, теориями (Энгельгардта, Шейтца, Эль-Цина, Мейергофа и Фиала, Линнена и Конигсбергера, Лаки, Дас, Сент Джорджи, Лениннестранда и сотр.) связано это явление. Бумм и сотр. (1934) -(цит. по Лазеру) также сообщают, что аэробный гликолиз усиливается с понижением напряжения кислорода.
Разница между процессом дыхания и брожения состоит в том, что в первом случае акцептором водорода является кислород, а во втором — другое вещество (в основном альдегид). Таким образом, оба процесса прямо или косвенно являются функциями напряжения кислорода.
ЛИТЕРАТУРА
Полежаев ы. Г., Гирина В. В. и Лактионова Т. Е., Гаг. и сан., 1951, Л'» 8, стр. 15—20.—Am m u ndsen E„ J. Biol. Chem., 1941, 138, p. 563—570,-Barthc R., Arch. f. Gewerbepath. u. Gewerbehyg., 1954, Bd. 13, S. 145—153,-Bumm E., Appel H. u. Fehrenbach К., Ztschr. f. Physiol. Chem., 1934, Bd. 223, S. 207—214,—С a m p b el ! J. A. J. Path. a. Bact., 1932, v. 35, p. 379—394,— G lark R. T., Stannard J. N. a. Fenn W. O., Am. J. Physiol., 1950, v. 161, p. 40—46,-Clark R. T., Stannird J. N. a. Fenn W. O., Science, 1949, v. 109, N. 2842, p. 615—616,—Fe i 1 A., Presse med., 1949, v. 57, p. 515,—Fenn W. O. u. Cobb D. M.; Am. J. Physiol., 1932, v. 102, p. 379-392, p. 393—401,—J e n e y A., Ztschr. f. Immunitätsforsch., 1944, Bd. 105, S. 26,—L a s e r H., Biochem. J., 1937, v. 31, p. 1677—1682.—L e n n e r s t r a n d A., Biochem. Ztschr., 1936-1937, Bd. 289, S. 104—135.—L i 1 ie n t h a 1 J. L., J. Pharmacol, a. exper. Therap., 1950, v. 2, p. 324—352.—M a y e r h o f O. a. Fíala S., Biochem. et Biophys. Acta, 1950, v. 6, p. 1 —12.—Nicloux M., «L'oxyde de carbone et l'intoxication oxycarbonique», Paris, 1925.—Pleschtizer A. u. P г e о b r a j e n s z k y A. A., Arch. f. Gewerbepath. u. Gewerbehyg., 1935, Bd. 6, S. 80—86.-R u n n s t r 6 m J., Runnström A., Sperber E., Naturwissenschaften, 1937, N. 33, S. 540—540,—S eifert P., Dtsch. med. Wschr., 1951, N. 43, Jg. 76, S. 1344—1345,—S j ö r s t r a n d T., Nature, 1949, v. 164, N. 4170, p. 580—581.—Szalay A. u. Je ne y A., Ztschr. f. Immunitätsforsch., 1943, Bd. 104, S. 474—481.—Warburg О., Biochem. Ztschr., 1927, Bd. 189, S. 350—353.—T a м же, S. 354—380.
Поступила 9/IX 1955 r.
■¿r -й- -Й-
