CC BY
1
Статья поступила в редакцию 21.08.2024 г.
Мелкозерова О.А., Крутинь И.В., Храмцова А.Ю., Улитко М.В., Мустафина А.Ф.
Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества, Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина,
г. Екатеринбург, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭНДОМЕТРИЯ IN VITRO
Несмотря на многолетнюю историю существования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), эффективность проведения программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остается на уровне 30-40 %. Большое значение в процессе имплантации имеет рецептивность эндометрия, то есть его способность обеспечить необходимые этапы имплантации.
В мировой практике продолжаются поиски путей влияния на ткань эндометрия с целью улучшения морфологического и функционального состояния, что могло бы увеличить эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий. В качестве терапии продуктами клеточных технологий возможно использование внеклеточных везикул. Их применение является многообещающим подходом к стимуляции иммуномодуляции и регенерации тканей. Цель исследования - оценка влияния внеклеточных везикул на клеточную культуру эндометрия. Материалы и методы. Забор материала осуществлялся методом пайпель-биопсии эндометрия. Полученные фрагменты ткани для транспортировки помещали в фосфатно-солевой раствор с добавлением пенициллина-стрептомицина, гентамицина и амфотерицина. Для выделения первичных клеток использовали сочетание механического и химического методов. Внеклеточные везикулы выделялись из фолликулярной жидкости путем последовательного ультрацентрифугирования. Везикулы вносили в культуральную среду в концентрации 5 % и 10 %. Исследовали динамику роста, морфологические и морфометрические параметры эндометриальных клеток при культивировании в присутствии внеклеточных везикул.
Биологический материал для выделения первичной культуры клеток эндометрия и внеклеточные везикулы фолликулярной жидкости был предоставлен Уральским научно-исследовательским институтом охраны материнства и младенчества. Работа выполнена в Центре биотехнологии и биоинженерии Института естественных наук и математики Уральского федерального университета г. Екатеринбурга.
Результаты. В ходе работы была отработана методика получения клеточных культур эндометрия. Первичная клеточная культура эндометрия гетерогенна и содержит фибробластоподобные клетки стромы и железистые клетки с эпителиально-подобной морфологией. После добавления везикул динамика роста культуры эндометрия не нарушается, клетки сохраняют свою естественную морфологию: встречаются звездчатые клетки стромы, имеющие отростки, и мелкие округлые эпите-лиоподобные клетки. При добавлении везикул не выявлено критических изменений в структуре цитоплазмы клеток, она остается гомогенной. При этом дозозависимо увеличивается ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках эндометрия, что свидетельствует об изменении функционального состояния клеток в культуре. Под воздействием везикул увеличивается количество многоядерных эндометриальных клеток. В опытных группах встречались клетки, имеющие до 7 ядер. При окрашивании флуоресцентными красителями отдельно на препарате, который микроскопировали через 2 часа после нанесения 200 мкл везикул, обнаружили клетки, окруженные ареолом из маленьких сферических образований, которые являются внеклеточными везикулами.
Заключение. В ходе работы были получены данные о влиянии внеклеточных везикул на рост клеток в культуре, на размеры и количество их ядер. Было отмечено, что внеклеточные везикулы не оказывают токсического действия на культуру клеток. Под влиянием везикул увеличивается количество клеточных ядер. При введении везикул в культуру клеток увеличивается пролиферативная активность клеток, происходят морфофункциональные изменения клеточной структуры ткани эндометрия.
Ключевые слова: эндометрий; внеклеточные везикулы; фолликулярная жидкость
Melkozerova O.A., Krutin I.V., Khramtsova A.Yu., Ulitko M.V., Mustafina A.F.
Ural Research Institute for Maternal and Child Health,
Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin, Yekaterinburg, Russia A STUDY OF THE INFLUENCE OF EXTRACELLULAR VESICLES ON THE MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THE ENDOMETRIUM IN VITRO
Despite the long history of assisted reproductive technologies (ART), the effectiveness of in vitro fertilization (IVF) programs remains at the level of 30-40%. Of great importance in the implantation process is the receptivity of the endometrium, that is, its ability to ensure the necessary stages of implantation.
Информация для цитирования:
NDPDXV
Мелкозерова О.А., Крутинь И.В., Храмцова А.Ю., Улитко М.В., Мустафина А.Ф. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭНДОМЕТРИЯ IN VITRO/^ать и Дитя в Кузбассе. 2024. №4(99). С. 28-36.
In world practice, the search for ways to influence the endometrial tissue in order to improve the morphological and functional state, which could increase the effectiveness of assisted reproductive technology programs, continues. Extracellular vesicles can be used as a therapy with cell technology products. Their use is a promising approach to stimulating immunomodulation and tissue regeneration.
The purpose of the study is to assess the effect of extracellular vesicles on endometrial cell culture.
Materials and methods. The material was collected by endometrial pipelle biopsy. The resulting tissue fragments were placed in a phosphate-saline solution with the addition of penicillin-streptomycin, gentamicin and amphotericin for transportation. A combination of mechanical and chemical methods was used to isolate primary cells. Extracellular vesicles were isolated from follicular fluid by sequential ultracentrifugation. Vesicles were added to the culture medium at a concentration of 5 % and 10 %. The growth dynamics, morphological and morphometric parameters of endometrial cells were studied during cultivation in the presence of extracellular vesicles.
Biological material for isolating the primary endometrial cell culture and extracellular vesicles of follicular fluid was provided by the Ural Research Institute for Maternal and Child Health. The work was carried out at the Center for Biotechnology and Bioengineering of the Institute of Natural Sciences and Mathematics of the Ural Federal University in Yekaterin-
Results. In the course of the work, a technique for obtaining endometrial cell cultures was developed. The primary endometrial cell culture is heterogeneous and contains fibroblast-like stromal cells and glandular cells with epithelial-like morphology. After adding vesicles, the growth dynamics of the endometrial culture is not disturbed, the cells retain their natural morphology: stellate stromal cells with processes and small round epithelial-like cells are found. When adding vesicles, no critical changes in the structure of the cell cytoplasm were detected, it remains homogeneous. At the same time, the nuclear-cytoplasmic ratio in the endometrial cells increases dose-dependently, which indicates a change in the functional state of the cells in the culture. Under the influence of vesicles, the number of multinucleated endometrial cells increases. In the experimental groups, there were cells with up to 7 nuclei.
When staining with fluorescent dyes separately on the preparation, which was microscopically examined 2 hours after applying 200 |_il of vesicles, cells surrounded by an areola of small spherical formations were found, which are extracellular vesicles.
Conclusion. In the course of the work, data were obtained on the effect of extracellular vesicles on cell growth in culture, on the size and number of their nuclei. It was noted that extracellular vesicles do not have a toxic effect on cell culture. Under the influence of vesicles, the number of cell nuclei increases. When vesicles are introduced into cell culture, the proliferative activity of cells increases, and morphofunctional changes in the cellular structure of endometrial tissue occur. Key words: endometrium; extracellular vesicles; follicular fluid
Значительные успехи репродуктивной медицины,
достигнутые в последние десятилетия, не снизили актуальность проблемы бесплодия. Частота бесплодных браков в различных регионах России варьирует от 17,2 % до 24 %, при этом Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет критическое значение для демографической ситуации в стране в 15 %. Несмотря на многолетнюю историю существования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), эффективность проведения программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остается на уровне 30-40 % [1].
Главной проблемой при переносе эмбриона хорошего качества в полость матки остается отсутствие имплантации. При этом для достижения успешной беременности важны оба фактора: и качество эмбриона, и морфофункциональное состояние эндометрия [2]. Эндометрий должен быть способен воспринять и имплантировать эмбрион, то есть быть рецептивным. Толщина эндометрия отражает выраженность пролиферации клеток в слизистой оболочке тела матки. Большое значение в процессе имплантации имеет рецептивность эндометрия, то есть его способность обеспечить необходимые этапы имплантации: ориентацию бластоцисты в полости матки относительно места будущей имплантации, адгезию на поверхности эндометрия и инвазию в полость матки [3].
В мировой практике продолжаются поиски путей влияния на ткань эндометрия с целью улучшения морфологического и функционального состояния, что могло бы увеличить эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий. В
качестве терапии продуктами клеточных технологий возможно использование внеклеточных везикул. Их применение является многообещающим подходом к стимуляции иммуномодуляции и регенерации тканей.
Внеклеточные везикулы — мембранные структуры различного размера, отделяющиеся от плазматической мембраны клеток. Они содержат цитозоль-ные компоненты, такие как ферменты, факторы транскрипции, молекулы мРНК [4].
Впервые микрочастицы, циркулирующие в крови человека, описал и установил их тромбоцитарное происхождение в 1967 г. Wolf P. [5]. В настоящее время известно, что микрочастицы образуют многие типы клеток, в том числе лейкоциты, эритроциты, лейомиоциты, эндотелиальные, стволовые и опухолевые клетки [6]. Установлено, что внеклеточные везикулы присутствуют и в различных биологических жидкостях человека [7].
Различают три вида везикул, которые отличаются по размерам и происхождению: экзосомы, апоп-тозные тельца и микровезикулы. Экзосома — это внеклеточная мембранная частица размерами от 30 до 100 нм, имеющая эндоцитозное происхождение. Эти образования переносят белки, РНК и ДНК как к близлежащим клеткам, так и в другие органы и ткани посредством транспорта биологическими жидкостями [8]. Самыми крупными везикулами являются апоптозные тельца — диаметр частиц колеблется от 1 до 5 мкм, в своем в составе имеют фосфатидилсерин. Такие частицы образуются в ходе запрограммированной клеточной гибели для «упаковки» содержимого клетки и часто вклю-
№4 (99) 2024
чают элементы ядерного материала и органеллы
[9].
Микровезикулы отщепляются от плазматической мембраны практически всех клеток, поэтому состав по липидам и мембранным белкам качественно очень близок к составу плазматической мембраны порождающей клетки. Они имеют размеры 100-1000 нм в диаметре, переносят тканевые факторы и клеточно-специфичные маркеры [8]. Везикулы образуются на липидных рафтах при нарушении мембранной асимметрии. Во внешнем слое мембраны клеток располагается фосфатидилхолин и сфин-гомиелин, а на внутренней стороне — фосфатидил-серин и фосфатидилэтаноламин. Нарушение описанной мембранной асимметрии характеризуется перемещением фосфотидилсерина на внешнюю мембрану клетки. Такое явление может представлять собой маркер клеточного стресса или активации, а также реорганизации цитоскелета [10].
Внеклеточные везикулы являются инструментом межклеточной коммуникации в организме человека. Везикулы передают клеткам-реципиентам заключенные внутри них молекулы, которые получают от клеток-доноров. Существуют две гипотезы, объясняющие механизм доставки молекул: 1) непосредственное слияние мембраны везикул и цитоплазма-тической мембраны клетки; 2) эндоцитоз.
Достаточно долго считалось, что везикулы являются лишь второстепенными продуктами жизнедеятельности клеток и не имеют функциональной активности. Функция везикул определяется их составом, который зависит от типа клетки-донора, и стимула, вызвавшего их образование [15]. На данный момент описана их немаловажная роль в многочисленных процессах организма и возможность применения в качестве инструментов для диагностики многих заболеваний, например тромбических рисков, онкологических нарушений и иммунных реакций [4]. Также везикулы могут применяться в терапии при онкологических и аутоиммунных заболеваниях [11, 12].
На данный момент известно широкое разнообразие функций, выполняемых микровезикулами. Описано их участие в ангиогенезе и в свертывании крови [11, 13]. Фосфатидилсерин в составе везикул связывает белки свертывания, тем самым ускоряются мембранные реакции. Микровезикулы обладают адгезионной и сигнальной активностью благодаря содержащимся в них мембранным белкам. Наконец, важнейшее свойство везикул — это регуляция экспрессии генов в клетках-мишенях при слиянии с мембраной и выделении своего содержимого в цитоплазму [8].
Взаимодействие внеклеточных везикул с клетками и процесс их слияния изучены недостаточно. Затруднения в изучении возникают из-за того, что внеклеточные везикулы находятся на грани чувствительности современных методов и нельзя с точностью определить их количественные показатели в различных жидкостях организма. Для визуализации везикул часто используются различные
красители, при этом окрашиваются клетки, из которых выделяются везикулы.
Фолликулярная жидкость яичников представляет собой многокомпонентную среду, которая служит в качестве микроокружения развивающихся ооци-тов и содержит факторы, секретируемые окружающими клетками, и соединения плазмы крови, преодолевающие «гематофолликулярный барьер».
Фолликулярная жидкость сначала накапливается в расширенных межклеточных промежутках, а в дальнейшем образует мелкие полости внутри фолликулярной оболочки, сливающиеся в единую полость. Она формируется из компонентов плазмы и растворимых факторов, секретируемых гранулезными клетками, необходимыми для поддержания и регуляции фолликулогенеза [14]. Известно, что в фолликулярной жидкости также содержатся внеклеточные везикулы. Считается, что они принимают участие в фолликулогенезе, мейозе ооцитов, стеро-идогенезе и профилактике полиспермии после оплодотворения. Везикулы фолликулярной жидкости обладают выраженными прокоагулятивными свойствами. Также показано, что микровезикулы, высвобождаемые эмбриональными клетками, влияют на формирование трофобласта во время имплантации и наступления беременности [13].
Для выделения внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости традиционно используют метод дифференциального центрифугирования. При этом образец последовательно центрифугируется, отделяется супернатант, который далее подвергается ультрацентрифугированию [12].
Целью исследования являлась оценка влияния внеклеточных везикул на клеточную культуру эндометрия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Забор материала осуществлялся методом пай-пель-биопсии эндометрия. Полученные фрагменты ткани для транспортировки помещали в фосфат-но-солевой раствор с добавлением пенициллина-стрептомицина, гентамицина и амфотерицина. Получение первичной культуры эндометрия осуществлялось при строгом соблюдении всех правил стерильности для того, чтобы исключить возможность контаминации.
Для выделения первичных клеток использовали сочетание механического и химического методов. Ткань предварительно 3 раза промывалась фосфат-но-солевым раствором с добавлением антибиотиков и антимикотиков. Далее образцы измельчали стерильными ножницами до фрагментов 1 мм, переносили во флакон с теплым трипсином и инкубировали при температуре 37°С 40 минут, помешивая каждые 10 минут. После дезагрегации к раствору трипсина для нейтрализации добавляли эквивалентный объем полной питательной среды и осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 об/мин. Супернатант удаляли, полученный осадок ресуспен-дировали, переносили во флаконы и культивирова-
№4 (99) 2024
ли в атмосфере 5 % при 37°C в питательной среде Игла DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % пенициллин-стрептомицина. Первую смену среды осуществляли на следующий день для удаления непри-крепившихся клеток. Далее смену среды проводили раз в 3-4 дня, в зависимости от скорости роста клеток. После образования монослоя проводили субкультивирование эндометриальных клеток. Для этого монослой клеток обрабатывали раствором трипсина и рассаживали в новые культуральные флаконы в соотношении 1:2-1:3.
Внеклеточные везикулы выделяли из фолликулярной жидкости путем последовательного ультрацентрифугирования. В культуральную среду везикулы добавляли в концентрации 5 % и 10 %.
Для оценки динамики роста клетки высевали в 24-луночный планшет по 500 мкл клеточной суспензии в лунку. Посевная доза составила 1,2 х клеток в 1 мл культуральной среды. Подсчет количества клеток осуществляли на 1, 3, 5 и 8 сутки культивирования с помощью камеры Горяева после окрашивания витальным красителем трипановым синим.
Для изучения морфологии клеток и морфометри-ческого анализа клетки культивировали на стеклах и окрашивали растворами Романовского-Гимзы и Май-Грюнвальда на 1, 3, 5 сутки культивирования. Морфометрический анализ клеток проводили с помощью программы ToupCam View. Определяли площадь ядра, площадь цитоплазмы и ядерно-цито-плазматическое отношение.
Для фиксации процесса проникновения везикул в клетки и оценки морфофункционального состояния клеток после добавления везикул использовалось флуоресцентное окрашивание эндометриаль-ных клеток красителем Hoechst 33342 и суспензии с везикулами акридиновым оранжевым.
Статистическая обработка проводилась в программах «Excel 2010. Microsoft Office», SPSS Statistics версия 22.0 (IBM Microsoft). Вычислялось
среднее арифметическое значение в группах, ошибка среднего. Оценку статистической значимости осуществляли с использованием критерия Манна— Уитни и критерия хи-квадрат (х2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Описание полученной клеточной культуры эндометрия
В ходе работы была отработана методика получения первичных клеточных культур эндометрия. Первичная клеточная культура эндометрия гетеро-генна и содержит фибробластоподобные клетки стромы и железистые клетки с эпителиальноподоб-ной морфологией (рис. 1).
В первые сутки после пассажа клетки активно мигрируют из недиссоциированных фрагментов ткани, образуя группы отросчатых клеток, среди них встречается и эпителиоподобная морфология. Далее в культуре увеличивается количество колоний фи-бробластоподобных клеток, при этом количество округлых эпителиоподобных клеток сокращается. В первые дни культивирования клеточный состав ге-терогенен, но с течением времени степень гетерогенности снижается, и в культуре начинают преобладать фибробластоподобные клетки. На 3 сутки заметно увеличивается количество более удлинённых клеток. При достижении монослоя культура в основном состоит из удлинённых клеток с фиброб-ластоподобной морфологией.
На начальных пассажах культура еще остается гетерогенной, но по мере увеличения числа пассажей степень гетерогенности снижается и в культуре начинают преобладать фибробластоподобные клетки.
После добавления везикул клетки в культуре сохраняют свою естественную морфологию. Встречаются звездчатые клетки стромы, имеющие отростки, и мелкие округлые эпителиоподобные клетки (рис. 2).
Рисунок 1
Первичная культура эндометриальных клеток. А - железистые; B - фибробластоподобные клетки. Окраска
по Май-Грюндвальду. (масштабная линейка 100 мкм)
Figure 1
Primary culture of endometrial cells. A - glandular; B - fibroblast-like cells. May-Grundwald coloring (scale bar 100 pm)
При добавлении везикул не выявлено критических изменений в структуре цитоплазмы клеток, она остается гомогенной (рис. 2)
При окрашивании флуоресцентными красителями через 2 часа после нанесения везикул в концентрации 10 % обнаруживаются клетки, окруженные короной из сферических образований (рис. 3).
Влияние внеклеточных везикул на динамику роста клеток Окрашивание эндометриальных клеток флуоресцентным ядерным красителем Hoechst через 2 и
24 часа после нанесения везикул свидетельствует о том, что добавление везикул не оказывает негативного влияния на клеточную культуру эндометрия. В контрольной и в опытных группах клетки имеют ядра ровной овальной формы, светящиеся голубым светом (рис. 4).
На первые сутки во всех группах наблюдается снижение количества клеток, связанное с реакцией клеток на воздействие ферментом и пересев. В группах с добавлением везикул снижение клеточности выражено в меньшей степени, чем в контрольной
Рисунок 2
Общий вид культуры эндометрия на 1 сутки после добавления везикул. А - контрольная группа, B - опытная группа с добавлением везикул в концентрации 5% . Окраска по Май-Грюндвальду (масштабная линейка 100 мкм, краситель Май-Грюндвальд) Figure 2
General view of the endometrial culture 1 day after adding vesicles. A - control group, B - experimental group with the addition of vesicles at a concentration of 5%. May-Grundwald Coloring (scale bar 100 pm, May-Grundwald dye)
Рисунок 3
Эндометриальные клетки, окруженные сферическими образованиями, через 2 часа после нанесения везикул
в концентрации 10%, ув.500 Figure 3
Endometrial cells surrounded by spherical formations, 2 hours after application of vesicles at a concentration of 10%,
magnification 500
Рисунок 4
Эндометриальные клетки, окрашенные раствором Hoechst 33342. А - контрольная группа; B - клеточная культура
через 24 ч после добавления везикул, ув. 500
Figure 4
Endometrial cells stained with Hoechst 33342 solution. A - control group; B - cell culture 24 hours after addition
of vesicles, magnification 500
группе (табл. 1). Можно предположить, что везикулы повышают адаптивные способности клеток. На 3 сутки количество клеток в опытных группах уменьшается и остается примерно на одном уровне. При этом в контрольной группе количество клеток увеличивается и достигает максимума на 5 сутки.
Таблица 1
Среднее количество клеток в 1 мл (х104)
Table 1
Average number of cells in 1 ml (x104)
Группа Посевная 1-е 3-и 5-е 8-е
доза сутки сутки сутки сутки
Контроль 0, 611 0,972 1,014 0,972
5% 1,200 1,097 0,541 0,513 0,458
10% 1,042 0,389 0,458 0,486
Влияние внеклеточных везикул на морфофункциональное состояние клеток
Функциональное состояние оценивали по ядер-но-цитоплазматическому отношению. Во всех группах ядерно-цитоплазматическое отношение увеличивается в 1 сутки после добавления везикул, при этом наибольший эффект наблюдается при добавлении микровезикул в концентрации 10 % (табл. 2). Возможно, это связано с тем, что чем больше концентрация везикул, тем выше вероятность их встречи с клетками.
При исследовании морфологической структуры эндометрия были обнаружены дву- и многоядерные клетки. Максимальное количество ядер, которое удалось обнаружить в контрольной группе, было равно четырем (рис. 5 А). В опытных группах встречались клетки, имеющие до 7 ядер (рис. 5 Б).
Таблица 2
Изменения ядерно-цитоплазматического отношения в контрольной группе и при нанесении микровезикул
Table 2
Changes in the nuclear-cytoplasmic ratio in the control group and after application of microvesicles
Контроль 100 мкл 200 мкл
1-е сутки 0,0719 ± 0,004 0,0731 ± 0,0029 0,0818 ± 0,0038
3-и сутки 0,0674 ± 0,0036 0,0651 ± 0,0042 0,0698 ± 0,0041
5-е сутки 0,0654 ± 0,0031 0,0667 ± 0,0035 0,0591 ± 0,0032
U-Манна- U1-3 = 725 U1-3 = 604 U1-3 = 569
Уитни U3-5 = 816 U3-5 = 712 U3-5 = 456
P (значи- Р1-3 = 0,47 Р1-3 = 0,059 Р1-3 = 0,026
мость) Р3-5 = 0,61 Р3-5 = 0,51 Р3-5 = 0,062
В контрольной и опытных группах для оценки частоты встречаемости клеток с несколькими ядрами подсчитали количество дву- и многоядерных клеток (табл. 3).
Выявлено, что клеток с несколькими ядрами меньше, чем в опытных группах. Максимальное количество двуядерных клеток пришлось на 5-е сутки в группе с добавлением везикул в концентрации 10 % (рис. 6).
Наибольшее количество многоядерных было обнаружено в группе с добавлением 5 % везикул на 3-и сутки (рис. 7).
Увеличение количества ядер может происходить перед делением клеток, либо вследствие слияния нескольких клеток или отсутствия цитокинеза после деления ядра. Можно предположить, что под влиянием везикул в клетках происходят активные процессы деления, так как увеличение количества
№4 (99) 2024
Рисунок 5
Многоядерные эндометриальные клетки на 3 сутки культивирования с различной концентрацией наносимых везикул в опытных группах. А -контроль; B - концентрация везикул 5%; мкл; C - концентрация везикул 10%,
ув.100 Figure 5
Multinucleated endometrial cells on the 3rd day of cultivation with different concentrations of applied vesicles in the experimental groups. A - control; B - vesicle concentration 5%; pl; C - vesicle concentration 10%, magnification 100
Ш
* *
•f f* ♦ »
- 0
0 ! J
V v
m
**
H
I \
4
> '*
r
V * • '
1 * t
■ , *
Таблица 3
Количество дву- и многоядерных клеток, %
Table 3
Number of bi- and multinucleated cells, %
Группа 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки
Двуядерные Многоядерные Двуядерные Многоядерные Двуядерные Многоядерные
Контроль 7 1 5 0 6 0
5% 6 3 9 5 9 2
10% 11 4 7 3 14 2
х2к-1 = 0,192 х2к-1 = 0,932 х2к-1 = 0,105
Значение х2 х2к-2 = 0,064 х2к-2 = 0,469 х2к-2 = 0,006
Х21-2 = 0,013 Х21-2 = 0,021 Х21-2 = 0,023
Рк-1 = 0,662 Рк-1 = 0,335 Рк-1 = 0,746
Р (значимость) Рк-2 = 0,8 Рк-2 = 0,494 Рк-2 = 0,942
Р1-2 = 0,908 Р1-2 = 0,884 Р1-2 = 0,887
Рисунок 6
Изменение количества двуядерных клеток в разные сроки культивирования Figure 6
Change in the number of binucleate cells at different cultivation times
Рисунок 7
Изменение количества многоядерных клеток в разные сроки культивирования
Figure 7
Changes in the number of multinucleated cells at different cultivation times
ядер коррелирует с повышением клеточности культуры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе исследования были получены данные о влиянии внеклеточных везикул на динамику роста клеток в культуре, на размеры и количество их ядер. Было отмечено, что внеклеточные везикулы не оказывают токсического действия на культуру клеток. В первые сутки после введения везикул в культуру клеток увеличивается пролиферативная активность клеток эндометрия, а также дозозависи-мо увеличивается ядерно-цитоплазматическое отно-
шение, что может свидетельствовать об изменении уровня метаболизма и проявлении компенсаторных реакций в клетках эндометрия. При введении везикул в культуру клеток эндометрия увеличивается количество многоядерных клеток, что может быть связано с активными процессами деления или слиянием нескольких клеток.
Информация о финансировании и конфликте интересов
Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:
1. Khramtsova AYu, Bashmakova NV. Global view on the problem of «thin» endometrium: solutions to the problem in assisted reproductive technology (literature review). Russian Journal of Human Reproduction. 2019; 25(4): 69-76. Russian (Храмцова А.Ю., Башмакова Н.В. Современный взгляд на проблему «тонкого» эндометрия: пути решения в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) //Проблемы репродукции. 2019. Т. 25, № 4. С. 69-76.) doi: 10.17116/repro20192504169
2. Leshchenko OYa. Chronic endometritis and reproductive disorders: versions and contraversions (review). Bulletin of Siberian Medicine. 2020; 19(3): 166-176. Russian (Лещенко О.Я. Хронический эндометрит и репродуктивные нарушения: версии и контраверсии //Бюллетень сибирской медицины. 2020. Т. 19, № 3. С. 166-176.) doi: 10.20538/16820363-2020-3-166-176
3. Boiarskii KIu, Gaidukov SN, Pal'chenko NA. Modern look on endometrial receptivity and thin endometrium in art cycles (a review). Russian Journal of Human Reproduction. 2013; (4): 51-60. Russian (Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., Пальченко Н.А. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ (обзор литературы) //Проблемы репродукции. 2013. № 4. С. 51-60.)
4. Gomzikova MO, Gaifullina RF, Mustafin IG, Chernov VM, Miftahova ZR, Galyavich AS, Rizvanov AA. Membrane microvesi-cles: biological properties and involvement in pathogenesis of diseases. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. 2013; 8(1): 6-11. Russian (Гомзикова М.О., Гайфуллина Р.Ф., Мустафин И.Г., Чернов В.М., Мифтахова З.Р., Галявич А.С., Ризванов А.А. Мембранные микровезикулы: биологические свойства и участие в патогенезе заболеваний //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2013. Т. 8, № 1. С. 6-11.) doi: 10.23868/gc121588
5. Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 1967; 13(3): 269-288. doi: 10.1111/j.1365-2141.1967.tb08741.x
6. Puddu P, Puddu GM, Cravero E, Muscari S, Muscari A. The involvement of circulating microparticles in inflammation, coagulation and cardiovascular diseases. Can J Cardiol. 2010; 26(4): 140-145. doi: 10.1016/s0828-282x(10)70371-8
^^ТЬИ®™6''"' №4 (99) 2024 E9
7. Muralidharan-Chari V, Clancy JW, Sedgwick A, D'Souza-Schorey C. Microvesicles: mediators of extracellular communication during cancer progression. J Cell Science. 2010; 123(10): 1603-1611. doi: 10.1242/jcs.064386
8. Panteleev MA, Abaeva AA, Nechipurenko DYu, Obydenniy SI, Sveshnikova AN, Shibeko AM. Physiology and pathology of extracellular vesicules. Oncohematology. 2017; 12(1): 62-70. Russian (Пантелеев М.А., Абаева А.А., Нечипуренко Д.Ю., и др. Физиология и патология внеклеточных везикул //Онкогематология. 2017. 12(1): 62-69.) doi: 10.17650/1818-8346-2017-12-1-62-70
9. Andreeva EA. Immunoactive factors of follicular fluid in women in the in vitro fertilization program: Abstr. dis. ... cand. biol. sci. Novosibirsk, 2021. 24 p. Russian (Андреева Е.А. Иммуноактивные факторы фолликулярной жидкости у женщин в программе экстракорпорального оплодотворения: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Новосибирск, 2021. 26 с.)
10. Tamkovich SN, Tutanov OS, Laktionov PP. Exosomes: generation, structure, transport, biological activity, and diagnostic application. Biologiceskie membrany. 2016; 33(3): 163-175. Russian (Тамкович С.Н., Тутанов О.С., Лактионов П.П. Экзосомы: механизмы возникновения, состав, транспорт, биологическая активность, использование в диагностике //Биологические мембраны. 2016. Т. 33, № 3. - С. 163-175.) doi: 10.7868/S0233475516020122
11. Kraevaya EE, Silachev DN, Beznoshchenko OS, Goryunov KV, Shevtsova JuA, Khutornenko AA, et al. Effect of extracellular vesicles of follicular fluid on ovarian coagulation hemostasis. Russian Journal of Human Reproduction. 2020; 26(2): 18-26. Russian (Краевая Е.Е., Силачев Д.Н., Безнощенко О.С., Горюнов К.В., Шевцова Ю.А., Хуторненко А.А., и др. Влияние внеклеточных везикул фолликулярной жидкости на коагуляционный гемостаз яичника //Проблемы репродукции. 2020. Т. 26, № 2. С. 18-26.) doi: 10.17116/repro20202602118
12. Andreeva EA, Khonina NA, Pasman NM. Microvesicles in follicular fluid with women in IVF program. Russian Journal of Immunology. 2019; 13(2): 139-140. Russian (Андреева Е.А. Хонина Н.А., Пасман Н.М. Микровезикулы фолликулярной жидкости у женщин в цикле ЭКО //Российский иммунологический журнал. 2019. Т. 13, № 2. С. 139-140.) doi: 10.31857/S102872210006428-5
13. Nasiri S. Infusible platelet membrane as a platelet substitute for transfusion: an overview. Blood Transfus. 2013; 11(3): 337-342. doi: 10.2450/2013.0209-12
14. By'kov VL. Chastnaya gistologiya cheloveka (kratkij obzorny'j kurs). SPb.: SOTIS, 1997. 298 s. Russian (Быков В.Л. Частная гистология человека (краткий обзорный курс). СПб.: СОТИС, 1997. 298 с.)
КОРРЕСПОНДЕНЦИЮ АДРЕСОВАТЬ:
ХРАМЦОВА Александра Юрьевна 620028, г Екатеринбург, ул. Репина, д. 1, ФГБУ НИИ ОММ Минздрава России Тел: 8 (343) 371-87-68 Е-таИ: [email protected]
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
МЕЛКОЗЕРОВА Оксана Александровна, доктор мед. наук, доцент, зам. директора по научной работе, ФГБУ НИИ ОММ Минздрава России, г Екатеринбург, Россия.
КРУТИНЬ Ирина Викторовна, очный аспирант, ФГБУ НИИ ОММ Минздрава России, г. Екатеринбург, Россия. E-mail: [email protected]
ХРАМЦОВА Александра Юрьевна, канд. мед. наук, научный сотрудник отделения вспомогательных репродуктивных технологий, ФГБУ НИИ ОММ Минздрава России, г. Екатеринбург, Россия. Е-mail: [email protected]
УЛИТКО Мария Валерьевна, канд. биол. наук, доцент, директор департамента биологии и фундаментальной медицины института естественных наук, ФГАОУ ВО УрФУ, г. Екатеринбург, Россия. Е-mail: [email protected]
МУСТАФИНА Алсу Фармутовна, магистрант направления Биомедицина и доклинические исследования лекарственных средств, ФГАОУ ВО УрФУ, г. Екатеринбург, Россия. Е-mail: [email protected]
ВЕЙСЕНБОРН Елена Романовна, аспирант кафедры акушерства и гинекологии, ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск, Россия. E-mail: [email protected]
ИЩЕНКО Юлия Сергеевна, студент 5 курса, педиатрический факультет, ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск, Россия.
INFORMATION ABOUT AUTHORS
MELKOZEROVA Oksana Aleksandrovna, doctor of medical sciences,
docent, deputy director for research, Ural Research Institute of
Obstetrics and Maternity Care, Ekaterinburg, Russia.
KRUTIN Irina Viktorovna, postgraduate student, Research Institute of
Obstetrics and Maternity Care, Ekaterinburg, Russia.
E-mail: [email protected]
KHRAMTSOVA Alexandra Yuryevna, candidate of medical sciences, researcher, department of assisted reproductive technologies, Research Institute of Obstetrics and Maternity Care, Ekaterinburg, Russia. E-mail: [email protected]
ULITKO Maria Valeryevna, candidate of medical sciences, docent, director of the department of biology and fundamental medicine of the Institute of natural sciences, Ural Federal University, Ekaterinburg, Russia. E-mail: [email protected]
MUSTAFINA Alsu Farmutovna, Master's student in the direction of bio-medicine and preclinical studies of drugs, Ural Federal University, Ekaterinburg, Russia. E-mail: [email protected]
VEISENBORN Elena Romanovna, post-graduate student of the department of obstetrics and gynecology, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia. E-mail: [email protected] ISHCHENKO Yulia Sergeevna, 5th year student, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia.
