CC BY
79
УДК 616.5-003.93-092.9
о.с. роговая, Е.в. Киселева, Э.Б. дашинимаев, в.с. Щипицына, F.F. Файзуллин,
А.Б. Васильев, Ю.В. Суханов, В.В. Терских
исследование влияния перфторуглерода (пфу) в составе живого эквивалента кожи (жэк) на процесс регенерации кожных ран в модели лабораторных животных
Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва)
В работе было исследовано влияние эмульсии ПФУ (перфторана) на физиологическую активность ЖЭК. Было показано, что присутствие 10% ПФУ в составе питательной среды, не влияет, на скорость пролиферации, клеток. На модели, контракции коллагенового геля, было показано, что ПФУ ускоряет, процесс контракции, геля, с клетками. В модели, кожной раны, на лабораторных животных показан стимулирующий эффект. ЖЭК, содержащий 10% ПФУ, на процессы, регенерации в сравнении с контролями.
Ключевые слова: перфторуглерод, регенерация, живой эквивалент кожи
investigation OF THE PERFLUOROCARBON (PFC) influence in the living skin equivalent (LSE) on the regeneration of skin wounds IN LABORATORY ANIMAL MODELS
O.S. Rogovaya, E.V. Kiseleva, E.B. Dashinimaev, V.S. Schipitsina, A.G. Chukanova,
R.R. Faizullin, A.V. Vasilyev, V.V. Terskikh
Koltzov Institute of Developmental Biology of RAS, Moscow
We investigated, the effect of PFCs on the physiological activity of LSE. It was shown that 10% PFC in the culture medium, did. not affect the rate of cell proliferation. On the model by the contracting collagen gel has been shown that the inclusion of PFCs in the LSE accelerates the contraction of gel with the cells. Using experimental model of skin wounds it was shown the stimulating effect LSE with. PFCs on skin regeneration, in comparison, with, controls.
Key words: perfluorocarbon, regeneration, living skin equivalent
Исследование было выполнено в рамках проекта Роснауки по договору № 13.G25.31.0080 от 22.10.10 «Создание высокотехнологичного производства продуктов клеточных технологий для регенеративной медицины» (шифр 2010-218-02-172).
Современная тканевая инженерия основана на использовании трехмерных тканевых эквивалентов, образованных из выращенных клеток и биоматрикса. Для восстановления эпителиальных тканей используют ЖЭК на основе трехмерного коллагенового носителя и функционально активных клеток мезенхимного компартмента и кератиноцитов кожи [11, 14]. ЖЭК может быть двух типов: 1 — клетки которого встраиваются в пораженные ткани; 2 — приживляющийся в месте трансплантации на короткое время, достаточное для нормализации течения репаративного процесса и стимулирования регенерации тканей реципиента [3, 8]. Подобные клеточные конструкции применяются для восстановления различных эпителио-мезенхимных дефектов. Одной из проблем, связанных с применением тканеинженерных конструкций в клинике, является ишемизированность тканей в месте поражения из-за недостаточного кровоснабжения, что затрудняет процесс регенерации. Для решения этой проблемы предлагается введение ПФУ в состав конструкции ЖЭК в качестве активного переносчика кислорода. ПФУ — слабо полярные соединения, в которых растворимость газов увеличивается по
мере уменьшения полярности. Они химически и метаболически инертны, не имеют токсической активности. При использовании эмульсий ПФУ (перфторана) для лечения гнойно-деструктивного панкреатита, поверхностных ожогов, обморожений и гнойных ран установлен положительный клинический эффект, объясненный их оксигенирующим и мембраностабилизирующим действием, улучшением кислотно-основного и газового составов раневой поверхности [1, 2, 5, 6]. Показано влияние ПФУ на поведение клеток в культуре, в частности, на способность МСК дифференцироваться остеогенном направлении [12, 13].
Цель работы — исследовать ранозаживляющее действие ЖЭК, содержащего ПФУ. Методика исследования
Культуры клеток. Кератиноциты и МСК жировой ткани (МСКЖТ) выделяли и культивировали из новорожденных крысят по стандартным протоколам [8, 10, 11, 14].
Приготовление ЖЭК на основе губки «Колла-хит». В качестве подложки выбрали коллагеновую губку «Коллахит». Губки размером 1,5 х 1,5 см гидратировали в среде DMEM. Затем на поверхность губок высевали МСКЖТ в концентрации 1,5 х 105 клеток на губку. Через сутки на свободную поверхность губок высевали 3 х 105 кератиноцитов. Для приготовления образцов ЖЭК с ПФУ после прикрепления кератиноцитов образцы переводили
на питательную среду с 10% ПФУ. Губки культивировали в среде для кератиноцитов в течение 7 суток. За сутки до трансплантации все образцы ЖЭК переводили на среду без сыворотки.
Модель стимуляции регенерации кожной раны у крыс с помощью ЖЭК. В работе использовали самцов крыс популяции Вистар, весом 200 — 220 г. Все манипуляции с лабораторными животными делали в условиях операционной. Крыс наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата (0,6 г/кг). На спине операционное поле обрабатывали раствором 3% йода, наносили полнослойную кожную рану 0 2,5 см. Для предотвращения стягивания краев раны изнутри раны подшивали стерильное кольцо из поливинхлорида 0 2,5 см с крышкой. Животные содержались в условиях вивария в отдельных клетках при постоянном доступе к воде и корму. Через 3 суток раны обрабатывали раствором трипсина и гентамицина (0,4 мг/мл) и проводили трансплантацию ЖЭК. На рану накладывали защитную повязку. Через 10 суток животных выводили из эксперимента передозировкой наркоза, вырезали раны вместе с подлежащими тканями, фиксировали в течение 3 суток в растворе нейтрального 10% формалина и делали гистологические срезы по стандартной методике. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования влияния ПФУ на пролиферацию МСКЖТ культивировали в течение 3 суток в среде, содержащей 10% ПФУ. Иммуноцитохими-ческим методом выявляли количество пролиферирующих клеток по экспрессии маркера Кі-67. В эксперименте процент клеток, экспрессирующих Кі-67, составил 64,6 ± 5,5 %, в контроле (без ПФУ) — 61,8 ± 5,3 %. Также было показано, что ПФУ в данной концентрации не влияет на период удво-
ения клеток в культуре (рис. 1) Таким образом, введение 10% ПФУ в состав питательной среды не влияет на пролиферацию МСКЖТ.
Для исследования влияния ПФУ на контракцию был поставлен тест по описанной методике [4, 7]. Исследовали контракцию следующих вариантов: коллагеновый гель без добавок (гель), коллагеновый гель с МСКЖТ (гель + МСКЖТ), коллагеновый гель с 10% ПФУ (гель + ПФУ), коллагеновый гель с МСКЖТ и 10% ПФУ (гель + МСКЖТ + ПФУ). ПФУ незначительно влиял на контракцию геля без клеток, но почти в 2 раза ускорял контракцию геля, содержащего МСКЖТ (рис. 2в). Таким образом, ПФУ вызывает ускорение контракции коллагенового геля с клетками, что является доказательством влияния ПФУ на физиологическую активность МСКЖТ в геле.
На следующем этапе исследовали влияние ЖЭК с ПФУ на регенерацию кожных ран у лабораторных животных. Микроскопическое исследование образцов ЖЭК до трансплантации показало, что клетки распределены по всему объему губки и прикреплены к ее волокнам. ПФУ в среде культивирования изменял микроструктуру губки: волокна становились тоньше и разрозненны (рис. 2а, б). Животных разделили на 5 групп (по 6 в группе): 1 — контроль (открытая рана); 2 — рана закрыта губкой «Коллахит»; 3 — рана закрыта губкой «Коллахит», содержащей 10% ПФУ; 4 — рана закрыта ЖЭК; 5 — рана закрыта ЖЭК, содержащим 10% ПФУ. В ранах группы 1 наблюдали большое количество раневого отделяемого, фиброзных отложений и гноя. У животных остальных групп рана была закрыта сухой коркой. Анализ гистологических срезов ран в контроле показал наличие выраженной зоны некроза, которая пронизана нитями фибрина с выраженной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией и примесью полиморфно-ядерных
90%
к
§ 80%
0 12 3 4
Сутки культивирования
□ контроль В5% ПФУ Е110% ПФУ Н20% ПФУ
Рис. 1. Степень конфлуентности культуры МСК при культивировании в присутствии ПФУ в различных концентрациях.
в
Рис. 2. Контракция матрикса клетками: а, б - фото желатиновой губки МСК (а - контракция клетками волокон губки, б -желатиновая губка без клеток); в - график контракции коллагенового геля различного состава МСК.
лейкоцитов (ПЯЛ), в дерме — деструкция пучков коллагеновых волокон и выраженная лимфо-ги-стиоцитарная инфильтрация, сосуды расширены, эпителизация отсутствовала (рис. 3а). В группе 2 на срезах присутствуют остатки губки, под губкой в центре раны — выраженные деструктивные изменения коллагеновых волокон с умеренной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией и примесью ПЯЛ (рис. 3б), сосудистая реакция выражена (рис. 3в). В группе 3 умеренные деструктивные изменения коллагеновых волокон с расширенными полнокровными сосудами и умеренной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией глубоких слоев дермы, эпидермис отсутствует (рис. 3г, д). В группе 4 в дерме наблюдается дезорганизация соединительной ткани с расширенными полнокровными сосудами, лимфо-гистиоцитарная инфильтрация не выражена, эпителизация краевая, количество слоев клеток в эпителии не превышает 3 (рис. 3е),
центр раны не эпителизирован, с умеренной зоной некроза. В группе 5 (рис. 3ж, з) в зоне дефекта умеренная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация с многочисленными расширенными полнокровными сосудами в дерме, краевая эпителизация, количество слоев клеток в эпидермисе — не менее
5. Центральная зона раны закрыта однослойным эпителием.
Таким образом, показано, что введение ПФУ в состав конструкции ЖЭК, не влияет на пролиферацию клеток, увеличивает физиологическую активность клеток стромального компонента ЖЭК и вызывает стимуляцию регенерации в модели кожной раны на лабораторных животных.
литература
1. Жижин Ф.С., Дряхлое В.А. Лечение гнойно-деструктивных осложнений панкреонекроза перфтораном (предварительное сообщение) //
рис. 3. Гистологические срезы кожных ран. Окраска гематоксилин-эозином. а - открытая рана; б, в - подложка; г, д -подложка + ПФУ; е - ЖЭК; ж, з - ЖЭК + ПФУ (* - подложка).
^
Физиологическая активность фторсодержащих соединений. — Пущино, 1995. — С. 216 — 218.
2. Использование эмульсии перфторуглеро-дов в местном лечении ран, осложненных хирургической инфекцией / Хрупкин В.И. [и др.] // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. — СПб., 1997. - С. 117-118.
3. Клеточные технологии в замещении тканевых дефектов в онкологии / Чиссов В.И. [и др.] // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2006. - № 6. - С. 34-38.
4. Контракция коллагенового геля фибробла-стами эмбриона человека: влияние факторов роста клеток / Руднева С.П. [и др.] // Биологические мембраны. - 1990. - Т. 7. - С. 1283-1288.
5. Крылов К.М., Аникин Ю.В. Перфторан в практике оперативного лечения обожженных // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине. - СПб., 1999. - С. 44.
6. Местное применение перфторана в комплексном лечении длительно заживающих ран / Е.Н. Клигуненко [и др.] // Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино, 1999. - С. 146-150.
7. Роговая О.С., Васильев А.В., Киселев И.В., Терских В.В. Использование фибробластов человека, выращенных на микроносителях, для фор-
мирования эквивалента соединительной ткани // Онтогенез. - 2004. - Т. 35 (2). - С. 105-109.
8. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов / Смирнов С.В. [и др.] // Хирургия им. Н.И. Пирогова. - 2003. - № 12. -С. 58-62.
9. Сравнение дифференцировочных потенций фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фи-бробластов дермы человека / Е.В. Киселева [и др.] // Цитология. - 2009. - № 51 (1). - С. 12-19.
10. Терских В.В., Васильев А.В. Эпидермальные кератиноциты человека и животных: проблемы культивирования и трансплантации. - М.: Наука, 1995. - 103 с.
11. Development and use of a living skin equivalent / Е. Ве11 [et al.] // J. Plastic & Reconstruct. Surg. -1981. - Vol. 67 (3). - P. 386-392.
12. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D-constructs / W.L. Grayson [et al.] // J. Cell. Physiol. - 2006. -N 207 (2). - P. 331 -339.
13. Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adipose-derived mesenchymal cells / P. Malladi [et al.] // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2006. - N 290 (4). - P. 1139-1146.
14. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness / Е. ВеП [et al.] // Science. - 1981. - N 211 (6). - P. 1052-1054.
сведения об авторах
Роговая Ольга Сергеевна - младший научный сотрудник лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г Москва, ул. Вавилова, 26; тел./факс: 8 (499) 135-40-81; e-mail: rogovaya26f@gmail.com)
Киселева Екатерина Владимировна - научный сотрудник лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Дашинимаев Эрдэм Баирович - научный сотрудник лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Щипицына Валерия Сергеевна - старший лаборант лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Файзуллин Рузель Рафаэллович - старший лаборант лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Васильев Андрей Валентинович - доктор медицинских наук, заместитель директора Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва, ул. Вавилова, 26; тел.: 8 (499) 135-76-74; e-mail: 113162@bk.ru)
Суханов Юрий Владимирович - старший научный сотрудник лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Терских Василий Васильевич - доктор биологических наук, заведующий лабораторией проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
