CC BY
8УДК633.55:615.25
Солохина И.Ю., кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Орловский государственный агарный университет имени Н.В. Парахина», e-mail: solohinairina@,yandex. ru
Гнеушева И.А., кандидат технических наук Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Орловский государственный агарный университет имени Н.В. Парахина», e-mail: obc1-2010@mail.ru Solokhina I.Yu., Candidate of Biological Sciences, Associate Professor Orel State Agrarian University,
Orel Qty, Russia, e-mail: solohinairina@yandex.ru Gneusheva I.A., Candidate of Technical Sciences, Associate Professor Orel State Agrarian University,
Orel Qty, Russia, e-mail: obc1-2010@mail.ru
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГЛИКОЗИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ СТЕВИИ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
(Study of the influence of stevia glycoside compounds on antioxidant activity of agricultural plants)
В настоящее время существует необходимость создания экологически безопасных биорегуляторов роста растений. Известно, что стевия 81еу[а теЬы/Иапа БеНот является перспективным источником веществ, обладающих антиоксидантным действием. Установлено, что стевия содержит дитерпеновые гликозиды, обладающие росторегулирующей активностью. Проведены исследования по изучению антиокидантной активности экстрактов дитерпеновых кликозидов в концентрациях 10-4%, 10-6%. 10-8%. Установлено, что в проростках пшеницы, обработанных экстрактами дитерпеноидов, увеличивается уровень аскорбатпероксидазы и пероксидазы, что является следствием снижения окислительного стресса растения, значение показателей пероксидазы снижается. Уровень малонового диальдегида как важного показателя окисления клеток снижался при обработке экстрактом гликозидов в 10-8%, что говорит о его защитном влиянии на окислительный статус клеток растений. Выявлено, что при воздействии экстракта дитерпеноидов в концентрации 10-8% наблюдали оптимальные показатели лабораторной всхожести и энергии прорастания. Экстракты дитерпеновых гликозидов являются перспективными компонентами для создания средств с ростостимулиру-ющим и антиоксидантным действием.
Ключевые слова: стевия, гликозиды, антиоксидантная система, пшеница
На сегодняшний день среди исследований остается актуальным поиск и выяснение механизмов действия биологически активных веществ, которые обладают росторегулирующими и антиоксидантными свойствами и являются, в том числе, экологически безопасными. К одним из таких соединений можно отнести, в частности, дитерпеновый гликозид стевио-зид, содержащийся в растении Б(еу1а геЬыЛапа БеМот.
Стевия культивируется во многих странах мира, является многолетним растением семейства астровых. Растение представляет собой сильноразветвленный куст, произрастающий в высоту 60-80 см.
Сладкий вкус травы обусловлен наличием сладких дитерпеновых гликозидов (ДГ) не углеводной природы - 10% стевиозида. Дитерпеновые гликозиды в листьях стевии распределены следующим образом: стевиозид 5,5-6,0% и ребаудиозид А 4,0-4,5%, кроме
Currently, there is a need to create environmentally friendly bioregulators of plant growth. Stevia Stevia re-budiana Bertoni is known to be a promising source of substances with an antioxidant effect. It has been established that stevia contains diterpene glycosides with growth-regulating activity. Studies have been conducted to study the antioxidant activity of diterpene clicoside extracts at concentrations of 10"4%, 10-6%. 10"8%. It was found that in wheat seedlings treated with diterpenoid extracts, the level of ascorbate oxidase and peroxidase increases, which is a consequence of reducing the oxidative stress of the plant, the value of peroxidase indicators decreases. The level of little-new dialdehyde as an important indicator of cell oxidation decreased by 10-8% when treated with glycoside extract, which indicates its protective effect on the oxidative status of plant cells. It was revealed that when exposed to diterpenoid extract in a concentration of 10-8%, optimal indicators of laboratory germination and germination energy were observed. Extracts of diterpene glycosides are promising components for creating products with growth-stimulating and antioxidant effects.
Key words: stevia, glycosides, antioxidant system, wheat
них определены также ребаудиозид R, S, G, D, М, КА, дулкозид B, эвгенол диглюкозид.
В траве стевии содержится 17 аминокислот (лизин, глицин, метеонин и другие, из них 8 незаменимых); полиненасыщенные жирные кислоты (линоле-вая, леноленовая, архидоновая); витамин А, витамины группы B, C, E, D, K; флавоноиды; растительные гликозиды, сапонины; алкалоиды; эфирные масла; дубильные вещества; кремневая кислота [4].
Дитерпеноиды представляют собой большой класс природных соединений обмена высших растений. Многие дитерпеноиды являются ценными веществами (регуляторы роста растений, инсектициды, опухолеобразование) [6].
Проведение исследований в области изучения биологической активности вторичных метаболитов растений имеет важное прикладное значение для науки, поскольку на основе веществ, обладающих росторегулирующим действием и антиоксидантной
активностью существует возможность создания полифункциональных регуляторов роста растений.
Еще японскими исследователями было установлено, что стевиол и его производные обладают свойствами регуляторов роста [7,8].
Известно, что биостимуляторы роста растений, полученные на основе природного сырья являются экологически безопасными и безвредными для человека [2].
Стевиол относили к предшественникам гиббе-релловой кислоты благодаря характерному для гиббе-реллинов цис-сочленению В и С колец тетрацикличе-ской углеводородной системы. Однако были получены сведения о том, что производные стевиол-гликозидов проявляют гиббереллиноподобную активность [3]. При проведении исследований выяснено, что энткауреновый скелет всех стевиолгликозидов был сформирован подобно гиббериллинам, по метил-эритритолфосфатному пути биосинтеза изопренои-дов, разнообразный спектр гликозидов стевии связан с воздействием ферментов гликозилтрансфераз на агликон стевиол [5]. Результатом такого воздействия явилось образование многообразия соединений различной химической структуры.
Так, большой практический интерес представляет изучение антиоксидантной активности гликозидов из листьев стевии, в связи с тем, что имеет большой потенциал в качестве природного источника антиок-сидантов.
В настоящее время большинство научных исследований связано, в частности, с тем, что стевия содержит дитерпеновые гликозиды, которые чрезвычайно перспективны в качестве сахарозаменителей для людей, страдающих от нарушений углеводного обмена и, особенно, для больных диабетом, так как они обладают гипогликемическими свойствами [1]. Однако, большой практический интерес представляют дитерпеновые гликозиды, проявляющие самую разнообразную биологическую активность, поэтому ак-тульным является выяснение особенностей действия дитерпеноидов на антиоксидантные системы сельскохозяйственных растений.
Целью данного исследование являлось изучения влияние экстрактов дитерпеновых гликозидов стевии на антиокидантный потенциал озимой пшеницы.
Материалы и методы исследований
Объектами исследования служили сухие листья стевии ^вуга гвЬаыЛапа Бв^опг), из которых извлекали сумму дитерпеновых гликозидов трехкратной водно-спиртовой экстракцией; очистку проводили последовательно фильтрованием и двукратной перекристаллизацией.
Извлечение дитерпеновых гликозидов из листьев стевии с соотношением сырье-экстрагент 1:100 проводили путем экстракции водно-спиртовым раствором при нагревании на кипящей водяной бане в течение 45 мин.
Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) была использована модифицированная методика (Ермаков А.П., 1987), которая основана на изме-
рении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Объем выделившегося кислорода регистрировали с 3-ей по 15-ю минуту после начала реакции с интервалом 3 мин. По полученным данным строили кинетические кривые зависимости объема выделившегося 02 от времени и аппроксимировали их функцией вида >=а-1п(х)+Ь.
Активность пероксидазы определяли колориметрическим методом Бояркина с модификациями (Ермаков А.П., 1987). Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования продукта окисления синего цвета определенной концентрации, определяемой заранее методом фотоколориметрии.
Аскорбатпероксидаза (КФ 1.10.3.3) - фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую. Его активность определяли по интенсивности поглощения кислорода спектрофото-метрически. Аскорбинова кислота поглощает максимум света при длинне волны 265 нм. Об активности фермента судят по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента (Ермаков А.П. 1987).
Определение уровня малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, с максимумом поглощения при 532 нм. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса - е = 1,56*105 см-1 *М-1 (Орехович В.Н. 1997).
Показатели всхожести и энергии прорастания определяли по ГОСТ - 12037. Всхожесть - количество нормально проросших семян, выраженное в процентах к пробе, взятой для анализа. Лабораторная всхожесть определяется после проращивания семян в течение 7-8 суток в термостате в специальных растильнях, заполненных увлажненным прокаленным песком, или чашках Петри, дно которых простилают увлажненной фильтровальной бумагой, при температуре 20-22 °С.
Энергия прорастания - это процент проросших семян за определенный срок. Показатели энергии прорастания определяли на 4 сутки вегетации.
Результаты и их обсуждение
Проводили исследования по ростостимулирую-щему влиянию экстрактов дитерпеновых гликозидов на озимую пшеницу сорта «Московская 39». Зерно пшеницы в количестве 100 штук обрабатывали предварительно слабым раствором перманганата калия в течении 30 минут. Затем замачивали исследуемые семена в растворах стевиозида в концентрациях 104%, 10-6%, 10-8% в течение часа. Семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги согласно ГОСТ в условиях фитотрона. Определяли энергию прорастания на 4-е сутки вегетации, лабораторную всхожесть на 7-е сутки вегетации. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Показатели всхожести и энергии прорастания озимой пшеницы «Московская 39»
Варианты испытаний Энергия Всхожесть,
прорастания,% %
Контроль (дистиллированная вода) 80 82
Эпин 92 94
Экстракт ДГ, 10-4% 84 86
Экстракт ДГ, 10-6% 84 88
Экстракт ДГ, 10-8% 94 96
По результатам исследования было установлено, что экстракт гликозидов в концентрации 10-8% в большей степени по сравнению с другими исследуемыми вариантами показал оптимальные значения ла-
бораторной всхожести и энергии прорастания, мор-фометрических показателей.
Таблица 2 - Показатели всхожести и энергии
прорастания озимой пшеницы «Московская 39»
Варианты испытаний Длина корешка, мм Длина проростка, мм
Контроль (дистиллированная вода) 35 17
Эпин 52 32
Экстракт ДГ, 10-4% 46 22
Экстракт ДГ, 10-6% 48 27
Экстракт ДГ, 10-8% 54 36
Исходя из полученных данных, выявили оптимальную концентрацию экстракта дитерпеноидов 108%: длина корешка составила - 52 мм, длина проростка - 36 мм.
При исследовании биологической активности экстрактов дитерпеноидов, установлено, что экстракт гликозидов концентрации 10-8% в большей степени по сравнению с другими исследуемыми вариантами показал оптимальные значения лабораторной всхожести и энергии прорастания, морфометрических показателей корешков и проростков озимой пшеницы «Московская 39».
Неспецифической реакцией клетки на действие стрессовых факторов является образование активных форм кислорода. Для защиты от активных форм кислорода в растениях выработались системы, включающие в себя как антиоксидантные ферменты, так и
низкомолекулярные соединения. Уровень перекисно-го окисления липидов, в результате которого образуются свободнорадикальные продукты и карбонильные соединения, к которым относится малоновый диаль-дегид - это важный показатель степени повреждения клетки.
В наших исследованиях наблюдали снижение уровня каталазы (табл.3) в проростках пшеницы, обработанных раствором стевиозида 10-8% на 40% в сравнении с контролем, в том числе наблюдали снижение уровня фермента относительно других ферментов антиоксидантной системы. Данный процесс связан низким сродством к субстрату, и снижение активности каталазы, может быть связано с уменьшением образования активных форм кислорода при действии дитерпеновых гликозидов.
Таблица 3. Показатели активности каталазы в проростках пшеницы «Московская 39» на 7-е сутки
Варианты испытаний Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода) 2,5
эпин 2,8
Экстракт ДГ, 10-4% 2,2
Экстракт ДГ, 10-6% 1,8
Экстракт ДГ, 10-8% 1,5
Активирование пероксидазы является характерной ответной биохимической реакцией растений, по которой можно судить об устойчивости растений. Уровень пероксидазы в 7-ми дневных проростках пшеницы увеличивался на в сравнении с контролем.
Наблюдалось снижение уровня каталазы в проростках пшеницы, обработанных раствором стевиози-да 10-8% на 40% в сравнении с контролем, в том числе наблюдали снижение уровня фермента относительно других ферментов антиоксидантной системы (табл.4).
Таблица 4 - Показатели активности пероксидазы в проростках пшеницы «Московская 39» на 7-е сутки
Варианты испытаний Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода) 60
эпин 68
Экстракт ДГ, 10-4% 72
Экстракт ДГ, 10-6% 74
Экстракт ДГ, 10-8% 70
Ферментом, определяющим ликвидацию актив- Результаты исследований уровня активности аскор-ным форм кислорода, является аскорбатпероксидаза. батпероксидазы представлены в таблице 5.
Таблица 5- Показатели активности аскорбатпероксидазы в проростках пшеницы «Московская 39»
Варианты испытаний Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода) 2,4
эпин 4,3
Экстракт ДГ, 10-4% 3,8
Экстракт ДГ, 10-6% 4
Экстракт ДГ, 10-8% 4,6
Из полученных результатов следует, что при выращивании растений, которые подвергали обработке экстрактами гликозидов в разных концентрациях наблюдали увеличение активности этого фермента по сравнению с контролем.
Поскольку одним из показателей повреждения клетки свободными радикалами является показатель уровня малонового диальдегида. Значение показателей уровня малонового диальдегида представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Показатели значений малонового диальдегида в проростках пшеницы «Московская 39»
Варианты испытаний Показатели активности каталазы Е/г сухой массы
Контроль (дистиллированная вода) 2,6
эпин 4,0
Экстракт ДГ, 10-4% 3,8
Экстракт ДГ, 10-6% 4
Экстракт ДГ, 10-8% 4,6
В наших экспериментах экстракт дитерпеноидов в концентрации 10-8% снижал образование диальдегида на 24%, что свидетельствует о его защитном влиянии на окислительный статус клетки.
Таким образом, дитерпеновые гликозиды вызывают в проростках пшеницы уменьшение содержания малонового диальдегида, увеличение активности ан-тиоксидантных ферментов - пероксидазы и аскор-
батпероксидазы, что свидетельствует о снижении окислительного стресса в растении. В результате проведенных исследований показано, что полученный экстракт дитерпеновых гликозидов из сухих листьев стевии можно использовать в качестве активного компонента перспективного регулятора роста растений.
Литература
1. Бондарев Н.И. Дитерпеновые гликозиды в интакт-
ных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) Автореф. Диссертации на соискание ученой степ. доктора биол.наук. Орел, 2011. 50 с.
2.Водный экстракт из листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) как биостимулятор роста растений в светокультуре / Синявина Н.Г. и др.// Овощи России. 2020. №6. С.31-35.
3. Михайлов А.Л., Невмержицкая Ю.Ю., Тимофеева
О.А. Стевиозид как антистрессовый регулятор роста и развития растений // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.Т.15.№3(5).С.1657.
4.Каххорова Сохиба Ихтиёр Кизи, Кароматов И.Д. Пищевое и лекарственное растение стевия (обзор литературы) Электронный научный журнал «Биология и интегративная медицина» 2017.
№11. С.111-112. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2020-6-31-35
5.Кочетов А.А., Синявина Н.Г. Стевия ^еуга геЬаыЛапа Ьег!от): биохимический состав, терапевтические свойства и использование в пищевой промышленности (обзор). Химия растительного сырья. 2021. №2. С. 5-27. Бог 10.14258 / .¡сргш.2021027931
6. Шульгина А.А. Зависимость морфофизиологиче-
ских показателей от условий выращивания Stevia
rebaudiana bertoni in vitro и in у^о: дис. ... канд. биол. наук. Москва, 2020. 122 с.
7. Iwamura J., Komai K. Diterpene glycosides as plant
growth regulators. Kiki Univ., Jpn. Patent, 1983. 5858806
8. Evaluation the genjtoxicity of stevioside and steviol
using six in vitro and one in vivo utagenicity assays / Matsui M. at al. // Mutagenesis. 1996. V. 11. N 6. P. 573-579.
Поступила в редакцию: 18.11.2021 г.
Солохина И.Ю., кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии ФГБОУ ВО «Орловский государственный агарный университет имени Н.В. Парахина», e-mail: solohinairina@yandex.ru
Гнеушева И.А., кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии ФГБОУ ВО «Орловский государственный агарный университет имени Н.В. Парахина», e-mail: obc1-2010@mail.ru
