CC BY
95
доцент Е.Н. Сизова, профессор В.И. Циркин, Т.В. Туманова исследование влияния двадцати аминокислот на В2-адрено- и мгхолинореактивность миометрия крысы
Вятский социально-экономический институт Кировская государственная медицинская академия
В опытах с гладкими мышцами матки крысы, коронарной артерии свиньи и трахеи коровы показано [6,8,11,12,15,16] наличие в крови человека и животных эндогенных модуляторов хемореактивности прямого действия, в том числе эндогенного сенсибилизатора Р-адренорецепторов (ЭСБАР), эндогенного блокатора Р-адренорецепторов (ЭББАР), эндогенного блокатора М-холинорецепторов (ЭБМХР) и эндогенного сенсибилизатора М-холинорецепторов (ЭСМХР). Вопрос об их природе, клиническом значении и возможности использования аналогов этих факторов в диетическом питании человека до настоящего времени остается открытым.
В данной сообщении приводятся результаты исследования влияния 20 аминокислот на Р-адренореактивность и М-холинореактивность гладких мышц матки как возможных компонентов ЭСБАР, ЭББАР и ЭБМХР.
Материал и методы
В качестве тест-объекта использовали 286 продольных полосок (длиной 6-8 мм и шириной 2-3 мм) рога матки 46 небеременных крыс (в фазе метаэструса или диэструса). Регистрацию сократительной активности (СА) полосок миометрия во всех опытах (n=790) осуществляли в стандартных условиях по методике [15] при температуре 38оС и пассивной аэрации рабочих камер, объем которых не превышал 1 мл, с использованием 6-канального "Миоцитографа", созданного на основе механотронов 6МХ1С, самопищущих приборов Н-3020, термостатирующего устройства и шприцевого дозатора. Скорость перфузии полосок раствором Кребса, включающего (мМ) NaCl-136, KCl-4,7, CaCl2-2,52, MgCl2-1,2, KH2P04-0,6, NaHCO3-4,7, СбН1206-11,0 (рН=7,4), составляла 0,7 мл/мин; исходная нагрузка полосок - 4,9 мН. Схема проведения экспериментов заключалась в том (рис.1), что после 15-20-минутной перфузии полоски раствором Кребса проводили ее трехкратное (по 10 минут) тестирование ацетилхолином (10-6 г/мл) или адреналином (10-8 г/мл) до воздействия, на фоне и после удаления исследуемой концентрации аминокислоты, которую вводили в течение 20 минут, при этом с 11-ю по 20-ю минуту - совместно с ацетилхолином или адреналином. В работе использовали аминокислоты фирмы Реанал (Венгрия), в том числе р-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая, L-гистидин, L-глутамин, L-глутаминовая, L-лизин, L-лейцин, L-триптофан, L-цистеин, а также отечественного производства - глицин, D^-глутаминовая, D^-валин, Б^-изолейцин, D^-метионин, D^-пролин, D^-серин, D^-тирозин, D^-треонин, D^-фенилаланин. Аминокислоты, как правило, применяли в трех концентрациях (1-5х10-5,1-5х 10-6 и 1-5 х10-7 г/мл), при этом максимальная концентрация (1-5х10-5 г/мл) была близка к содержанию данной аминокислоты в цельной сыворотке крови [3]. В части опытов использовали смесь аминокислот. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке. Различия между показателями оценивали по критерию Фишера-Стьюдента и считали их достоверными при р<0,05.
Результаты исследования
Влияние аминокислот на спонтанную сократительную активность полосок миометрия крысы. Установлено, что все исследуемые полоски рога матки небеременных крыс обладали спонтанной СА (рис.1). Число сокращений варьировало в различных сериях от 6,38 до 10,6 за 10 минут, их амплитуда - от 3,43 мН до 13,2 мН, а суммарная СА - от 24,5 мН до 124 мН за 10 минут. Адреналин (10-8 г/мл) снижал параметры СА (рис. 1, А, Б и В), а ацетилхолин (10-6 г/мл) -достоверно повышал их (рис.1, Г, Д и Е). При изучении Р-адренореактивности миометрия 10 аминокислот (Р-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая, L-гистидин, D^L-изолейцин, L-лизин, D,L-метионин, D,L-тирозин, L-триптофан), которые вводили после удаления адреналина, вызывали достоверное и обратимое снижение спонтанной СА (рис. 1 и рис 2, А, Б и В). При изучении М-холинореактивности ни одна из 20 аминокислот не вызывала достоверно изменения параметров СА (рис. 1, и рис 2, А, Б и В). Эти данные позволяют заключить, что отмеченные выше 10 аминокислот, вероятно, способны проявлять миоцитингибирующее действие (как слабые блокаторы Са-проницаемости?), но при условии, что предварительно СА тест-объекта была снижена под влиянием адреналина, т. е. за счет предшествующей активации работы кальциевого насоса и/или снижения Са-проницаемости.
Исследование влияния аминокислот на Р-адренореактивность миометрия. Показано (рис. 3, А), что 17 из 20 аминокислот не влияли на Р-адренореактивность миометрия, в то время как 3 аминокислоты, в том числе L-гистидин (3х10-5 - 3х10-8 г/мл), L-триптофан (1х10-5 г/мл) и D^-тирозин (2х10-5, 2х10-6 г/мл), а также их смесь оказывали выраженное Р-адреносенсибилизирующее действие, т.е. достоверно (р<0,05) усиливали ингибирующий эффект адреналина. Например, в опытах с L-гистидином при 1-м тестировании адреналин снижал частоту сокращений, их амплитуду и суммарную СА соответственно (M+m) до 93,0+5,35%, 95,1+5,82% и 90,1+7,20% от исходного уровня соответственно, а при 2-м тестировании, т.е. на фоне L-гистидина (3х10-6 г/мл) - соответственно до 69,8+9,33, 42,8+9,42 и 36,3+10,4% (различия с результатами 1-го тестирования -достоверны, р<0,05); при 3-м тестировании адреналин не оказывал выраженного ингибирующего влияния -параметры ССА составили соответственно 94,6+4,62%, 104+6,90% и 102+7,70% от исходного уровня. Смесь 20
аминокислот, каждая из которых была использована в максимальной концентрации, достоверно усиливала ингибирующий эффект адреналина, в том числе при 10-, 100-, 103- и 104-кратных ее разведениях. Аналогичный эффект проявляла смесь Ь-гистидина, Ь-триптофана и Б,Ь-тирозина (цельная и в разведении 1:50 и 1:103). Смесь остальных 17 аминокислот (цельная и разведенная) не изменяла Р-адренореактивность миометрия крысы. Это означает, что наличие в среде аминокислот, не обладающих Р-адреносенсибилизирующей активностью, не препятствует проявлению этой активности у Ь-гистидина, Ь-триптофана и Б,Ь-тирозина. Таким образом, показано, что из 20 исследованных аминокислот три, в том числе Ь-гистидин, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин оказывают подобно ЭСБАР на миометрий крысы Р-адреносенсибилизирующее влияние. Поэтому их можно рассматривать в качестве компонентов этого фактора. Показано, что ни одна из аминокислот не снижала Р-адренореактивность миометрия крысы. Это означает, что аминокислоты не входят в состав ЭББАР.
Влияние аминокислот на М-холинореактивность миометрия крысы. Показано (рис. 1, Г, Д и Е; рис.3, Б), что ни одна из 20 аминокислот, (в том числе Ь-гистидин, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин) не изменяла стимулирующий эффект ацетилхолина (10-6 г/мл): во всех сериях опытов различия между результатами 1-го, 2-го и 3-го тестирований полосок ацетилхолином, т.е. до, на фоне и после удаления аминокислоты носили недостоверный характер. Так, в серии с гистидином (3х10-5 г/мл) показано, что при 1-м, 2-м и 3-м тестированиях ацетилхолином суммарная СА полосок составила соответственно 232+20,6%, 276+16,0% и 300+43,5% от фонового уровня, в серии с триптофаном (1х10-5 г/мл) - соответственно 312+35,1%, 305+31,2% и 343+53,1%, а в серии с тирозином (2х10-5 г/мл) - соответственно 259+46,4%, 259+41,3% и 263+54,7%. Следовательно, ни одна из 20 исследованных аминокислот не способна изменять М-холинореактивность миометрия крыс. Это означает, что аминокислоты, скорее всего, не являются компонентами ЭБМХР и ЭСМХР.
Таким образом, показано, что три аминокислоты из 20, в том числе Ь-гистидин, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин, не изменяя М-холинореактивность гладких мышц матки, оказывают на них выраженное Р-адреносенсибилизирующее влияние, что позволяет рассматривать их в качестве возможных компонентов ЭСБАР.
Обсуждение результатов исследования
Ранее было показано, что Ь-глицин [2] и Ь-аргинин [22] снижают М-холинореактивность миокарда, а глутамин [2] - повышают ее. В опытах с гладкими мышцами матки крысы нами показано, что ни одна из аминокислот не влияет на М-холинореактивность, в том числе Ь-глицин, глутамин и Ь-аргинин. Так как, согласно данным [7,10,23], в миометрии преимущественно находятся Мг, а в сердце - М2-холинорецепторы (М1-ХР, М2-ХР), то наши результаты позволяют утверждать, что способность аминокислот модулировать М-холинореактивность органа относительно специфична - она проявляется, по-видимому, в отношении М2-ХР. В последние годы появились данные о том, что компонентом ЭБМХР (в том числе при его воздействии на М2-ХР миокарда), скорее всего, является лизофосфатидилхолин [9], а компонентом ЭСМХР (при его действии на М2-ХР миокарда) - серотонин [5].
Нами показано, что три аминокислоты из 20, в том числе Ь-гистидин, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин каждая в отдельности или в смеси способна повышать Р-адренореактивность миометрия крысы. Подобная закономерность в отношении Ь-гистидина (10-5 г/мл) выявлена в опытах с миокардом лягушки [14]. Ранее было показано, что Ь-гистидин, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин повышают р2-адренореактивность гладких мышц трахеи коровы, коронарной артерии свиньи, а также матки крысы, деполяризованных гиперкалиевым раствором Кребса [8], в том числе сниженную под влиянием озона [13]. С учетом данных [1,10,17,20,21], о доминировании в гладких мышцах матки, коронарных артерий и трахеи р2 -,а в миокарде - Р^адренорецепторов (р2-АР, Р1-АР), можно утверждать, что, по крайней мере, гистидин (как, вероятно, Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин) повышает Р1- и р2-адренореактивность клеток организма. Важно подчеркнуть, что ни Ь-гистидин, ни Ь-триптофан и Б,Ь-тирозин не влияют на М-холинореактивность миометрия. Косвенно это означает, что в условиях организма эти три аминокислоты будут повышать Р-адренореактивность органов, не изменяя их М-холинореактивность. Это, с одной стороны, указывает на специфичность их действия, а с другой, позволяет говорить о возможности селективного повышения Р-адренореактивности органов под влиянием этих аминокислот, при котором М-холинореактивность не меняется.
Касаясь возможного механизма Р-адреносенсибилизирующего действия Ь-гистидина, Ь-триптофана и Б,Ь-тирозина, следует, прежде всего, учитывать, что механизм действия адреналина и ацетилхолина связан с деятельностью двух различных систем посредников. Известно, что миоцитстиулирующее действие ацетилхолина обусловлено увеличением содержания в клетках инозитолтрифосфата, диацилглицерина и ненасыщенных жирных кислот за счет активации фосфолипазы А2 и протеинкиназы С [10], а механизм миоцитингибирующего действия адреналина обусловлен повышением активности протеинкиназы А, вызванное ростом активности аденилатциклазы [1,4,10]. Косвенно эти данные позволяет предположить, что способность гистидина, триптофана и тирозина повышать Р-адренореактивность клеток обусловлена их влиянием на систему, работающую с участием аденилатциклазы и цАМФ. С другой стороны, учитывая представления о строении и функционировании Р-АР [10,17], в том числе о наличии в клетках киназы и фосфатазы Р-АР, мы полагаем, что Р-адреносенсибилизирующий эффект гистидина, триптофана и тирозина может быть обусловлен их способностью ингибировать киназу Р-АР и/или активировать фосфатазу Р-АР и/или за счет повышения сродства Р-АР к катехоламинам.
Независимо от механизма Р-адреносенсибилизирующего действия Ь-гистидина, Ь-триптофана и
D^-тирозина, считаем, что эти три аминокислоты являются важными компонентами внутренней среды организма, участвующими в регуляции ß-адренореактивности органов и тканей. Кроме того, полагаем, что эти аминокислоты могут быть использованы с целью повышения ß-адренореактивности органов и тканей, что особенно важно в условиях сниженной эффективности ß-адренергического воздействия, как это имеет место при сердечной недостаточности и гипертонической болезни [4,18,19]. В связи с этим отметим, что недавно нами было показано [11], что предуктал и милдронат, используемые в кардиологии как метаболические препараты, в том числе при инфаркте миокарда, подобно L-гистидину, L-триптофану и D^-тирозину, повышают ß-адренорактивность миоцитов матки крысы, коронарной артерии свиньи и трахеи коровы. Это означает, что гистидин, триптофан и тирозин (прежде всего, как естественные компоненты пищевых продуктов, особенно молочных и мясных) могут также применяться в подобных ситуациях. Все это может иметь важное значение при разработке вопросов диетического питания и комплексной терапии заболеваний, вызванных недостаточностью ß-адренергических воздействий на висцеральные органы (гипертоническая болезнь, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, бронхиальная астма и др.)
Выводы:
1. Три аминокислоты из 20, в том числе L-гистидин, L-триптофан и D^-тирозин существенно повышают ß2-адренореактивность гладких мышц матки крысы, т.е. обладают выраженной ß2-адреносенсибилизирующей активностью, что дает основание рассматривать гистидин, триптофан и тирозин в качестве компонентов эндогенного сенсибилизатора ß2-адренорецепторов (ЭСБАР).
2. Все исследованные 20 аминокислот, включая гистидин, триптофан и тирозин, не оказывают существенного влияния на Mi-холинореактивность гладких мышц матки крысы. Это доказывает селективность ß2-адреносенсибилизирующего эффекта гистидина, триптофана и тирозина и указывает на перспективность их клинического применения.
Список литературы:
1. Александрова Е.А. Кальцийтранспортирующие системы и регуляция концентрации кальция в кардиомиоцитах. // Усп. физиол. наук.- 2001.- Т.32, № 3.- С.40-48.
2.Бабская Н.Е., Ашмарин И.П. Действие дипептидов GLY-PRO, PRO-GLY, глицина и пролина на кардиотропные эффекты ацетилхолина // Бюл. эксп.. биол. и мед. - 1998. - №8. - С. 139-141.
3.Западнюк В.И., Купраш Л.П., Заика М.У и др. Аминокислоты в медицине.- Киев: Здоровье, 1982.-С.139-151.
4.Красникова Т.Л., Габрусенко С.А. ß-адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности // Усп. физиол. наук.-2000.- Т.31, №2.- С.35-50.
5.Лычкова А.Э., Смирнов В.М. Исследование миокардита в эксперименте в условиях синергичного взаимодействия серотонинергических и холинергических нервных волокон // Рос. кардиол. журн.- 2002.- №5 (37).- С. 82-86.
6. Мальчиова С. В., Сизова Е.Н., Циркин В. И., Гуляева С.Ф., Трухин А.Н. М-холиноблокирующая активность сыворотки крови при остром коронарном инциденте и влияние на нее физических тренировок // Рос. физиол. журн. - 2003.- Т. 89, № 5.- С. 556 - 563.
7.Музаффаров Д.У. Сродство агонистов и антагонистов к М-холинорецепторам изолированных тканей крысы //4-й Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство". - М., 1997. - С. 277.
8. Ноздрачев А.Д., Туманова Т.В., Дворянский С.А., Циркин В.И., Дармов И.В., Дробков В.И. Активность ряда аминокислот как возможных сенсибилизаторов ß-адренорецепторов гладкой мышцы //Доклады РАН.-1998. Т. 363, № 1. - С.133-136.
9.Проказова Н.В., Звездина Н.Д., Суслова И.В., Коротаева А.А., Турпаев Т.М. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердца к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензилата с мембранами миокарда // Рос. физиол. журн.- 1998.- Т.84, №10.- С.969-978.
10. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ.-Волгоград: «Семь ветров», 1999.- 640 с.
11. Сизова Е.Н., Циркин В.И., Подтетенев А.Д., Братчикова Т.В., Дворянский С.А., Анисимова О.В., Трухин А.Н., Воробьев А.А. Способность триметазидина (предуктала) и милдроната оказывать прямое ß-адреносенсибилизирующее действие на гладкие мышцы. Сообщение 2.// Рос. кардиол. журн.- 2002.- № 2 (34).-С.50-56.
12. Сизова Е.Н., Трухин А.Н., Циркин В.И., Дворянский С. А. Снижение М-холинореактивности миокарда лягушки под влиянием сыворотки пуповинной крови человека //Новые биокибернетические и телемедицинские технологии: Мат. конф.- Петрозаводск: ПГУ, 2003. С.36.
13. Сизова Е.Н, Циркин В.И., Костяев А.А. Влияние озона на сократительную активность и хемореактивность продольной мускулатуры рога матки небеременных крыс //Рос. физиол. журн. 2003.- Т.89. №4.- С.427-435.
14.Трухин А.Н., Анисимова О.В., Циркин В.И., Дворянский С.А. Исследование способности эндогенного сенсибилизатора ß-адренорецепторов изменять ß-адренореактивность сердечной мышцы. //Адренергический механизм как компонент системы регуляции сократительной деятельности матки при беременности и в родах -Сб. научн. тр. - Киров: КГМА, 2001.- С.80-85.
15. Циркин В.И., Дворянский С.А., Ноздрачев А.Д., Братухина С.В., Морозова М.А., Сизова Е.Н., Осокина А.А., Туманова Т.В., Шушканова Е.Г., Видякина Г.Я. Адреномодулирующие эффекты крови, ликвора, мочи,
слюны и околоплодных вод человека // Доклады РАН - 1997. - Т.352, №1.- C. 124-126.
16.Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Сазанова М.Л., Дворянский С.А., Хлыбова С.В. Утероактивные, Р-адреномодулирующие и М-холиномодулирующие свойства сыворотки пуповинной крови человека. // Доклады РАН.- 2003- Т.388, №5.- С.704-707.
17. Циркин В.И., Трухина С.И. Физиологические основы психической деятельности и поведения человека.-М.: Мед. книга, 2001.- 524с.
18.Castellano M., Bohm M. The cardiac P-adrenoceptor-mediated signaling pathway and its alterations in hypertensive heart disease // Hypertension. - 1997.- V.29, №3.- P.715-722.
19.Doggrell S., Petcu E., Barnett C. Affinity constants and P-adrenoceptor reserves for isoprenaline on cardiac tissue from normotensive and hypertensive rats //J. Pharm. and Pharmacol. - 1998 .- V.50, №2.- P.215-223.
20. Fischmeister R., Vandecasteele G., Abi-Gerges N. et al. Muscarinic regulation of the heart: NO news is bad news // J. Physiol. Proc.- 1998.- №493.- P.2-3.
21.Hanratty C., Silke B., Riddell J. Evaluation of the effect on heart rate variability of a p2-adrenoceptor agonist and antagonist using non-linear scatterplot and sequence methods // Brit. J. Clin. Pharmacol.- 1999.- V.32, №1.-Р.157-166.
22.Kawaguchi T., Koehler R., Brusilow S., Traystman R., Pial arteriolar dilation to acetylcholine is inhibited by ammonia-induced increases in glutamine // FASEB Journal, - 1997.- V.11, №3.- P.486.
23.Yamamoto Shuji, Miyamoto Atsushi, Kawana Shin, Namiki Akiyoshi, Ohshika Hideyo, Role of nitric oxide production through M2-cholinergic receptors in cultured rat ventricular myocytes // Biochem. and Biophys. Res. Commun.- 1998.- V.245, №3. - P.791-795.
А.
Гис 3x10" АДР-J
АДР-8
Б.
ijUJUjJp^1
шМшк
АДР-8
Тир 2хИГ6 АДР-8
АДР-8
В.
АДР-8
Три 1x10 АДР-8
АДР-8
Г.
A1IX-6
№PJUUUl
JLL
1
III
ГисЗхЮ"6 АЦХ-6
АЦХ-6
Д.
Е.
Тир 2x10" АЦХ-6
У
АЦХ-6
Три 1х10"ь АЦХ-6
АЦХ-6
Рис. 1. Механограммы продольных полосок рога матки небеременных крыс, демонстрирующие наличие Р-адреносенсибилизирующих эффектов Ь-гистидина (Гис) в концентрации 3х10-6 г/мл (панель А), Б,Ь-тирозина (Тир) в концентрации 2х10-6 г/мл (панель Б) и Ь-триптофана (Три) в концентрации 10-6 г/мл (панель В), а также отсутствие М-холиномодулирующих эффектов у данных аминокислот (панели Г, Д и Е).
Горизонтальные линии под механограммами отражают момент воздействия аминокислот, адреналина (10-8 г/мл, АДР-8) и ацетилхолина (10-6 г/мл, АЦХ-6). Калибровка - 10 мН, 10 мин.
А.
120 - 96-
ЮО-
8о-6о -
4020-О-
12
±2
12 12 12 12 12 12 12 12 12
АЛА АРГ АСП АСК ЕАЛ ГИС ГЛИ ГЛУ ГЛК ИЗЛ ЛЕИ
ЛИЗ
12 12 12 12 А 2
МЕТ ПРЛ СЕР ТИР ТРЕ
12 12 12 |
ТПФ ФЕН ЦИС
Б.
14о-%
120-ЮО-
8о -6о
4020 О-
у-Е
12
12
АЛА АРГ АСП АСК БАЛ ГИС ГЛИ ГЛУ ГЛК ИЗЛ ЛЕИ
ЛИЗ
МЕТ ПРЛ СЕР ТИР ТРЕ
ТПФ ФЕН ЦИС
В.
14о-%
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 ;
л АЛ А ЕЕ АСП АСК БАЛ ГИС ГЛИ ГЛУ ГЛК ИЗ Л ЛЕЙ ЛИЗ МЕТ ПРЛ СЕР ТИР ТРЕ ТИФ ФЕН ЦИС
Рис. 2. Частота сокращений (панель А), их амплитуда (панель Б) и суммарная сократительная активность (панель В) изолированных полосок рога матки крысы (в процентах от фонового уровня) в присутствии соответствующих аминокислот, действующих после тестирования полоски адреналином (10-8 г/мл; 1) или ацетилхолином (10-6 г/мл; 2). * - отличие от фонового уровня достоверно (р<0,05).
АЛА АРГ АСП АСК БАЛ ГИС ГАИ ГЛУ ГЛК ИЭЛ ЛЕЙ ЛИЗ МЕГ ПРЛ СЕР ТИР ТРЕ ТПФ ФЕН ЦИС
Б.
400 -%' 350 300
250 200
:
150 -■ 100 50 0
1
123
АЛА
123 АРГ
123
АСП
123
АСК
123
ВАЛ
123 ГИС
123 ГЛИ
123
ГЛУ
123
ГЛК
123
ЮЛ
123
ЛЕЙ
123
ЛИЗ
123
МЕТ
123
ПРЛ
123
СЕР
123
ТИР
123
ТРЕ
123 123 123
ТПФ ФЕН ЦИС
Рис. 3. Суммарная сократительная активность изолированных полосок рога матки крысы (в процентах от фонового уровня) при действии адреналина (10-8 г/мл, панель А) или ацетилхолина (10-6 г/мл, панель Б) до (1), на фоне (2) и после (3) воздействия соответствующей аминокислоты. Примечание: различия с первым (а) и вторым (Ь) тестированиями достоверны (р<0,05).
