CC BY
521
УДК 577.15+616.002
ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ФЕКАЛЬНОЙ ПИРУВАТКИНАЗЫ ТИПА М2 ПРИ НЕКОТОРЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ
© Н.А. Огнерубов, В.В. Милованов, А.А. Иванников, Е.Н. Ежова
Ключевые слова: опухолевая М2-пируваткиназа; злокачественные новообразования; капрологический тест. Приведены результаты определения в кале концентрации опухолевой М 2-пируваткиназы при некоторых злокачественных новообразованиях у 42 пациентов. В среднем у лиц контрольной группы уровень ее составил 2,18 Ед./мл, а при колоректальном раке - 6,97 Ед./мл; различия статистически достоверны.
ВВЕДЕНИЕ
Пируваткиназа играет важную роль в процессе гликолиза в активно пролифелирующих и опухолевых клетках. Она существует в виде различных изоформ, характеризующихся тканеспецифичностью (Ь, R, M1, M2). Пируваткиназа типа L обнаружена в печени и проксимальных почечных канальцах, типа R - в эритроцитах, типа М1 - в мышцах и мозге, и типа М2 - в легких. Причем, пируваткиназа М2-типа является филогенетически более древней формой. В активной форме все изоформы фермента состоят из четырех идентичных субъединиц, т. е. являются тетрамерами. Изофермент М2-пируваткиназы может существовать в высоко активной тетрамерной форме и почти неактивной димерной форме. Соотношение тетрамерной и димерной форм пируваткиназы в пролифелирующих клетках определяет, будет ли глюкоза деградировать в лактат с продукцией энергии или произойдет отведение пути ее метаболизма в сторону синтетических процессов. Соотношение тетрамер/димер для М2-пируваткиназы контролируется онкобелками и промежуточными продуктами метаболизма. При возникновении опухоли количество исходных тканеспецифичных изоэнзимов снижается, и опухолевые клетки начинают вырабатывать в большом количестве пируватки-назу типа М2. При этом изоэнзим, который изначально состоял из 4-х субъединиц, расщепляется до димера, имеющего более низкую активность. Димерная форма М2-пируваткиазы, характерная для опухолевых клеток, получила название опухолевой М2-пируваткиназы. В опухоли, где процесс клеточного деления идет очень активно, клетки предпочитают т. н. «метаболический шунт» с целью сохранения энергии. Димеризация М2-пируваткиназы происходит путем фосфорилирования или вследствие прямого связывания онкобелков и приводит к снижению активности энзима, аналогично, как и в случае с глюкозой при синтезе нуклеиновых кислот, фосфолипидов и аминокислот. Пируавткиназа М2-типа считается ключевым регулятором изменения метаболизма в опухолевых клетках. Она поступает в кровь, фекалии, что позволяет использовать этот параметр в качестве онкомаркера в лабораторной диагностике.
Роль этого фермента изучена в качестве онкомаркера при опухолях пищеварительного тракта, молочной железы, легких, почек [1-2], острых и хронических воспалительных процессах, особенно толстого кишечника [3-9]. Чувствительность и специфичность этого метода составили, соответственно, 60-80 и 80-90 % [1, 10-11]. Повышение уровня М2-пируваткиназы наблюдается также при острых и хронических воспалительных процессах, заболеваниях сердца, сахарном диабете и др. [8-9].
Так, установлено значительное повышение концентрации М2-пируваткиназы у больных с тяжелой и среднетяжелой формами неспецифического язвенного колита, в стадии обострения по сравнению с периодом ремиссии [10]. Уровень М2-пируваткиназы в крови пациентов с хроническим непрерывным течением при неспецифическом язвенном колите был почти в два раза выше по сравнению с таковыми при хроническом рецидивирующем течении [4-6].
Концентрация М2-пируваткиназы в кале больных колоректальным раком значительно выше, чем у здоровых лиц или пациентов с аденоматозными полипами и коррелирует с размерами и степенью злокачественности опухоли [12-13]. По данным В.П. Земляного и соавт. (2005), J. Kаri et all. (2008), пируваткиназа М2-типа обладает высокой чувствительностью и стадио-специфичностью, поэтому может быть использована в качестве предиктора эффективности лечения колоректального рака [14-15].
В настоящее время фекальный тест определения М2-пируваткиназы применяется как скрининг-тест колоректального рака в группах риска [16].
Целью работы явилось определение уровня опухолевой М2-пируваткиназы в кале при некоторых злокачественных новообразованиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Концентрацию опухолевой М2-пируваткиназы определяли в кале (копрологический тест) с помощью диагностического набора фирмы ScheBo Biotech AG. Исследование проводили на автоматическом микро-планшетном фотометре «Sunrise» фирмы TECAN (США) с микропроцессорным управлением с использованием вошера «TECAN» (США).
2864
Таблица 1
Уровень опухолевой М2-пируваткиназы у пациентов различных групп
Группа Количество больных Среднее значение, Ед./мл Интервал, Ед./мл
1 10 3,35 + 0,62 2,15-4,31
2 13 6,97 + 0,86 3,47-15,9
3 8 3,47 + 0,64 1,17-5,95
Контроль 11 2,18 + 0,39 1,51-4,01
На поверхность лунок планшета для ИФА наносились первые моноклональные антитела, специфичные только к опухолевой М2-пируваткиназе. Опухолевая М2-пируваткиназа, присутствующая в образце кала пациента, или стандарт для опухолевой М2-пируват-киназы из набора для ИФА связываются с этими антителами и, таким образом, иммобилизуются на планшете. Моноклональные антитела второго типа (конъюгированные с биотином) связываются с опухолевой М2-пируваткиназой в течение следующей инкубации. Затем добавляли коньюгат пероксидазы хрена со стреп-тавидином, который связывается с биотином антител второго типа. Пероксидаза хрена окисляет субстрат -ТМВ (3,3,5,5-тетраметил бензидин), который приобретает желтый цвет. В заключение концентрацию окисленного ТМВ определяют фотометрически.
Данный набор ИФА позволяет определить концентрацию опухолевой М2-пируваткиназы в пределах от 1 до 20 Ед./мл, а дискриминационный уровень равен 4 Ед./мл. Погрешность интра-исследования опухолевой М2-пируваткиназы была измерена посредством 20-кратного анализа 5 образцов кала (3,8-19,7 Ед./мл). Среднее значение коэффициента вариации составило 5,3 % (3,0-7,9 %).
Материалом для исследования послужили образцы кала 31 пациента, страдающих злокачественными новообразованиями различных локализаций, в возрасте от 38 до 76 лет, медиана возраста составила 47, 7 + 2,7 лет. Мужчин было 11 (35,5 %), а женщин - 20 (64,5 %). У всех больных диагноз злокачественного новообразования подтвержден морфологически. В качестве контроля использовались образцы кала от 11 практически здоровых лиц в возрасте от 38 до 65 лет, медиана возраста 44,6 + 2,4 лет. Все больные были разделены на 3 группы.
Первая группа представлена пациентами, страдающими различными хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта в стадии ремисии, а именно, эзофагитом, гастритом и колитом (исключая неспецифический язвенный колит). Медиана возраста - 46,1 + + 2,8 лет (35-62).
Пациенты второй группы (13) на момент исследования имели установленный диагноз злокачественного новообразования (вторая клиническая группа). Среди них колоректальный рак диагностирован у 7 больных, рак яичников - у 3, рак молочной железы, меланома и рак языка по 1 случаю. Медиана возраста в этой группе составила 43,3 + 2,1 лет (43-73).
Третью группу составили больные (8 человек), которым проведено специальное лечение по поводу колоректального рака, рака почки и поджелудочной железы (третья клиническая группа). Медиана возраста была равна 54,7 + 3,1 лет (43-76).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Уровень фекальной опухолевой М2-пируваткиназы у пациентов различных групп, включая контроль, представлен в табл. 1.
У лиц контрольной группы уровень опухолевой М2-пируваткиназы в более 50 % случаев был меньше 2 Ед./мл, и только лишь в 4 случаях он превышал этот показатель, составляя в среднем 2,18 + 0,39 Ед./мл.
У больных, страдающих заболеваниями желудочнокишечного тракта (1 группа), уровень опухолевой М2-пируваткиназы колебался от 2,15 до 4,31, в среднем -3,35 + 0,62 Ед./мл. У 6 пациентов он превышал 3 Ед./мл.
Весьма интересные результаты были получены у лиц с установленным диагнозом злокачественного образования (2 группа). При этом концентрация опухолевой М2-пируваткиназы колебалась от 3,47 до 15,9 Ед./мл, в среднем она была равна 6,97 + 0,86 Ед./мл. Относительно лиц контрольной группы различия статистически достоверны (р < 0,05). Как указывалось выше, в эту группу входили 7 пациентов, страдающих колоректальным раком. Колебания уровня опухолевой М2-пируваткиназы у них были от 3,61 до 15,9 Ед./мл, составляя в среднем 8,28 + 0,94 Ед./мл. Различия в показаниях средних значений концентраций, при этом относительно всех групп пациентов, статистически достоверны (р < 0,05).
Что касается больных 3 группы (лица, находящиеся на диспансерном наблюдении), то средняя концентрация фекальной опухолевой М2-пируваткиназы у них составила 3,47 + 0,64 Ед./мл и практически не отличается от пациентов 1 группы.
Полученные нами результаты соответствуют имеющимся в отечественной и зарубежной литературе сведениям о клинической значимости пируваткиназы типа М2 при диагностике целого ряда злокачественных новообразований, включая скрининг колоректального рака. Считается, что этот тест является более чувствительным и специфичным, особенно у лиц с высоким риском развития заболевания.
ВЫВОДЫ
1. Опухолевую М2-пируваткиназу можно обнаружить и количественно определить в человеческом кале.
2. Концентрация фекальной опухолевой М2-пиру-ваткиназы существенно колеблется при различных злокачественных новообразованиях. При этом значительно более высокий уровень ее наблюдается у больных колоректальным раком.
3. Определение опухолевой М2-пируваткиназы возможно использовать при организации диспансерного наблюдения за онкологическими больными.
2865
ЛИТЕРАТУРА
1. Сергеева Н.С., Мишунина М.П., Хомяков В.М. и др. Диагностика содержания в плазме крови опухолевой пируваткиназы М2-типа (ТиМ2-РК) на этапах диагностики, лечения и мониторинга больных колоректальным раком // Российский онкологический журнал. 2007. № 5. С. 9-12.
2. Spiller R.C., Jenkins B., Thornley J.P. et al. Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T-lymphocytes, and increased gut permeability following acute Campylobacter enteritidis and in post-dysenteric irritable bowel syndrome // Gut. 2000. V. 47. P. 804-811.
3. Johnson M. W., Maestranzi S., Duffy A.M. et al. Fecal M2-pyruvate kinase: a novel noninvasive marker of ideal pouch inflammation // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2009. V. 21. № 5. P. 544-550.
4. Chung-Faye G., Hayee B., Maestranzi S. et al. Fecal M2-pyruvate kinase (M2-PK): a novel marker of intestinal inflammation // Inflamm. Bowel. Dis. 2007. V. 13. P. 1374-1378.
5. Czub E., Herzing K.H., Szaflarska-Popawska A. et al. Fecal pyruvate kinase: a potential new markers for intestinal inflammation in children with inflammatory bowel disease // Scand. J. Gasnroenterol. 2007. V. 42. № 10. P. 1147-1150.
6. Jeffery J., Lewis S.J., Ayling R.M. Fecal dimeric M2-pyruvate kinase (tumor M2-PK) in the differential diagnosis of functional and organic bowel disorders // Inflamm. Bowel. Dis. 2009. V. 15. № 11. P. 16301634.
7. Shih D.Q., Targan S.R. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease // World J. Gastroenterol. 2008. V. 14. P. 390-400.
8. Staib P., Hoffmann M., Schinkothe T. Plasma levels of tumor M2-pyruvate kinase should not be used as a tumor markers for hematological malignancies and solid tumors // Clin. Chem. Lab. Med. 2006. V. 44. № 1. P. 28-31.
9. Oremek G., Rutners F., Sapoutzis N. et al. Tumor markers pyruvate kinase type tumor M2 in patients suffering from diabetic nephropathy // Anticancer Res. 2003. V. 23. P. 1155-1158.
10. Конович Е.А., Халиф И.Л. Содержание пируваткиназы типа М2 (М2-РК) в плазме крови больных воспалительными заболеваниями толстой кишки // Рос. журн. гастроэнтеролог., гепатолог., коло-проктолог. 2010. № 5. С. 75-79.
11. Hang U., Hundi S., Brenner H. Sensitivity and specificity of fecal, tumor M2-pyruvate kinase for detection of colorectal adenomas in a large screening study // Br. J. Carcer. 2008. V. 99. № 1. P. 133-135.
12. Hardt P.D., Mazurek S., Toepler M. et al. Faecal tumour M2-pyruvate kinase: a new sensitive screening tool for colorectal cancer // Brit. J. Cancer. 2004. V. 91. P. 980-984.
13. Levi Z., Rozen P., Hazazi R. et al. A quantitative immunochemical fecal occult blood test for colorectal neoplasia // Ann. Intern. Med. 2007. V. 20. P. 244-255.
14. Земляной В.П., Трофимова Т.Н., Нипомнящая С.Л., Дементьева Т.В. Современные методы диагностики и оценки степени распространенности рака ободочной и прямой кишки // Практическая онкология. 2005. Т. 6. № 2. С. 71-80.
15. Karl J., Wild N., Tacke M. et al. Improved diagnosis of colorectal cancer using a combination of fecal occult blood and novel fecal protein marcers // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2008. V. 6 (10). P. 11221128.
16. Старостина М.А., Афанасьева З.А, Зинкевич О.Д., Сафина Н.А. Информативность методов скрининга у больных раком толстого кишечника // Казанский медицинский журнал. 2011. Т. 92. № 1. С. 20-21.
Поступила в редакцию 16 августа 2013 г.
Ognerubov N.A., Milovanov V.V., Ivannikov A.A., Yezho-va E.N. STUDY OF LEVEL OF FECAL PYRUVATE KINA-SEOF TYPE M2 AT CERTAIN MALIGNANCIES
The results of the determination in the stool concentration of tumor M2 of pyruvate kinase in certain malignant neoplasms in 42 patients are given. On average, the level of the control group it was 2.18 U./ML, and for colorectal cancer - 6.97 U./ML, and the differences were statistically significant.
Key words: tumor M2-pyruvate kinase; malignant neoplasms; caprological test.
2866
