CC BY
14УДК 612.43+612.884
ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ОТДЕЛАХ МОЗГА КРЫС ПРИ ПРОТИВОБОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ ПРЕПАРАТОМ KB-R7943 В УСЛОВИЯХ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ
DOI
Бородин М. А.12, Дашиева В. Ж.1, Сухов И. Б.12, Шестакова Н. Н.1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской академии наук (ИЭФБ РАН)
2 ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России e-mail: [email protected]
Аннотация: Данная работа посвящена исследованию эффектов применения селективного блокатора натрий-кальциевого обменника KB-R7943 как противоболевого препарата у крыс с вызванным стрептозото-цином сахарным диабетом 1-го типа (СД1) и нейропатией. Был проведен анализ уровней экспрессии генов белков, задействованных в патогенезе диабетической нейропатией, включая ионные каналы: SCN9A (канал VGSC Nav1.7), CACNA1H (а1 субъединица канала VGCCs Т-типа), CACNA2D1 (а25-1 субъединица канала VGCCs Т-типа) и белков, регулирующих апоп-тоз: Bcl-2 и Вах — в тканях гипоталамуса и гиппокампа после 1-недельно-го введения KB-R7943. Было обнаружено, что введение KB-R7943 привело к увеличению экспрессии CACNA2D1 и её снижению для SCN9A в гиппо-кампе у крыс с СД1, в то же время в контрольной группе уровень мРНК Nav1.7 повысился под влиянием препарата. Экспрессия и Bax, и Bcl-2 была увеличена в гиппокампе у контрольных животных после введения KB-R7943. В диабетической группе в гипоталамусе терапия KB-R7943 снижала уровень мРНК Вс1-2, оставляя прежним уровень экспрессии Bах.
Ключевые слова: крыса, диабет, нейропатия, KB-R7943, экспрессия генов
Данная работа посвящена исследованию эффектов применения селективного блокатора натрий-кальциевого обменника KB-R7943 как противоболевого препарата у крыс с вызванным стрептозотоцином сахарным диабетом 1-го типа и диабетической
нейропатией, которая может быть связана с гиперактивацией глу-таматергической передачи, и в частости зависеть от активации рецепторов N-метил-Э-аспартата (NMDAR). На мембране нейронов белки NMDAR и натрий-кальциевый обменник (NCX) функционально взаимосвязаны: ингибирование NCX усиливает десенси-тизацию NMDAR и ограничивает вход кальция через NMDAR [1, 2]. В связи с этим применение селективного ингибитора NCX KB-R7943 может быть перспективным подходом в поиске адекватной противоболевой терапии.
Для исследования влияния перорального введения KB-R7943 были выбраны гены, кодирующие белки ионных каналов, участвующих в патогенезе диабетической нейропатии (SCN9A (VGSC Nav1.7), CACNA1H (а1 субъединица VGCCs Т-типа), CACNA2D1 (a2S-1 субъединица VGCCs Т-типа), и белки, регулирующие апоп-тоз (Bcl-2 и Вах). Исследования проводились на самцах крыс линии Wistar, которые были разделены на группы контроля C, диабета D, контроля с введением препарата C+KBR и диабета с введением препарата D+KBR. Введение KB-R7943 производилось в течение 1 недели. Оценка уровня экспрессии генов проводилась в образцах тканей гипоталамуса и гиппокампа с помощью ПЦР в реальном времени (амплификатор 7500 Real-Time PCR System (LifeTechnologies, ThermoFisherScientificlnc., USA). Сахарный диабет 1-го типа индуцирован внутрибрюшинным введением стрептозотоцина.
Анализ уровней экспрессии исследуемых генов в гипоталамусе выявил достоверное изменение только для гена Bax: уровень его экспрессии статистически значимо уменьшился в группе D+KBR по сравнению с D (р = 0.038) (Рисунок 1). Кроме того, было обнаружено ожидаемое уменьшение уровня экспрессии Bcl-2 в группе диабетических животных по сравнению с контролем (р = 0.026) (Рисунок 1).
Оценка экспрессии исследуемых генов в гиппокампе показала значительное увеличение уровня экспрессии гена CACNA2D1, кодирующего а2б-1-субъединицу потенциал-зависимых кальциевых каналов, у диабетических животных, получавших KB-R7943 в течение 1 недели, по сравнению с группой диабетических животных, получавших плацебо в течение такого же срока (р = 0.021) (Рисунок 2). Анализ результатов кПЦР для гена SCN9A, кодирующего потенциал-зависимый натриевый канал Nav1.7, обнаружил увеличение экспрессии у группы C+KBR (р = 0.041), а также у диабетической группы (р = 0.021) в сравнении с контролем. У группы D+KBR было
зафиксировано достоверное снижение экспрессии 8СЫ9Л по сравнению с группой Э (р = 0.008) (Рисунок 2).
Рис. 1. Уровень экспрессии мРНК генов, кодирующих белки, участвующие в сигнальной трансдукции при диабетической нейропатии и апоптозе, в гипоталамусе крыс в сравнении с этим показателем у контрольных животных. Значения RQ рассчитаны по отношению к контрольной группе. Уровень экспрессии мРНК генов нормирован по Rn18S (рРНК 18S-субъединицы) в гипоталамусе крыс по данным ПЦР в реальном времени. Данные представлены как M ± SEM. Различия между группами C и C+KBR (*), между группами D и D+KBR (#), а также между группами С и D (&) достоверны при p < 0.05
Полученные результаты объясняются тем, что при повреждении, вызванном СД1, повышается экспрессия генов и, как следствие, усиливается активность потенциал-зависимых натриевых каналов Ыау1.7 [3]. Однако, в случае потенциал-зависимых кальциевых каналов не наблюдался ожидаемый результат: при диабетической нейропатии экспрессия генов не менялась [3], а КБ-К7943 вызывал 2-х кратное увеличение экспрессии СЛСМЛ2Э1. Таким образом, выявленные изменения в экспрессии ионных каналов показывают, что влияние КБ-И7943 на распространение болевого сигнала и гипервозбудимости нейронов отделов головного мозга, участвующих в обработке болевой информации, является неоднозначным, поскольку повышенная экспрессия а2б-1 субъединицы УОССз Т-типа и увеличение активности Ыау1.7 ассоциированы с развитием болевой гиперчувствительности при диабетической неройпатии.
Уровень экспрессии генов Bax и Bd-2 увеличился в группе C+KBR в сравнении с контрольной группой ф=0,0007 и p=0,004 соответственно). В группе D+KBR наблюдалось снижение экспрессии Bcl-2 относительно D (р = 0,0004). Кроме того, уровень экспрессии Bcl-2 увеличился в группе диабетических животных по сравнению с контролем (р = 0,0007) (Рисунок 2).
Рис. 2. Уровень экспрессии мРНК генов, кодирующих белки, участвующие в сигнальной трансдукции при диабетической нейропатии и апоптозе, в гиппокампе крыс в сравнении с этим показателем у контрольных животных. Значения RQ рассчитаны по отношению к контрольной группе. Уровень экспрессии мРНК генов нормирован по Rn18S (рРНК 18S-субъединицы) в гиппокампе крыс по данным ПЦР в реальном времени.
Данные представлены как M ± SEM. Различия между группами C и C+KBR (*), между группами D и D+KBR (#), а также между группами С и D (&) достоверны прир < 0.05.
Обнаруженные повышение уровня экспрессии Вах и его понижение для Bcl-2 в отделах мозга у крыс с СД1 согласуются с литературными данными [4].
Таким образом, в данном исследовании было показано, что введение KB-R7943 привело к увеличению экспрессии CACNA2D1 и её снижению для SCN9A в гиппокампе у крыс с СД1, в то же время в контрольной группе уровень мРНК Nav1.7 повысился под влиянием препарата. Экспрессия и Bax, и Bcl-2 была увеличена в гиппо-кампе у контрольных животных после введения KB-R7943. В диабетической группе в гипоталамусе терапия KB-R7943 снижала уровень мРНК Вс1-2, оставляя прежним уровень экспрессии Bах.
Работа выполнена в рамках государственного задания № 075— 0152—22—00 при поддержке гранта РФФИ № 20—515—18008
Список литературы:
1. Sibarov D. A., Abushik P. A., Poguzhelskaya E. E., Bolshakov K. V., An-tonov S. M. Inhibition of plasma membrane Na/Ca-exchanger by KB-R7943 or lithium reveals its role in Ca-dependent N-methyl-D-aspar-tate receptor inactivation//Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. — 2015. — V. 355. — N. 3. — PP. 484—495.
2. Sukhov I. B., Dashieva VZh., Chistyakova O. V, Spasova A. P., Ivanova N., Gateva P. A., Shestakova N. N. Study of the selective blocker of sodium-calcium exchanger KBR7943 as an analgesic drug in rats with induced type 1 diabetes mellitus//RUSNEUROCHEM 2022: Всероссий скаясмеждународнымучастиемконференцияРоссийскогонейрох имическогообщества, г. Санкт-Петербург (22—24 мая 2022 г.). — Тезисы докладов. — СПб.: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. СеченоваРАН, 2022. с. 157—158.
3. Alles S. R. A., Smith P. A. Peripheral Voltage-Gated Cation Channels in Neuropathic Pain and Their Potential as Therapeutic Targets// Frontiers in Pain Research. — 2021. — P. 106.
4. Soleymaninejad M., Joursaraei S. G., Feizi F., Jafari Anarkooli I. The Effects of Lycopene and Insulin on Histological Changes and the Expression Level of Bcl-2 Family Genes in the Hippocampus of Strepto-zotocin-Induced Diabetic Rats. J Diabetes Res. 2017; 2017:4650939.
STUDY OF THE LEVEL OF GENE EXPRESSION IN RAT BRAIN DURING PAIN THERAPY WITH KB-R7943 IN THE CONDITIONS OF DIABETIC NEUROPATHY
Borodin M. A.12, Dashieva V.Zh.Sukhov I. B.12, Shestakova N. N.1
1 Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences, St.-Petersburg, Russia
2 Almazov National Medical Research Centre, St.-Petersburg, Russia
Abstract: This work is devoted to the investigation of the side effects of the selective sodium-calcium exchanger blocker KB-R7943 as an anti-pain drug in
rats with streptozotocin-induced type 1 diabetes mellitus (DM1). We analyzed the levels of gene expression of proteins involved in the pathogenesis of diabetic neuropathy, including ion channels: SCN9A (VGSC Nav1.7), CACNA1H (al subunit of T-type VGCCs), CACNA2D1 (a25-1 subunit of T-type VGCCs) and proteins, regulating apoptosis: Bcl-2 and Bax — in the tissues of the hypothalamus and hippocampus after 1-week administration of KB-R7943. It was found that the administration of KB-R7943 led to an increase in CACNA2D1 expression and its decrease for SCN9A in the hippocampus of rats with DM1, while in the control group the level of Nav1.7 mRNA increased under the influence of the drug. The expression of both Bax and Bcl-2 was increased in the hippocampus of control animals after administration of KB-R7943. In the diabetic group in the hypothalamus, KB-R7943 therapy reduced the level of Bcl-2 mRNA, leaving the level of Bax expression unchanged.
Keywords: rat, diabetes, neuropathy, KB-R7943, gene expression
