Научная статья на тему 'ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ'

ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
66
17
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК / ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ / МОРФОЛОГИЧЕСКИ НЕИЗМЕНЕННАЯ ТКАНЬ / ПОЛИП ТОЛСТОЙ КИШКИ / МАРКЕРЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ / COLORECTAL CANCER / GENE EXPRESSION / MORPHOLOGICALLY UNCHANGED TISSUE / COLON POLYP / PROLIFERATION MARKER

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Кулинич Т.М., Захаренко М.В., Джикия Е.Л., Сенчукова А.Л., Станоевич У.С.

Введение. Поиск молекулярных маркеров диагностики заболеваний толстой кишки, способных с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять и дифференцировать патологический процесс, является актуальной клинически важной задачей. Уровень экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации, может отражать картину изменений в тканях пораженного органа. Цель исследования - сравнительный анализ молекулярно-генетических маркеров пролиферативной активности при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки. Материалы и методы. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени проведен анализ изменений экспрессии маркеров пролиферации (CCND1, с-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) в следующих тканях: аденокарциномы толстой кишки (n = 259), края резекции (около 15-20 см от опухолевого узла) (n = 251), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки здоровых доноров (n = 247), полипов (n = 28), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки при полипах (10-15 см от полипа) (n = 75). Результаты и заключение. Установлено, что в тканях полипов толстой кишки наблюдаются достоверные различия в уровне экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации (с-MYC, CCND1, TERT). Выявленные различия специфичны для типа патологического процесса, что позволяет рассматривать данные гены в качестве наиболее перспективных кандидатов при разработке дифференциального метода диагностики заболеваний толстой кишки.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Кулинич Т.М., Захаренко М.В., Джикия Е.Л., Сенчукова А.Л., Станоевич У.С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

INVESTIGATION OF THE EXPRESSION LEVEL OF GENES-MARKERS OF PROLIFERATIVE ACTIVITY IN THE MUCOSA AT NORMAL AND VARIOUS PATHOLOGIES OF THE COLON

Background. The search for molecular markers of colon diseases allowing highly specific and sensitive identification and differentiation of pathological processes is a clinically important problem. Expression levels of genes responsible for proliferation can reflect the changes in the affected tissues. The study objective is to perform comparative analysis of molecular and genetic markers of proliferative activity in benign and malignant neoplasms of the colon. Materials and methods. Analysis of the changes in proliferation markers (CCND1, с-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) in adenocarcinoma of the colon (n = 259), resection margin (about 15-20 cm from the tumor lesion) (n = 251), unchanged colon mucosa from healthy donors (n = 247), polyps (n = 28), unchanged colon mucosa intestinal polyposis (10-15 cm from the polyp) (n = 75) was performed using RT-PCR. Results and conclusion. It was shown that morphologically unchanged tissue of intestinal mucosa in malignant tumors has significant differences from normal tissue of healthy donors. Significant differences in the level of expression of genes responsible for the processes of proliferation, с-MYC, CCND1, TERT were found in benign hyperproliferative diseases (polyps). Moreover, these changes were specific to the type of pathological process, which allows us to consider these genes as the most promising candidates in the development of a differential method for diagnosing colon diseases.

Текст научной работы на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ»

Исследование уровня экспрессии генов-маркеров «

пролиферативной активности в слизистой оболочке толстой кишки при различной патологии

Т.М. Кулинич, М.В. Захаренко, Е.Л. Джикия, А.Л. Сенчукова, У.С. Станоевич, И.Б. Грунин, Н.В. Мельникова, С.В. Гончаров, Т.В. Крашихина, Е.А. Кудинова, О.П. Близнюков, В.К. Боженко

ФГБУ«Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Профсоюзная, 86 Контакты: Маргарита Владимировна Захаренко zak-margarita@mail.ru

Введение. Поиск молекулярных маркеров диагностики заболеваний толстой кишки, способных с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять и дифференцировать патологический процесс, является актуальной клинически важной задачей. Уровень экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации, может отражать картину изменений в тканях пораженного органа.

Цель исследования — сравнительный анализ молекулярно-генетических маркеров пролиферативной активности при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки.

Материалы и методы. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени проведен анализ изменений экспрессии маркеров пролиферации (CCND1, с-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) в следующих тканях: аденокарциномы толстой кишки (n = 259), края резекции (около 15—20 см от опухолевого узла) (n = 251), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки здоровых доноров (n = 247), полипов (n = 28), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки при полипах (10—15 см от полипа) (n = 75). Результаты и заключение. Установлено, что в тканях полипов толстой кишки наблюдаются достоверные различия в уровне экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации (с-MYC, CCND1, TERT). Выявленные различия специфичны для типа патологического процесса, что позволяет рассматривать данные гены в качестве наиболее перспективных кандидатов при разработке дифференциального метода диагностики заболеваний толстой кишки.

Ключевые слова: колоректальный рак, экспрессия генов, морфологически неизмененная ткань, полип толстой кишки, маркеры пролиферации

Для цитирования: Кулинич Т.М., Захаренко М.В., Джикия Е.Л. и др. Исследование уровня экспрессии генов-маркеров пролиферативной активности в слизистой оболочке толстой кишки при различной патологии. Успехи молекулярной онкологии 2020;7(2): 39-46.

cv

CV

us

и ш U

X ш

и

DOI: 10.17650/2313-805X-2020-7-2-39-46 (ф

Investigation of the expression level of genes-markers of proliferative activity in the mucosa at normal and various pathologies of the colon

T.M. Kulinich, M. V. Zakharenko, E.L. Dzhikiya, A.L. Senchukova, U.S. Stanoevich, I.B. Grunin, N. V. Melnikova, S. V. Goncharov, T. V. Krashikhina, E.A. Kudinova, O.P. Bliznyukov, V.K. Bozhenko

Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Ministry of Health of Russia; 86Profsoyuznaya St., Moscow 117997, Russia

Background. The search for molecular markers of colon diseases allowing highly specific and sensitive identification and differentiation of pathological processes is a clinically important problem. Expression levels of genes responsible for proliferation can reflect the changes in the affected tissues.

The study objective is to perform comparative analysis of molecular and genetic markers of proliferative activity in benign and malignant neoplasms of the colon.

Materials and methods. Analysis of the changes in proliferation markers (CCND1, c-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) in adenocarcinoma of the colon (n = 259), resection margin (about 15—20 cm from the tumor lesion) (n = 251), unchanged colon mucosa from healthy donors (n = 247), polyps (n = 28), unchanged colon mucosa intestinal polyposis (10—15 cm from the polyp) (n = 75) was performed using RT-PCR. Results and conclusion. It was shown that morphologically unchanged tissue of intestinal mucosa in malignant tumors has significant differences from normal tissue of healthy donors. Significant differences in the level of expression of genes responsible for the processes of proliferation, c-MYC, CCND1, TERT were found in benign hyperproliferative diseases (polyps). Moreover, these changes were specific to the type of pathological process, which allows us to consider these genes as the most promising candidates in the development of a differential method for diagnosing colon diseases.

Key words: colorectal cancer, gene expression, morphologically unchanged tissue, colon polyp, proliferation marker

CV а CV

CV

us

For citation: Kulinich T.M., Zakharenko M.V., Dzhikiya E.L. et al. Investigation of the expression level of genes-markers of proliferative activity in the mucosa at normal and various pathologies of the colon. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2020;7(2):39—46. (In Russ.).

и

Ш

u

X ш

и

Введение

Ранняя диагностика и скрининг онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта являются чрезвычайно актуальной проблемой. По статистике заболеваемости населения России колоректальный рак (КРР) занимает 3-е место. При этом за последние 10 лет заболеваемость выросла на 24 % [1]. Несмотря на различные программы скрининга, выявляемость КРР на ранних стадиях составляет менее 40 %, что снижает показатели 5-летней выживаемости до 10 % [2]. Внедрение молекулярно-генетических методов исследований в клиническую онкологию позволило решить ряд вопросов этиологии и патогенеза КРР, однако проблема ранней диагностики данного заболевания остается нерешенной. Это делает необходимым поиск новых подходов к ранней диагностике КРР.

Высокую вероятность развития КРР имеют пациенты, страдающие воспалительными заболеваниями толстой кишки (прежде всего неспецифическим язвенным колитом), с семейной предрасположенностью к данной форме рака и/или имеющие полипы толстой кишки. Частота случаев развития рака из ворсинчатых аденом (полипов) диаметром >2 см составляет 35—53 %. При полипах диаметром >3 см вероятность их малиг-низации приближается к 100 % [3]. Оценка вероятности малигнизации аденоматозных полипов толстой кишки в настоящее время проводится на основании их размеров, количества и патологических характеристик. Однако в ряде исследований показано, что молекулярные характеристики полипов могут предоставить информацию о канцерогенном риске прогрессии полипа [4, 5].

Поиск новых маркеров ранней диагностики рака толстой кишки, способных выявлять заболевание с высокой чувствительностью и специфичностью и дифференцировать патологический процесс, является актуальной задачей. Наиболее перспективным представляется использование комплексов/панелей патогенетически значимых молекулярных маркеров, которые смогут повысить точность дифференциальной диагностики заболеваний толстой кишки, определят факторы риска прогрессирования, а также позволят сформировать новые программы скрининга пациентов.

Цель исследования — проведение сравнительного анализа молекулярно-генетических маркеров проли-феративной активности при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки.

Материалы и методы

Исследование одобрено этическим комитетом Российского научного центра рентгенорадиологии. Все лица, включенные в исследование, подписали

информированное добровольное согласие. Проведен анализ образцов послеоперационного материала 215 пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом КРР, проходивших обследование и лечение в Российском научном центре рентгенорадиологии в период с 2011 по 2018 г. Образцы ткани аденокарци-номы (n = 259) и морфологически неизмененной ткани (МНТ) края резекции (n = 215) получены в результате оперативного лечения больных первичным раком толстой кишки стадии I—IVB. По гистологическому типу все образцы опухоли представляли аденокарци-ному (G1-3) и были объединены в группу «опухоль». Высокодифференцированные аденокарциномы выявлены в 48 % случаев, умеренно-дифференцированные — в 45 %, низкодифференцированные — в 7 %. Образцы МНТ края резекции отбирали из зоны на расстоянии 15—20 см от опухолевого узла, при гистологическом исследовании определено отсутствие признаков инвазивного роста.

Во время диагностической колоноскопии пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом полипов толстой кишки получены образцы тканей полипов и МНТ полипа, взятой на расстоянии не менее 10 см от полипа. Образцы полипов были объединены в группу «полип» (n = 28). По данным гистологического исследования тубулярные аденомы диагностированы у 18, тубулярно-ворсинчатые — у 4, гиперпластические полипы — у 6 пациентов. Однако ввиду малого размера данной группы при анализе результатов не проводилось деления относительно гистологического типа при оценке полученных результатов как характеристики доброкачественного гиперпроли-феративного процесса. Образцы МНТ вошли в группу «МНТ полипа» (n = 78). Контрольную группу «норма» составили образцы, полученные в ходе профилактической колоноскопии у добровольцев без патологии в толстой кишке (n = 247). Для всех образцов выполнено гистологическое исследование и получено заключение: «морфологически неизмененная слизистая оболочка толстой кишки». Средний возраст пациентов группы «опухоль» составил 64,5 года, группы «полип» — 62,6 года, группы «норма» — 55,5 года.

Образцы биологического материала после получения немедленно помещали в стабилизирующий раствор (EverFresh RNA, Sileks, Россия) для сохранности нуклеиновых кислот и хранили при температуре —70 °С. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для постановки двухступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией использовали ген-специфические прайме-ры, наборы реагентов, протоколы и оборудование

ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Реакционную смесь инкубировали при температуре 40 °С в течение 30 мин с последующей инактивацией обратной транс-криптазы при 95 °С в течение 5 мин. Полученную комплементарную ДНК сразу использовали для постановки ПЦР в реальном времени. ПЦР-анализ выполняли в 2 повторах, каждый объемом 12 мкл, по следующей программе: 15 циклов — при 80°С 5 с, при 94 °С 5 с; 1 цикл — при 94 °С 5 мин; 50 циклов — при 94 °С 10 с, при 64 °С 20 с.

Определен уровень экспрессии генов, контролирующих процессы пролиферации: CCND1 (циклин D1), с-MYC, Ki-67, TERT, HER2neu. Уровень экспрессии матричной РНК (мРНК) для каждого гена определяли в относительных единицах согласно методике, предложенной J. Vandesompele и соавт. в 2002 г. [6]. Мы посчитали наиболее целесообразным использовать нормировку на несколько генов для нивелирования их возможных колебаний. В качестве референсных использовали гены GUSB, B2M и HPRT. Выбор эталонных генов был сделан на основании результатов ряда исследований [7—9]. Статистический анализ проводили в программе Statistica 10 (StatSoft, США) с применением методов однофакторного дисперсионного анализа. Различия считали статистически достоверными прир <0,05.

Результаты

Молекулярно-биологические особенности взаимоотношений доброкачественных гиперпролифера-тивных заболеваний и неизмененных окружающих тканей недостаточно изучены [10, 11]. В то же время актуальными являются проблема дифференциальной диагностики заболеваний толстой кишки и изучение вероятности малигнизации доброкачественных опухолей [3, 12]. В результате проведенного исследования изменений экспрессии генов с-MYC, CCND1, Ki-67, TERT, HER2neu в группах «МНТ края резекции», «опухоль», «полип», «МНТ полипа» и «норма» выявлены их фенотипические особенности.

Уровень экспрессии гена Ki-67 — стандартного маркера пролиферативной активности — был достаточно высоким для всех исследуемых типов тканей (рис. 1). Достоверно выше уровень экспрессии Ki-67 был в тканях аденокарцином, что позволило дифференцировать ткань неизмененного эпителия толстой кишки и материал злокачественной опухоли (см. таблицу). Выявленные особенности хорошо согласуются с широко известными данными об усилении экспрессии Ki-67 в тканях опухоли и использовании данного гена при иммуногистохимическом анализе оценки пролиферации и степени злокачественности опухоли [13, 14]. При полипозе толстой кишки достоверные различия наблюдались для групп «полип» / «норма» и отсутствовали при сравнении групп «полип»/«МНТ полипа» и «МНТ полипа»/«норма». Группа «МНТ полипа» характеризовалась большим разбросом

значений и отсутствием достоверных различий в уровне экспрессии Ki-67 от групп «норма» и «полип», причем наблюдались как незначительные различия средних уровней экспрессии Ki-67 в группах «полип» и «МНТ полипа», так и большой разброс значений внутри данных групп.

Отсутствие различий экспрессии Ki-67 при сравнении групп «МНТ полипа» / «норма» определяет ограничения применения данного молекулярного маркера при доброкачественных заболеваниях толстой кишки.

Регуляторная функция с-MYC в отношении CCND1 и их взаимосвязь [15] определили схожий характер изменений данных генов в исследуемых тканях (см. рис. 1). Показано, что наибольший уровень экспрессии с-MYC и CCND1 определяется в тканях аденокарциномы как показатель высокой пролиферативной активности. Экспрессия снижается в ряду опухоль—МНТ края резекции—норма, причем изменения экспрессии генов с-MYC и CCND1 достоверны для этих 3 типов ткани (см. таблицу). В тканях полипов толстой кишки также отмечены высокие уровни экспрессии с-MYC и CCND1, достоверно отличающиеся как от уровней в слизистой оболочке толстой кишки здоровых доноров, так и от значений в тканях опухолей и МНТ полипа. Оценка уровней экспрессии генов с-MYC и CCND1, характеризующих пролиферативную активность ткани, может

Невзвешенные средние значения / Unweighted means Лямбда Уилкса / Wilks' lambda 0,46153; F (12, 2254,5) = 63,771; p = 0,0000 Декомпозиция гипотезы /Hypothesis decomposition Вертикальные столбцы обозначают ± стандартные ошибки / Vertical columns represent ± standard error

с 10,0 io

К 9,5 er

& 9,0 e

1 8,5

■1 8,0 ее

i 7,5

сси 7,0 е

пре 6,5

с

IS 6,0

я

на 5,5 ь

лте 5,5

I 4.5 нт 4,0

у А

у

•V

А

/

/

-✓ у

/ S- с-MYC

s- CCND1

-S- Ki-67

Норма/ Norm Полип/ Polyp Опухоль / Tumor МНТ полипа / МНТ края резекции / Polyp MUT Resection margin MUT

Рис. 1. Изменение экспрессии генов Ki-67, с-MYC и CCND1 в тканях опухолей, морфологически неизмененных тканях (МНТ) края резекции при колоректальном раке, полипах, неизмененной слизистой оболочке при полипозе и нормальной слизистой оболочке толстой кишки условно здоровых доноров

Fig. 1. Changes in expression of Ki-67, с-MYC and CCND1 genes in tumor tissues, morphologically unchanged tissues (MUT) of the resection margin in colorectal cancer, intestinal polyposis, unchanged mucosa in polyposis and normal mucosa in healthy donors

cv a cv

cv

us

и

Ш

u

X ш

и

CV а CV

CV

us

Достоверность различий экспрессии исследованных генов при парном сравнении групп тканей Significance of differences in expression of the studied genes in pairwise comparison of tissue groups

И Ш

u

X ш

и

*Достоверные различия (р <0,05).

Примечание. МНТ — морфологически неизмененная ткань.

*Significant differences (р <0.05).

Note. MUT — morphologically unchanged tissue.

ТИп ткани Tissue type с-MYC CCND1 TERT Ki-67 HER2new

Опухоль G1/Опухоль G2 Tumor G1/Tumor G2 0,440 0,743 0,003* 0,996 0,896

Опухоль G1/Опухоль G3 Tumor G1/Tumor G3 0,273 0,542 0,031* 0,088 0,011*

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Опухоль G2/Опухоль G3 Tumor G2/Tumor G3 0,250 0,468 0,563 0,098 0,044*

Опухоль G1 3/край резекции Tumor Gj y/resection margin 0,000* 0,000* 0,000* 0,000* 0,000*

Опухоль G1 3/норма Tumor Gj y/norm 0,000* 0,000* 0,000* 0,000* 0,000*

Край резекции/норма Resection margin/norm 0,000* 0,000* 0,000* 0,001* 0,174

Опухоль G1 3/полип Tumor Gj /polyp 0,000* 0,001* 0,000* 0,019* 0,040*

Опухоль G1 3/МНТ полипа Tumor Gj /polyp MUT 0,000* 0,000* 0,875 0,000* 0,000*

Полип/МНТ полипа Polyp/polyp MUT 0,000* 0,001* 0,000* 0,073 0,028*

Полип/норма Polyp/norm 0,000* 0,000* 0,000* 0,001* 0,140

МНТ полипа/норма Polyp MUT/norm 0,000* 0,017* 0,000* 0,361 0,011*

МНТ полипа/край резекции Polyp MUT/resection margin 0,002* 0,015* 0,372 0,023* 0,017*

служить маркером типа патологического процесса и использоваться в дифференциальной диагностике патологических изменений толстой кишки.

Изменения экспрессии генов с-MYC и CCND1 специфичны для всех исследуемых типов тканей и позволяют достоверно отличить не только ткани злокачественных и доброкачественных новообразований, но и МНТ слизистой оболочки толстой кишки. Также важно отметить, что для всех исследуемых генов получены достоверные различия между группами «МНТ полипа» и «МНТ края резекции», таким образом, МНТ толстой кишки демонстрируют специфические изменения в зависимости от типа патологического процесса.

Изменения экспрессии гена HER2neu характеризовались снижением уровня экспрессии в группах «опухоль» и «МНТ края резекции». В группах «полип»/ «норма» и «МНТ край резекции»/«норма» при парном сравнении достоверных различий не отмечено. Вероятно, изменения экспрессии гена HER2neu происходят непосредственно в тканях опухолевого узла при КРР и не распространяются на прилежащие ткани кишки.

При проведении сравнительного анализа изменений экспрессии исследуемых генов внутри группы «опухоль» в зависимости от степени злокачественности аденокарциномы показано наличие достоверных различий только по уровню экспрессии HER2neu (см. таблицу, рис. 2). Уровень экспрессии достоверно различался в подгруппах опухолей Gt /G3 и G2 /G3, максимально снижаясь в подгруппе опухолей G3 (см. рис. 2).

Продукт гена TERT (обратной транскриптазы, основные функции которой — удлинение и стабилизация теломер), также вызывает усиление пролиферации клеток и повышение их жизнеспособности, участвует в регуляции экспрессии некоторых генов, ответа на повреждение ДНК [16]. Результаты исследования гена TERT показали достоверное снижение уровня его экспрессии в тканях при гиперпролиферативных заболеваниях толстой кишки, причем наиболее резкое снижение отмечено в тканях полипа (см. рис. 2). Полученный результат можно объяснить высокой активностью TERT в слизистой оболочке толстой кишки

Норма / Norm

43- Среднее значение / Mean

G3 Норма / Norm G1 G2

Среднее значение ± стандартные ошибки / Mean ± standard error

Рис. 2. Изменение среднего значения экспрессии гена HER2neu (а) и гена TERT (б) в группах «норма» и «опухоль» в зависимости от степени злокачественности G (Grade)

Fig. 2. Changes in mean expression of HER2neu (а) and TERT (б) genes in the "norm" and "cancer" groups, depending on the grade of malignancy G (Grade)

в норме в связи с высокой функционально-обусловленной пролиферативной активностью клеток и включением так называемых дисрегуляторных механизмов при злокачественных опухолях [17]. Достоверные различия получены между всеми группами, кроме групп «опухоль»/«МНТ края резекции», «опухоль»/«МНТ полипа», «МНТ полипа»/«МНТ края резекции» (см. таблицу). При анализе уровней экспрессии TERT в тканях полипа обнаружена большая гетерогенность. В литературе имеются единичные работы, также выделяющие большой разброс уровня TERT при доброкачественных заболеваниях толстой кишки и связывающие его с вероятностью озлокачествления процесса [18]. В нашем исследовании показано, что уровень экспрессии TERT возрастал в ряду норма—МНТ края резекции—опухоль. При сравнении образцов внутри группы «опухоль» уровень экспрессии TERTдостоверно различался в подгруппах опухолей Gt/G3 и Gt/G2, максимально возрастая в подгруппе опухолей G3 (см. рис. 2).

Обсуждение

Пролиферативная активность — одна из основных морфологических характеристик опухолевого процесса. В настоящее время наибольшую диагностическую значимость имеют иммуногистохимические маркеры пролиферации и апоптоза р53, HER2neu и Ki-67 [19]. Определение уровней HER2neu и Ki-67 в биопсийном и операционном материале при КРР позволяет оценить степень пролиферативной активности опухоли и является одним из определяющих факторов при выборе тактики лечения, в том числе назначения химиотерапии. При полипозе кишечника исследование молекулярно-генетических маркеров не столь распространено и не носит обязательного характера, однако высокий уровень перерождения полипов дик-

тует поиск критериев, определяющих прогноз и тактику ведения пациентов с полипозом и позволяющих оценивать риск развития КРР (озлокачествления полипов).

Так, в работе Р.М. Смоляковой и соавт. продемонстрировано, что уровень Ki-67 в ткани полипа толстой кишки может быть прогностическим фактором, определяющим вероятность малигнизации [20]. Результаты исследования О.А. Харловой и соавт. показали ряд молекулярных отличий внутри группы зубчатых образований толстой кишки, которые могут являться факторами канцерогенного риска, а также молекулярными маркерами, позволяющими с высокой точностью проводить дифференциальную диагностику образований толстой кишки [21].

Определение уровня экспрессии с-MYC и CCND1 не является «стандартным» тестом при диагностике патологий толстой кишки, однако данные гены играют фундаментальную роль в регуляции пролиферации и количества клеток крипты слизистой оболочки толстой кишки. Ген с-MYC участвует в различных аспектах пролиферации, инвазии и контроля апоптоза раковых клеток. Экспрессия с-MYC повышена в 70 % случаев КРР [22].

Кроме этого, с-MYC тесно связан с геном АРС (ген аденоматозного полипа) через активацию сигнального пути Wnt [23]. Важная роль гена с-MYC в «эволюции» неопластического процесса доказана в большом количестве исследований [24—27]. Показано, что уровень цитоплазматического с-MYC возрастает в ряду нормальная слизистая оболочка толстой кишки-аде-номатозный полип-опухоль [28].

Работ, посвященных анализу молекулярных изменений в МНТ пораженного опухолью органа, на сегодняшний день немного. Однако не вызывает

CV а CV

CV

us

и ш U

X ш

и

б

а

G

G

G

CV а CV

CV

us

и ш U

сомнений, что развитие гиперпролиферативного процесса сопровождается изменениями, затрагивающими не только весь пораженный орган, но и организм в целом [29, 30]. Интересные результаты в проведенном исследовании получены для экспрессии гена TERT (см. рис. 2): уровень TERT в норме выше, чем в тканях опухоли. Однако в большинстве данных литературы уровень TERT выше в опухолевых тканях, чем в норме [31, 32]. Мы объясняем эти существенные различия принципиально другим подходом в формировании контрольной группы «норма»: обычно в исследованиях в качестве нормы используют МНТ края резекции. В нашем исследовании уровень TERT в группе «МНТ края резекции» был ниже, чем в группе «опухоль». Таким образом, если бы группа «МНТ края резекции» использовалась в качестве контрольной, то результаты соответствовали данным литературы. Однако в настоящее время многими исследователями подчеркивается, что край резекции нельзя считать нормальной тканью [12, 33, 34], так как при формировании опухоли процессы канцерогенеза затрагивают весь орган, в данном случае толстую кишку. Полученные в нашей работе значения экспрессии TERT в группах «норма», «МНТ края резекции», «опухоль», во-первых, вносят дополнительную информацию об отличиях молекулярных процессов в клетке, во-вторых, подчеркивают

важность правильного выбора контрольных групп при планировании исследования.

Проведенный анализ молекулярно-генетических изменений в тканях толстой кишки показывает наличие и нарастание изменений в экспрессии генов, отвечающих за взаимодействие механизмов, регулирующих процессы клеточной пролиферации.

Заключение

Результаты проведенного исследования экспрессии генов с-MYC, ССШ1, Ш-67, HER2neu, ТЕКТпоказали, что в МНТ толстой кишки наблюдаются изменения как при возникновении злокачественных опухолей, так и при полипозе. Результаты демонстрируют, что под воздействием гиперпластического процесса изменения, возникающие в толстой кишке, затрагивают орган целиком. Установлено, что и при доброкачественных гиперпролиферативных заболеваниях (полипах) наблюдаются достоверные различия в уровне экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации. Эти изменения специфичны для типа патологического процесса, что позволяет рассматривать данные гены (молекулярно-генетические маркеры) в качестве наиболее перспективных кандидатов при разработке дифференциального метода диагностики заболеваний толстой кики

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

X ш

и

1. Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году.

Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Саринского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. С. 18. [State of oncological care in Russia in 2018. Eds.: A.D. Kaprin, V.V. Starinskiy, G.V. Petrova. Moscow: MNIOI im. P.A. Gertsena - filial FGBU "NMITS radiologii" Minzdrava Rossii, 2019. Р. 18. (In Russ.)].

2. Солодкий В.А., Чхиквадзе В.Д., Станоевич У.С. и др. Ранняя диагностика колоректального рака. Врач 2012;11:20-3. [Solodkiy V.A., Chkhi-vadze V.D., Stanoevich U.S. et al. Early diagnosis of colorectal cancer. Vrach = Doctor 2012;11:20-3. (In Russ.)].

3. Агейкина Н.В. Комбинированное эндоскопическое лечение малигнизиро-ванных полипов толстой кишки. Дис. ... канд. мед. наук. М., 2011. [Ageykina N.V. Combination endoscopic treatment of malignant colon polyps. PhD in Medicine dissertation. Moscow, 2011. (In Russ.)].

4. Juárez М., Egoavil С., Rodríguez-Soler М. et al. KRAS and BRAF somatic mutations in colonic polyps and the risk

of metachronous neoplasia. PLoS One

2017;12(9):e0184937.

DOI: 10.1371/journal.pone.0184937.

5. Xue-Qi C., Jia-Yu M., Wen-Bin L. et al. Association between CYP24A1 polymorphisms and the risk of colonic polyps and colon cancer in a Chinese population. World J Gastroenterol 2017;23(28):5179-86.

DOI: 10.3748/wjg.v23.i28.5179.

6. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 2002;3(7): research0034.

DOI: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034.

7. Dowling S.M., Walsh D., Coffey D.S., Keely P.A. The importance

of choosing the appropriate reference genes for quantitative real-time PCR, as shown using colon cancer cells and tissues. F1000 Res 2016;5:99. DOI: 10.12688 / f1000research.7656.2.

8. Krzystek-Korpacka M., Diakowska D., Bania J., Gamian A. Expression stability of common housekeeping genes is differently affected by bowel inflammation and cancer: implications for finding suitable normalizers for inflammatory

bowel disease studies. Inflamm Bowel Dis 2014;20(7):1147-56. DOI: 10.1097/MIB.0000000000000067. 9. De Kok J.B., Roelofs R.W., Giesendorf B.A. et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lablnvest 2005;85(1):154-9. DOI: 10.1038/labinvest.3700208.

10. Станоевич У.С., Захаренко М.В., Боженко В.К. и др. Роль молекулярных изменений в морфологически неизмененной слизистой оболочке толстой кишки при колоректальном раке. Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2018;2:99-99а. [Stanoevich U.S., Zakharenko M.V., Bozhenko V.K. et al. The role of molecular changes in morphologically unchanged colon mucosa in colo-rectal cancer. Gastroenterologiya Sankt-Peterburga = Saint Petersburg Gastroenterology 2018;2:99—a.

(In Russ.)].

11. Bujanda L., Cosme A., GilI. et al. Malignant colorectal polyps. World J Gastroenterol 2010;16(25):3103-11. DOI: 10.3748/wjg.v16.i25.3103.

12. Боженко В.К., Станоевич У.С., Троценко И.Д. и др. Сравнение экспрессии мРНК матриксных

металлопротеиназ в морфологически нормальной, неопластической и метастатической тканях толстого кишечника и в биоптатах здоровых доноров. Биомедицинская химия 2018;64(1):46—52. [Bozhenko V.K., Stanoevich U.S., Trotsenko I.D. et al. Comparison of matrix proteinase mRNA expression in morphologically normal, neoplastic, and metastatic colon tissue and colon biopsies from healthy donors. Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical Chemistry 2018;64(1):46-52. (In Russ.)].

13. Станоевич У.С., Боженко В.К., Захаренко М.В. и др. Роль молекуляр-но-генетических исследований в планировании неоадъювантной химиолу-чевой терапии при раке прямой кишки. Злокачественные опухоли 2016;4-S1(21):258-9. [Stanoevich U.S., Bozhenko V.K., Zakharenko M.V. et al. The role of molecular and genetic studies in planning of neoadjuvant chemora-diation therapy for rectal cancer. Zlokachestvennie opukholi = Malignant Tumors 2016;4-S1(21):258-9. (In Russ.)].

14. Reimers M.S., Zeestraten E.C.M., Kuppen P.J.K. et al. Biomarkers

in precision therapy in colorectal cancer. Gastroenterol Rep(Oxf) 2013;1(3):166—83. DOI: 10.1093/gastro/got022.

15. Chen Y., Jiang J., Zhao M. et al. MicroRNA-374a suppresses colon cancer progression by directly reducing CCND1 to inactivate the PI3K/AKT pathway. Oncotarget 2016;7(27):41306-19.

DOI: 10.18632/oncotarget.9320.

16. Gaspar T.B., Sa A., Lopes J.M. et al. Telomere maintenance mechanisms in cancer. Genes(Basel) 2018;9(5):241. DOI: 10.3390/genes9050241.

17. Cordero D., Solé X., Crous-Bou M. et al. Large differences in global transcriptional regulatory programs of normal and tumor colon cells. BMC Cancer 2014;14:708. DOI: 10.1186/1471-2407-14-708.

18. Druliner B.R., Ruan X., Johnson R. et al. Time lapse to colorectal cancer: telomere dynamics define the malignant potential of polyps. Clin Transl Gastroenterol 2016;7(9):e188. DOI: 10.1038/ctg.2016.48.

19. Belt EJ.Th, Brosens R.P.M., Delis-

van Diemen P.M. et al. Cell cycle proteins

predict recurrence in stage II

and III colon cancer. Ann Surg Oncol

2012;19 Suppl 3:S682-92.

DOI: 10.1245/s10434-012-2216-7.

20. Смолякова Р.М., Машевский А.А., Кохнюк В.Т. и др. Прогностическая значимость экспрессии маркеров опухолевой пролиферации Ki-67, P53

и BCL-2 у больных колоректальным раком и полипозом. Онкологический журнал 2008;1(5):29-39. [Smolyakova R.M., Mashevskiy A.A., Kokhnyuk V.T. et al. Prognostic significance of expression of Ki-67, P53 and BCL-2 tumor proliferation markers in patients with colorectal cancer and polyposis. Onkologicheskiy zhurnal = Oncological Journal 2008;1(5):29-39. (In Russ.)].

21. Харлова О.А., Олейникова Н.А., Мальков П.Г., Данилова Н.В. Новые подходы в классификации зубчатых образований толстой кишки. Современные проблемы науки и образования 2018;2:24. [Kharlova O.A., Oleynikova NA, Malkov P.G., Danilova N.V. New approaches to the classification of colon serrated lesions. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya = Modern Problems of Science and Education 2018;2:24.

(In Russ.)].

22. Dang C.V. MYC on the path to cancer. Cell 2012;149(1):22-35.

DOI: 10.1016/j.cell.2012.03.003.

23. Liu S., Tackmann N.R., Yang J. et al. Disruption of the RP-MDM2-p53 pathway accelerates APC loss-induced colorectal tumorigenesis. Oncogene 2017;36(10):1374-83.

DOI: 10.1038/onc.2016.301.

24. Gabay M., Li Y., Felsher D.W. MYC activation is a hallmark of cancer initiation and maintenance. Cold Spring Harb Perspect Med 2014;4(6):a014241.

DOI: 10.1101/cshperspect.a014241.

25. Cascon A., Robledo M. MAX and MYC: a heritable breakup. Cancer Res 2012;72(13):3119-24.

DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3891.

26. Wolfer A., Ramaswamy S. MYC and metastasis. Cancer Res 2011;71(6):2034—7. DOI: 10.1158/0008-5472.can-10-3776.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

27. Melnik S., Werth N., Boeuf S. et al. Impact of c-MYC expression on proliferation, differentiation, and risk of neoplastic transformation of human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther 2019;10(1):73.

DOI: 10.1186/s13287-019-1187-z .

28. Stewart J., Evan G., Watson J. et al. Detection of the c-MYC oncogene product in colonic polyps and carcinomas. Br J Cancer 1986;53(1):1—6.

29. Egeblad M., Nakasone E.S., Werb Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell 2010;18:884-901.

DOI: 10.1016/j.devcel.2010.05.012.

30. Graham K., de las Morenas A., Tripathi A. et al. Gene expression

in histologically normal epithelium from breast cancer patients and from cancer-free prophylactic mastectomy patients shares a similar profile. Br J Cancer 2010;102(8):1284-93. DOI: 10.1038/sj.bjc.6605576.

31. Ayiomamitis G.D., Notas G., Zaravinos A. et al. Differences in telomerase activity between colon and rectal cancer.

Canad J Surg 2014;57(3):199-208. DOI: 10.1503/cjs.031312.

32. Nowak J., Januszkiewicz D., Lewandowski K. et al. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003;15:75-80. DOI:10.1097/00042737-200301000-00013.

33. Aran D., Camarda R., Odegaard J. et al. Comprehensive analysis of normal adjacent to tumor transcriptomes. Nat Commun 2017;8:1077.

DOI: 10.1038/s41467-017-01027-z.

34. Sanz-Pamplona R., Berenguer A., Cordero D. Aberrant gene expression in mucosa adjacent to tumor reveals a molecular crosstalk in colon cancer. Mol Cancer 2014;13:46.

DOI: 10.1186/1476-4598-13-46.

cv a cv

cv

us

и

Ш

u

X ш

U

Вклад авторов

Т.М. Кулинич: научное редактирование текста, подготовка рукописи к публикации;

М.В. Захаренко: получение данных для анализа, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание отдельных глав рукописи;

Е.Л. Джикия: обзор публикаций по теме статьи, написание отдельных глав рукописи, формирование общего списка литературы, подготовка рукописи к публикации;

A.Л. Сенчукова: получение данных для анализа, анализ полученных данных;

У.С. Станоевич: получение данных для анализа, обзор публикаций по теме статьи, научное редактирование текста;

И.Б. Грунин, С.В. Гончаров, Т.В. Крашихина: получение данных для анализа,

Н.В. Мельникова, Е.А. Кудинова: написание отдельных глав рукописи;

О.П. Близнюков: получение данных для анализа, научное редактирование текста;

B.К. Боженко: научное редактирование текста, разработка дизайна обзора.

и

о Authors' contributions

^ T.M. Kulinich: scientific editing, manuscript preparation for publication;

CM M.V. Zakharenko: obtaining data for analysis, analysis of the obtained data, reviewing of publications of the article's theme, writing individual chapters of the manuscript;

E.L. Dzhikiya: reviewing of publications of the article's theme, writing individual chapters of the manuscript, formation of a general list of references, manuscript preparation for publication; es A.L. Senchukova: obtaining data for analysis, analysis of the obtained data;

2 U.S. Stanoevich: obtaining data for analysis, reviewing of publications of the article's theme, scientific editing; О I.B. Grunin, S.V. Goncharov, T.V. Krashikhina: obtaining data for analysis; Z N.V. Melnikova, E.A. Kudinova: writing individual chapters of the manuscript; ® О.Р. Bliznyukov: obtaining data for analysis; scientific editing;

V.K. Bozhenko: scientific editing, developing the research design.

S ORCID авторов / ORCID of authors

¡¡j Т.М. Кулинич / T.M. Kulinich: https://orcid.org/0000-0003-2331-5753 Ц М.В. Захаренко / M.V. Zakharenko: https://orcid.org/0000-0003-2480-4145 ZZ А.Л. Сенчукова / A.L. Senchukova: https://orcid.org/0000-0001-9268-3221 У.С. Станоевич / U.S. Stanoevich: https://orcid.org/0000-0002-9057-6227 Н.В. Мельникова / N.V. Melnikova: https://orcid.org/0000-0003-1193-352X й С.В. Гончаров / S.V. Goncharov: https://orcid.org/0000-0001-7914-1882 § Т.В. Крашихина / T.V. Krashikhina: https://orcid.org/0000-0001-7567-8308 g Е.А. Кудинова / E.A. Kudinova: https://orcid.org/0000-0002-5530-0591 et О.П. Близнюков / O.P. Bliznyukov: https://orcid.org/0000-0003-2401-5007 В.К. Боженко / V.K. Bozhenko: https://orcid.org/0000-0001-8351-8152

HS Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. О Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

ас Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. в Financing. The study was performed without external funding.

^ Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

О- Протокол исследования № 4 от 26.04.2019 одобрен комитетом по биомедицинской ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии»

^ Минздрава России. Председатель этического комитета Центра к.м.н. А.А. Моргунов.

Й Все участники исследования подписали информированное согласие на участие в исследовании.

ш Compliance with patient rights and principles of bioethics

0 The study protocol No 4 dated 26.04.2019 was approved by the biomedical ethics committee Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Ministry

S of Health of Russia. Chairman of the ethics committee of the Center, Ph.D. A.A. Morgunov.

S All study participants gave written informed consent to participate in the study. ш и

Статья поступила: 18.06.2020. Принята к публикации: 23.07.2020. Article submitted: 18.06.2020. Accepted for publication: 23.07.2020.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.