CC BY
22
Раздел - молекулярная медицина
Исследование уровня экспрессии гена TERT в слизистой оболочке толстой кишки при различной патологии
Боженко В.К., Захаренко М.В., Кулинич Т.М., Джикия Е.Л., Сенчукова А.Л., Станоевич У.С., Грунин И.Б., Мельникова Н.В., Крашихина Т.В., Близнюков О.П., Гончаров С.В., Кудинова Е.А.
ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, Москва 117997, ул. Профсоюзная, 86 Сведения об авторах
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: vbojenko@mail.ru Захаренко Маргарита Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: zak-margarita@mail.ru
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: sobral@mail.ru, тел.8-926-137-20-35
Джикия Екатерина Левановна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: dzhikiya.mcrr@ gmail .com
Сенчукова Анна Леонидовна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: asenchukova@gmail.com
Станоевич Углеша Спасоевич - д.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела хирургии и хирургических технологий в онкологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: 8158791@gmail.com
Грунин Игорь Борисович - к.м.н., заведующий отделением эндоскопии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: esploratore@rambler.ru
Мельникова Надежда Васильевна - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: n melnikova@list.ru
Крашихина Татьяна Валерьевна - очный аспирант ФГБУ "Российский научный центр
Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: krash Tat@gmail.com
Близнюков Олег Петрович - д.м.н., заведующий патологоанатомическим отделением
ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail:
blisnukov@mail.ru
Гончаров Сергей Владимирович - к.м.н., заведующий 3 хирургическим отделением хирургической клиники ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: 9015@mail.ru
Кудинова Елена Александровна - д.м.н., заведующая клинико-диагностической лабораторией ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, e-mail: dockudinova@mail .ru Контактное лицо
Захаренко Маргарита Владимировна, e-mail: zak-margarita@mail.ru
Резюме
Введение. По статистике злокачественных новообразований в России колоректальный рак является второй по значимости причиной смерти от онкологических заболеваний у обоих полов. Болезнь прогрессирует как многоступенчатый процесс и связана с генетическими изменениями. Одной из характерных особенностей рака является изменение в активности теломеразы обратной транскриптазы (ТЕЯТ), чаще ее активация. В данном исследовании проведено сравнение экспрессии гена ТЕЯТ в тканях аденокарциномы, аденомы и морфологически неизмененных тканях (МНТ) при гиперпролиферативной патологии в разных отделах ободочной и прямой кишки.
Цель работы: проведение сравнительного анализа изменений экспрессии маркера пролиферации - гена ТЕЯТ при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки, где в качестве референсных значений используется экспрессия в неизмененной слизистой толстой кишке здоровых доноров.
Материалы и методы. С использованием метода RT-PCR проведен анализ изменений экспрессии маркера пролиферации - гена ТЕЯТ в отделах толстой кишки. В анализ взяты образцы тканей аденокарциномы толстой кишки (п=193), МНТ края резекции (около 15 -20 см от опухолевого узла) (п=230), аденомы (п=21), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки при аденоме (в 10 - 15 см от аденомы) (п=58), визуально не измененной слизистой здоровых доноров (п=174). Ткани аденокарциномы и МНТ края резекции получены во время оперативного лечения. Ткани аденомы, МНТ при аденоме и неизмененные ткани здоровых доноров получены во время профилактической колоноскопии.
Результаты. Уровень экспрессии гена ТЕЯТ в тканях толстой кишки здоровых доноров был значительно выше, чем в неизмененных тканях толстой кишки при доброкачественной и злокачественной пролиферативной патологии. Согласно
литературным данным, в работах, где в качестве "нормы" использовали неизмененную ткань пораженного органа, уровень экспрессии TERT был ниже, чем в опухолевой ткани. Это подчеркивает важность использования в качестве контроля морфологически неизмененных тканей здоровых доноров.
Ключевые слова: колоректальный рак, экспрессия генов, морфологически неизмененная ткань, аденома толстой кишки, маркеры пролиферации
Investigation of the level of TERT gene expression in the colon mucosa in various pathologies
Bozhenko V.K., Zakharenko M.V., Kulinich T.M., Dzhikiya E.L., Senchukova A.L., Stanoevich U., Melnikova N.V., Krashikhina T.V., Kudinova E.A.
Federal State Budgetary Institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), Moscow 117997, Profsoyuznaya, 86 Authors
Bozhenko V.K. - MD, DSc, Professor, Head of the Department of Molecular Biology and Experimental Tumor Therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Zakharenko M.V. - researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Kulinich T.M. - PhD, MD, Head of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Dzhikiya E.L. - PhD, researcher of the Laboratory of Immunology, oncocytology and cell therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of
Healthcare of the Russian Federation
Senchukova A.L. - PhD, researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Stanoevich U. - MD, senior researcher of the Research Department of Surgery and Surgical Technologies of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Grunin I.B. - PhD, MD, Head of the Endoscopy Department of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Melnikova N.V. - PhD, MD, leading researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Krashikhina T.V. - PhD student of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Bliznyukov O.P. - MD, Head of the Pathology Department of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Goncharov S.V. - MD, Head of the 3rd Surgical Department of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Kudinova E.A. - MD, Head of the Clinical and Diagnostic Laboratory of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Summary
Introduction. According to the statistics of malignant neoplasms in Russia, colorectal cancer is the second leading cause of death from cancer in both sexes. The disease progresses as a multi-
stage process and is associated with genetic changes. One of the characteristic features of cancer is a change in the activity of telomerase reverse transcriptase (TERT), more often its activation. This study compared the expression of the TERT gene in adenocarcinoma, adenoma, and morphologically unchanged tissues (MUT) in different parts of the colon and rectum. Objective: to conduct a comparative analysis of changes in the expression of the proliferation marker TERT in benign and malignant neoplasms of the colon, using TERT expression in the unchanged colon mucosa of healthy donors as reference values.
Materials and methods. The RT-PCR method was used to analyze changes in the TERT expression in the colon. The analysis included tissue samples of colon adenocarcinoma (n=193), MUT of the resection edge (about 15 - 20 cm from the tumor node) (n=230), adenoma (n=21), unchanged colon mucosa in adenoma (10 - 15 cm from the adenoma) (n=58), and visually unchanged mucosa of healthy donors (n=174). Adenocarcinoma and MUT tissues of the resection edge were obtained during surgical treatment. Adenoma tissues, MUT for adenoma and unchanged tissues from healthy donors were obtained during preventive colonoscopy. Results. The level of TERT expression in the colon tissues of healthy donors was significantly higher than in unchanged colon tissues in benign and malignant proliferative diseases. According to literature data, in studies using unchanged tissue of the affected organ as the "norm", the level of TERT expression was lower than in the tumor tissue. This highlights the importance of using morphologically unchanged tissues from healthy donors as controls.
Keywords: colorectal cancer, gene expression, morphologically unchanged tissue, colon adenoma, proliferation markers
Введение
В Российской Федерации колоректальный рак (КРР) занимает 3-е место по онкологической заболеваемости населения и 2-е место по смертности среди обоих полов.
При этом за последние 10 лет прирост заболеваемости составил 24% [1]. Высокую вероятность развития КРР имеют пациенты, страдающие воспалительными заболеваниями толстой кишки (ТК), с семейной предрасположенностью к данной форме рака и/или имеющие аденоматозные полипы толстой кишки. Частота случаев развития рака из ворсинчатых аденом более 2 см в диаметре составляет 35 - 53%, а при аденомах диаметром более 3 см вероятность их малигнизации приближается к 100% [2]. Оценка вероятности малигнизации аденоматозных полипов ТК в настоящее время проводится на основании их размеров, количества и морфологических характеристик. Актуальным является поиск молекулярных маркеров, которые могут предоставить информацию о канцерогенном риске прогрессии аденомы [3, 4]. Одним из наиболее перспективных маркеров ранней диагностики рака толстой кишки, способных выявлять заболевание с высокой чувствительностью, специфичностью и дифференцировать патологический процесс, является фермент теломераза и соответствующий ген ТЕЯТ, кодирующий белок теломеразную обратную транскриптазу, входящую в состав фермента теломеразы. Активация экспрессии теломеразы является наиболее распространенным молекулярным маркером онкогенеза и выявляется в 85 - 90% всех опухолей [5].
Активность теломеразы практически отсутствует в нормальных соматических клетках и тканях человека и выявляется за редким исключением: ее наличие обнаружено в быстро обновляющихся тканях, например, в некоторых клетках крови, кишечном эпителии и базальном слое клеток кожи, а также в репродуктивных тканях [6, 7]. В подавляющем большинстве работ в качестве образца сравнения используют морфологически неизмененные ткани (МНТ) края резекции пациента с КРР [8, 9]. Недавние работы [10 - 12] продемонстрировали, что морфологически неизмененная ткань пораженного органа не может использоваться в качестве контроля при оценке молекулярных изменений. При сравнении МНТ и нормальной ткани здоровых доноров
выявлены существенные молекулярно-генетические отличия, которые показали необходимость использования в качестве референсных-контрольных тканей морфологически неизмененные ткани здоровых доноров. При сравнении только опухолевых и морфологически неизмененных тканей органа, пораженного злокачественной опухолью (часто в эту группу включают ткани края резекции), многие потенциальные кандидаты опухолевых биомаркеров могут быть пропущены, а направление изменения других, наоборот, определены ошибочно.
Несмотря на обширные знания анатомии и физиологии кишечника, при злокачественном поражении толстой кишки мало учитываются особенности отдела, в котором образовалась опухоль. Очевидно, что на молекулярно-генетические характеристики опухоли оказывают влияние анатомо-физиологические особенности отделов толстой кишки, из которой она происходит. Для более полного понимания молекулярных изменений, происходящих в опухолях из разных отделов толстой кишки, необходимо знание процессов, происходящих на клеточном уровне в различных отделах толстой кишки у здоровых людей.
Целью работы явилось проведение сравнительного анализа экспрессии молекулярно-генетического маркера пролиферативной активности гена ТЕЯТ при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки в разных отделах толстой кишки при использовании в качестве референсных значений уровня экспрессии в неизмененной слизистой толстой кишки здоровых доноров.
Материалы и методы
Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, для всех лиц, включенных в исследование, получено информированное добровольное согласие.
Проведен анализ образцов послеоперационного материала 230 пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом «колоректальный рак», проходивших обследование и лечение в ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России в период с 2011 по 2018 год. С доброкачественной патологией обследован 21 пациент. Ткань здоровых доноров получена от 43 пациентов. Всего исследовано 676 образцов ткани (Табл. 1). Таблица 1. Распределение исследуемых образцов по типам тканей и морфологическим
характеристикам
Группа Количество образцов Морфологическая характеристика ткани Описание образцов
"Норма" п=174 Морфологически неизмененная слизистая толстой кишки здоровых доноров Образцы получены в ходе профилактической колоноскопии от доноров без патологии в ТК.
"МНТ края резекции" п=230 Морфологически неизмененная ткань края резекции Образцы получены из зоны на расстоянии 15 - 20 см от опухолевого узла, отсутствие злокачественных клеток при гистологическом исследовании.
"КРР" п=193 Ткань аденокарциномы, получена из зоны роста опухоли Образцы аденокарцином - G3), I-ГУВ стадия. Высокодифференцированные аденокарциномы - 48%, умеренно дифференцированные - 45%, низкодифференцированные - 7%.
"МНТ аденомы" п=58 Морфологически неизмененная ткань при аденомах ТК Образцы морфологически неизмененной ткани слизистой ТК, взяты на расстоянии не менее 10 см от аденомы.
"Аденома" п=21 Ткань тубулярных и тубулярно-ворсинчатых аденом Образцы тубулярной аденомы с дисплазией 1 - 2
Получение образцов групп МНТ было сопряжено с определенными техническими трудностями, связанными с особенностями хирургического подхода в зависимости от локализации опухоли. При расположении опухоли в прямой кишке образцы МНТ получены из сигмовидной кишки (левой половины ободочной кишки); при расположении опухоли в нижней и средней трети сигмовидной кишки, взятие МНТ проводили из верхней трети сигмовидной кишки (левой половины ободочной кишки); при опухоли, расположенной в верхней трети сигмовидной кишки, нисходящей ободочной и селезеночном углу ободочной кишки, образцы МНТ были получены из поперечно-ободочной кишки (проксимальная часть левой половины ободочной кишки); при опухоли расположенной в поперечно-ободочной кишке, взятие МНТ проводили из сигмовидной кишки при выполнении левосторонней гемиколэктомии; при расположении опухоли в печеночном углу, восходящей ободочной кишке, слепой кишке пациентам проводилась правосторонняя гемиколэктомия и образцы МНТ были получены из поперечно-ободочной кишки (дистальная часть правой половины ободочной кишки).
Средний возраст пациентов составил 60,9 лет и не имел достоверных отличий в сравниваемых группах.
Образцы биологического материала после получения немедленно помещали в стабилизирующий раствор (EverFresh RNA, «Sileks», Россия) для сохранности нуклеиновых кислот и хранили при температуре -70 °С. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для постановки двухступенчатой ОТ-ПЦР использовали ген-специфические праймеры, наборы реагентов, протоколы и оборудование ЗАО «ДНК-Технология» (Россия). Реакционную смесь инкубировали при температуре 40 °С в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при температуре 95 °С в течение 5 минут. Полученную кДНК сразу использовали для постановки ПЦР в реальном
времени. ПЦР-анализ выполняли в двух повторах, каждый объемом 12 мкл, по следующей программе: 15 циклов - 80 °С 5 сек, 94 °С 5 сек.; 1 цикл - 94 °С 5 мин; 50 циклов - 94 °С 10 сек, 64 °С 20 сек. В проведенном исследовании был определен уровень экспрессии гена TERT. Уровень экспрессии мРНК для гена определяли в относительных единицах (о. е.) согласно методике, предложенной Vandesompele с соавторами [13]. В качестве референсных использовали гены: GUSB, B2M и HPRT.
Статистический анализ проводили в программном пакете Statistica 10 (StatSoft, USA) с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа и Т-критерия Стьюдента при равномерном распределении в группах. Отличия считали статистически достоверными при р<0,05. Результаты
Во всех образцах (n=676) был определен относительный уровень экспрессии гена TERT. Уровень экспрессии TERT отражает активность теломеразы. Для анализа полученных закономерностей нами было предложено разделить образцы внутри групп на в зависимости от анатомической локализации: восходящая ободочная кишка, поперечно-ободочная, нисходящая, сигмовидная, прямая кишка. Активность теломеразы у здоровых добровольцев
Статистический анализ, проведенный при сравнении экспрессии гена TERT по Т-критерию в тканях здоровых доноров, выявил достоверные отличия (р<0,05) для разных отделов ТК по уровню экспрессии (Табл. 2). Нами было обнаружено постепенное увеличение активности теломеразы в ряду: восходящая ободочная кишка, поперечно-ободочная, нисходящая, сигмовидная (достоверно наиболее высокие значения), с резким падением активности в прямой кишке (Рис .2).
Таблица 2. Достоверность отличий экспрессии ТЕЯТ в неизмененной слизистой здоровых доноров при парном сравнении разных отделов толстой кишки
Отделы ТК Поперечный п= 34 Нисходящий п=34 Сигмовидный п = 42 Прямая кишка п= 35
Восходящий п=32 0,003* 0,002* 0,000* 0,207
Поперечный п= 34 0,429 0,170 0,022*
Нисходящий п=34 0,778 0,012*
Сигмовидный п = 42 0,000*
Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты ф<0.05)
Активность теломеразы при доброкачественных изменениях ТК
При исследовании активности теломеразы в морфологически неизмененных тканях при аденомах достоверные отличия для разных отделов ТК сохраняются (Рис. 2Б). Самые низкие значения получены в группах "аденомы" и "МНТ аденомы" для тканей прямой кишки, однако эти различия не достоверны (р>0,05), вероятно, в связи с малым размером группы "аденома". При этом среднее значение экспрессии в группе «аденомы» было достоверно ниже, чем в других группах (Табл. 3).
Активность теломеразы при злокачественных новообразованиях ТК
При сравнении ткани аденокарциномы с неизмененной тканью здоровых доноров, получены достоверные отличия (р<0,05) в сигмовидной кишке (Рис. 2А). Сравнение тканей аденокарциномы в зависимости от анатомического расположения опухоли достоверных отличий не выявило. Т.о. было определено, что в неизмененной слизистой ТК здоровых доноров в разных отделах существуют достоверные отличия в уровне экспрессии ТЕЯТ, которые теряются в тканях опухолей.
Рис. 2. Активность теломеразы в образцах тканей слизистой оболочки ободочной (восходящей, поперечной, нисходящей, сигмовидной) и прямой кишки (А) в группах «норма» и «опухоль», (Б) в группах «норма», «МНТ аденомы» и «аденома»
В связи с особенностями хирургического подхода в зависимости от локализации опухоли и соответствующего забора МНТ из края резекции КРР деление на пять отделов ТК при анализе не представляется возможным из-за отсутствия образцов из восходящего отдела ободочной кишки (ОК) и малого числа образцов нисходящей ОК (см. Методы).
В клинической практике, особенно в онкологии, имеет большое значение локализация патологического процесса относительно правой (восходящая ОК,
проксимальная часть поперечной ОК) и левой половин ОК (дистальная часть поперечной ОК, нисходящая, сигмовидная кишка), что обусловлено различием клинической картины и, в большой степени, тактики лечения опухолей с правосторонней и левосторонней локализацией. Нами было принято решение оценить уровень экспрессии для тканей края резекции и других исследуемых тканей по трем отделам ТК (правая, левая половины ОК и прямая кишка).
Активность теломеразы в правой, левой половинах ободочной и в прямой кишке
При исследовании экспрессии гена ТЕЯТ в тканях здоровых доноров нами было обнаружено, что в «норме» в левой половине ОК активность теломеразы достоверно выше, чем в правой половине ОК и в ПК (Рис. 3А, Табл. 3).
Таблица 3. Средние значения уровня экспрессии гена ТЕЯТ для групп исследуемых тканей
Отделы ТК Тип ткани Среднее для группы
Правая половина ОК Норма 9,21
МНТ при аденоме 8,95
МНТ при КРР 8,92
Аденома 8,16
КРР 9,05
Левая половина ОК Норма 9,77
МНТ при аденоме 9,25
МНТ при КРР 8,96
Аденома 7,58
КРР 8,74
Прямая кишка Норма 9,10
МНТ при аденоме 8,17
МНТ при КРР 8,56
Аденома 5,38
КРР 8,91
Во всех отделах толстой кишки образцы «нормы» продемонстрировали более высокие средние значения экспрессии теломеразы, чем другие исследованные группы тканей (Табл. 3). В случае правосторонней локализации злокачественной опухоли выявлена более высокая активность теломеразы, чем при левосторонних опухолях, в прямой кишке активность теломеразы, по сравнению с левосторонним раком возрастает (Рис. 3А, Табл. 3, 4), однако эти результаты статистически не достоверны (р>0,05). В тканях края резекции наблюдаются более низкие значения среднего уровня экспрессии теломеразы в прямой кишке по сравнению с правой и левой кишкой, однако эти данные также статистически не достоверны (р>0,05) (Рис. 3А, Табл. 3, 4). Уровень экспрессии
ТЕЯТ при сравнении тканей аденокарциномы и края резекции в трех отделах ТК не имел достоверных различий.
Рис. 3. Активность теломеразы в правой половине ободочной кишки, левой половине ободочной кишки и прямой кишке (А) в группах «норма», «МНТ край резекции», «опухоль», (Б) в группах «норма», «МНТ аденомы» и «аденома»
При сравнении уровня экспрессии в группах "аденомы" и "МНТ аденомы" в трех отделах ТК самые низкие значения экспрессии теломеразы получены для тканей прямой кишки (Табл. 3). Установлено, что при доброкачественной патологии дифференциация на отделы в морфологически неизмененных тканях сохраняется.
Таблица 4. Достоверность отличий экспрессии гена ТЕЯТ в разных типах ткани при группировании образцов по правой половине ободочной кишки, левой половине
ободочной кишки и прямой кишки при парном сравнении отделов
Отделы толстой кишки / значение р Тип ткани
Край резекции Норма Опухоль МНТ аденомы Аденома
Правая ОК - Левая ОК 0,901 0,001* 0,172 0,454 0,492
Левая ОК - прямая кишка 0,121 0,001* 0,485 0, 003* 0,247
Правая ОК - прямая кишка 0,199 0,555 0,506 0,024* 0,126
Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты (р<0.05)
Показано, что уровень экспрессии гена ТЕЯТ в "норме" отличается в разных отделах ТК (Табл. 2) и имеет наиболее высокие средние значения в нисходящей и сигмовидной кишке, что соответствует левым отделам ТК (Табл. 3). При парном сравнении тканей в левой половине ОК обнаружены достоверные отличия уровней экспрессии ТЕЯТ между группами «Норма», «КРР» и «МНТ при КРР». Ткани аденомы отличаются от неизмененных тканей здоровых доноров во всех отделах ТК. Также во всех отделах ТК не обнаружены достоверные отличия между группами «КРР» и « МНТ при КРР» (Табл. 5).
Таблица 5. Достоверность отличий для тканей в отделах правой и левой половин
ободочной кишки и в прямой кишке
Отделы ТК Тип ткани Норма МНТ аденомы Аденома МНТ при КРР КРР
Правая половина ОК Норма 0,359 0,014* 0,158 0,748
МНТ при аденоме 0,183 0,951 0,730
Аденома 0,135 0,216
МНТ при КРР 0,534
КРР
Левая Норма 0,054 0,000* 0,000* 0,000*
половина ОК МНТ при аденоме 0,004* 0,390 0,115
Аденома 0,007* 0,015*
МНТ при КРР 0,297
КРР
Прямая кишка Норма 0,000* 0,000* 0,056 0,516
МНТ при аденоме 0,004* 0,293 0,057
Аденома 0,045* 0,034
МНТ при КРР 0,238*
КРР
Примечание. Использован Т-критерий Стьюдента. *Значимые результаты (р<0.05)
Обсуждение
Продукт гена ТЕЯТ - обратная транскриптаза, основной функцией которой является удлинение и стабилизация теломер, также вызывает усиление пролиферации клеток, участвует в регуляции экспрессии некоторых генов и контролирует ответ на повреждение ДНК [14].
Активность/экспрессия ТЕЯТ отражает скорость процессов пролиферации в ткани. Согласно большинству литературных источников уровень ТЕЯТ в опухолевых тканях выше, чем в «норме» [15, 16]. В нашем исследовании уровень ТЕЯТ в нормальных тканях был выше, чем при патологических процессах (КРР и аденома). Мы объясняем эти существенные различия принципиально другим подходом в формировании контрольной группы «нормальная ткань». Традиционно в большинстве исследований в качестве «нормы» используют ткань края резекции. Наши данные согласуются с результатами, представленными в ряде работ [10, 12, 17], в которых подчеркивается, что край резекции нельзя считать нормальной тканью, т.к. развитие злокачественной опухоли затрагивает и отдаленные участки пораженного органа, в данном случае ТК. Более того, наш результат объясняется особенностями нормальной физиологии тканей ТК. Скорость пролиферации
клеток кишечного эпителия является одной из самых высоких в организме млекопитающих и человека. По данным Lipkin с соавторами (1963) [18] в подвздошной кишке человека скорость пролиферации составляет 0,8 клетки на 100 клеток крипт в час, в толстой кишке - 1,2 клетки на 100 клеток крипт в час. Скорость деления клеток кишечного эпителия выше, чем у клеток различных злокачественных опухолей, для которых характерен экспоненциальный рост [19], и увеличение клеточной продукции происходит скорее за счет роста числа пролиферирующих клеток, а не за счет укорочения их жизненного цикла [20]. В статье Панченко с соавторами [21] приводятся данные об оценке пролиферативной активности эпителия в разных отделах ЖКТ. Согласно этим данным митотический индекс (процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток) оказался самым высоким в сигмовидной кишке. Полученные в нашей работе данные указывают на то, что в тканях сигмовидной кишки здоровых людей наблюдаются самые высокие показатели активности теломеразы.
Возможно, снижение экспрессии теломеразы в тканях опухоли может указывать на нарушение естественных процессов клеточного самообновления. Наше исследование гена ТЕЯТ показало достоверное снижение уровня его экспрессии в тканях при гиперпролиферативных заболеваниях ТК, причем наиболее резкое снижение было отмечено в тканях аденомы. Полученный результат можно объяснить включением дисрегуляторных механизмов при доброкачественной опухолевой патологии, например, преобладающую потерю транскрипционной активности в опухолевых клетках толстой кишки и усиление известных опухолеспецифических факторов: иммунного ответа, передачи сигналов Wnt, репликации ДНК, клеточной адгезии, апоптоза, репарации ДНК и др. [22]. Доброкачественные гиперпролиферативные заболевания редко рассматриваются с точки зрения их влияния на окружающие ткани [23, 24]. В то же время нами показано, что при локализации аденомы в ПК, изменения в МНТ аденомы достоверны и могут
указывать на влияние аденомы на окружающие ткани или являться «средой для ее возникновения и роста».
Несмотря на обширные сведения об анатомии и физиологии кишечника, при злокачественном поражении толстой кишки мало учитываются особенности отдела, в котором образовалась опухоль. Так, опухоли толстой кишки независимо от локализации объединяют под названием «колоректальный рак». Если посмотреть на анатомо-физиологические особенности толстой кишки, то становится понятным, что такой подход устарел. Несмотря на морфологическое сходство слизистой оболочки правой и левой половин ободочной кишки, они характеризуются разной всасывательной способностью, составом микробиоты и разным эмбриологическим происхождением [25]. Полученные в нашей работе результаты подтверждают этот факт. Мы продемонстрировали, что в уровне экспрессии теломеразы существуют различия между раком правой и левой половины толстой кишки. При этом, в правой половине ободочной кишки физиологические процессы оказывают наименьшее влияние на изменение экспрессии теломеразы в патологических процессах: различия между тканями здоровых добровольцев статистически не отличаются от тканей опухоли. В левой половине ободочной кишки и в прямой кишке изменения в экспрессии теломеразы зависят от типа ткани и патологического процесса. Так, в левой половине ободочной кишки ткани здоровых добровольцев отличались от всех исследованных тканей при патологии, а ткани аденомы отличались от тканей края резекции и рака. В прямой кишке ткани «нормы» отличались от МНТ при аденоме, а ткань аденомы - от аденокарциномы и края резекции.
В ряде статей [26 - 28] упоминаются различия частоты возникновения КРР в зависимости от отдела. На долю рака правосторонней локализации приходится от 15% до 39% опухолей. В нашем исследовании его доля составила 22%. Такая закономерность, может отражать разные биологические характеристики клеток проксимального и
дистального отделов толстой кишки, приобретенные при эмбриональном и постнатальном развитии [29 -32]. Полученные в нашей работе значения экспрессии ТЕЯТ в исследуемых группах ткани, во-первых, вносят дополнительную информацию об отличиях молекулярных процессов в тканях, окружающих злокачественную и доброкачественную опухоль, а, во-вторых, подчеркивают важность правильного выбора контроля (морфологически неизмененная слизистая толстой кишки здоровых доноров) для сравнения при анализе патологических процессов.
Полученные в ходе работы результаты, подтверждают, что развитие гиперпролиферативного процесса сопровождается изменениями, затрагивающими весь пораженный орган [33, 34]. Также показано, что молекулярно-генетические маркеры, отражают возможные пути развития заболевания, что согласуется с данными, полученными нами в других исследованиях [35, 36], подчеркивают важность и необходимость дальнейшего изучения биомаркеров в целях профилактики возникновения и снижения заболеваемости злокачественными новообразованиями. Заключение
Проведенное исследование экспрессии гена ТЕЯТ показало, что в морфологически неизмененной слизистой толстой кишки здоровых доноров уровень экспрессии выше, чем в аденокарциноме, аденоме и в морфологически неизмененных тканях толстой кишки, расположенных на расстоянии от опухолевого узла, при злокачественных и доброкачественных новообразованиях. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование
Исследование проведено за счет собственных средств ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России.
Информированное согласие
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Список литературы
1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. и др. Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году. Москва. 2019. Т. 18. 236 с.
2. Агейкина Н.В. Комбинированное эндоскопическое лечение малигнизированных полипов толстой кишки. Дисс. канд. мед. наук: 14.01.17. Москва. 2011.
3. Juárez М., Egoavil С., Rodríguez-Soler М. et al. KRAS and BRAF somatic mutations in colonic polyps and the risk of metachronous neoplasia. PLoSOne. 2017. V. 12. No. 9. e0184937. doi: 10.1371/journal.pone.0184937.
4. Xue-Qi C, Jia-Yu M, Wen-Bin L, et al. Association between CYP24A1 polymorphisms and the risk of colonic polyps and colon cancer in a Chinese population. World J Gastroenterol. 2017. V. 23. No. 28. P. 5179-5186. doi: 10.3748/wjg.v23.i28.5179.
5. Cukusic A., Skrobot Vidacek N., Sopta M., et al. Telomerase regulation at the crossroads of cell fate. Cytogenet Genome Res. 2008. V.122. P. 263-272.
6. Li C., Wu M.Y., Liang Y.R., et al. Correlation between expression of human telomerase subunits and telomerase activity in esophageal squamous cell carcinoma. World J Gastroenterol. 2003 V. 9. No. 11. P. 2395-2399 doi: 10.3748/wjg.v9.i11.2395.
7. Satyanarayana A., Manns M.P., Rudolph K.L. Telomeres, telomerase and cancer: an endless search to target the ends. Cell Cycle. 2004. V. 9. No. 3. Р. 1138-1150.
8. Ayiomamitis G.D., Notas G., Zaravinos A., et al. Differences in telomerase activity between colon and rectal cancer. Can J Surg. 2014. V. 57. No. 3. P. 199-208. doi: 10.1503/cjs.031312.
9. Nowak J., Januszkiewicz D., Lewandowski K., et al. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur J
Gastroenterol Hepatol. 2003. V. 15. No. 1. P. 75-80. doi: 10.1097/00042737-20030100000013.
10. Боженко В.К., Станоевич У.С., Троценко И.Д. и др. Сравнение экспрессии мРНК матриксных металлопротеиназ в морфологически нормальной, неопластической и метастатической тканях толстого кишечника и в биоптатах здоровых доноров. Биомедицинская химия. 2018. T. 64. № 1. C. 46-52.
11. Станоевич У.Клиническое значение результатов молекулярно-генетических исследований толстой кишки при колоректальном раке. Дисс. док. мед. наук: 14.01.12. Москва. 2017. 235 с.
12. Aran D., Camarda R., Odegaard J., et al. Comprehensive analysis of normal adjacent to tumor transcriptomes. Nat Commun. 2017. V. 8. No. 1. Article ID 1077. doi: 10.1038/s41467-017-01027-z.
13. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002. V. 3. No. 7. RESEARCH0034. doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034.
14. Gaspar T.B., Sâ A., Lopes J.M., et al. Telomere Maintenance Mechanisms in Cancer. Genes (Basel). 2018. V. 9. No. 5. Article ID 241. doi: 10.3390/genes9050241.
15. Ayiomamitis G.D., Notas G., Zaravinos A., et al. Differences in telomerase activity between colon and rectal cancer. Can J Surg. 2014. V. 57. No. 3. P. 199-208. doi: 10.1503/cjs.031312.
16. Nowak J., Januszkiewicz D., Lewandowski K., et al. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003. V. 15. No. 1. P. 75-80. doi: 10.1097/00042737-20030100000013.
17. Sanz-Pamplona R., Berenguer A., Cordero D. Aberrant gene expression in mucosa adjacent to tumor reveals a molecular crosstalk in colon cancer. Mol Cancer. 2014. V. 13. Article ID 46. doi: 10.1186/1476-4598-13-46.
18. Lipkin M., Bell B., Sherlok P. Cell proliferation kinetics in the gastrointestinal tract of man. I. Cell renewal in colon and rectum. J Clin Invest. 1963. V. 42. No. 6. P. 767-776. doi: 10.1172/JCI104769.
19. Baserga, R., Kisieleski W.E. Comparative study of the kinetics of cellular proliferation of normal and tumorous tissues with the use of tritiated thymidine. I. Dilution of the label and migration of labeled cells. J Natl Cancer Inst. 1962. V. 28. P. 331-339.
20. Cairnie A.B., Bentley R.E. Cell proliferation studies in the intestinal epithelium of the rat. Hyperplasia during lactation. Exp Cell Res. 1967. V. 46. No. 2. P. 428-440. doi: 10.1016/0014-4827(67)90079-1.
21. Панченко К.И., Надежин А.С., Денисов Н.И. Оценка пролиферативных эпителиальный процессов и состояния лимфоидной ткани в морфогенезе заболеваний желудочно-кишечного тракта. Вестник Ивановской медицинской академии. 2013. Т. 18. № 3. C. 16-21.
22. Cordero D., Solé X., Crous-Bou M., et al. Large differences in global transcriptional regulatory programs of normal and tumor colon cells. BMC Cancer. 2014. V.14. Article ID 708. doi: 10.1186/1471-2407-14-708 1.
23. Станоевич У.С., Захаренко М.В., Боженко В.К. и др. Роль молекулярных изменений в морфологически неизмененной слизистой оболочке толстой кишки при колоректальном раке. Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2018. № 2. C. 99-99a.
24. Bujanda L., Cosme A., Gil I., et al. Malignant colorectal polyps. World J Gastroenterol. 2010. V. 16. No. 25. P. 3103-3111. doi: 10.3748/wjg.v16.i25.3103.
25. Добровольский О.В., Сереброва С.Ю. Терапия язвенной болезни и проблемы сохранения микроэкологии желудочно-кишечного тракта. Русский Медицинский Журнал. 2007. Т. 15. № 16. С. 1193-1198.
26. Lu P., Fields A.C., Vise A.S., et al. Anatomic Distribution of Colorectal Adenocarcinoma in Young Patients. Dis Colon Rectum. 2019. V. 62. No. 8. P. 920- 924. doi :10.1097/DCR.0000000000001422.
27. Segev L., Kalady M.F., Church J.M. Left-Sided Dominance of Early-Onset Colorectal Cancers: A Rationale for Screening Flexible Sigmoidoscopy in the Young. Dis Colon Rectum. 2018. V. 61. No. 8. P. 897- 902. doi:10.1097/DCR.0000000000001062.
28. Chouhan H., Ferrandon S., De Vecchio J., et al. A Changing Spectrum of Colorectal Cancer Biology with Age: Implications for the Young Patient. Dis Colon Rectum. 2019. V. 62. No. 1. P. 21-26. doi: 10.1097/DCR.0000000000001188.
29. Nosho K., Kawasaki T., Ohnishi M., et al. PIK3CA mutation in colorectal cancer: relationship with genetic and epigenetic alterations. Neoplasia. 2008. V. 10. No. 6. P.534-541. doi: 10.1593/neo.08336.
30. Ogino S., Goel A. Molecular classification and correlates in colorectal cancer. J Mol Diagn. 2008. V. 10. No.1. P. 13-27. doi: 10.2353/jmoldx.2008.070082.
31. Yamauchi M., Lochhead P., Morikawa T., et al. Colorectal cancer: a tale of two sides or a continuum? Gut. 2012. V. 61. No. 6. P. 794-797. doi: 10.1136/gutjnl-2012-302014.
32. Hinoue T., Weisenberger D.J., Lange C.P., et al. Genome-scale analysis of aberrant DNA methylation in colorectal cancer. Genome Res. 2012. V. 22. No. 2. P. 271-282. doi: 10.1101/gr.117523.110.
33. Graham K., de las Morenas A., Tripathi A., et al. Gene expression in histologically normal epithelium from breast cancer patients and from cancer-free prophylactic mastectomy patients shares a similar profile. Br J Cancer. 2010 V. 102. No. 8. P. 1284-1293.
34. Egeblad M., Nakasone E.S., Werb Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 2010. V. 18. P. 884-901. doi: 10.1016/j.devcel.2010.05.012.
35. Bourmenskaya O., Shubina E., Trofimov D., et al. Host gene expression profiling of cervical smear is eligible for cancer risk evaluation. J Clin Pathol. 2013. V. 66. No. 4. P. 282285. doi: 10.1136/jclinpath-2012-201313.
36. Боженко В.К., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б. и др. Анализ экспрессии генов пролиферации и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки. Опухоли женской репродуктивной системы. 2011. № 4. С. 72-76.
