CC BY
30
УДК 577.175.62:576.385.5:54-32
С.В. Позднякова, О.Р. Грек, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова,
Н.А. Жукова, Д.Д. Цырендоржиев, Н.А. Попова,
В.И. Каледин, В.П. Николин
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ И КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ [3-ОКСО-20(29)-ЛУПЕН-28-ОИЛ]-3 АМИНОПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Проведено изучение клеточных механизмов реализации противоопухолевого эффекта производных бетулиновой кислоты. Выявлено апоптозиндуцирующее и антимитотическое действие [Зр-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовой кислоты в опухолевых клетках, которое сопровождалось снижением концентраций IL-1 (3, TNF-a и IL-4 в сыворотке крови мышей с аденокарциномохЧ легких Lewis.
Ключевые слова: бегулииовая, бетулоновая, амид бетулоновой кислоты с (3-аланином, мышиная аденокарцинома легких Lewis, интерлейкины, апоптотический и митотический индексы в опухоли
В последние годы повысился интерес к три-терпеновым соединениям, обладающим разносторонней биологической активностью и широко распространенным в растительном мире [5, 11]. С целью поиска новых биологически активных соединений в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН синтезированы новые производные Зр-оксо-20(29)-лупен-28-овой (бетулоновой) кислоты,
— содержащие у С-28 различные фрагменты аминокислот или их метиловых эфиров [7]. В проведенных ранее исследованиях нами показано, что изучаемые агенты Зр-оксо-20(29)-лупен-28-овая, [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионо-вая кислоты и метиловый эфир [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовой кислоты снижают органотоксическое действие противоопухолевых препаратов, а амид с р-аланином ([3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовая кислота), в дополнение к отмеченному выше, обладает собственным умеренным противоопухолевым действием и потенцирует действие цитоста-тических препаратов [2].
Связь концентрации цитокинов с основными свойствами злокачественной ткани делает возможным использование данных показателей в качестве маркеров опухолевой прогрессии и прогноза новообразований [1, 8]. Участие цитокинов
в развитии онкологических заболеваний осуществляется при помощи различных механизмов. Одним из наиболее значимых является вовлечение цитокинов в процессы апоптоза и клеточной пролиферации опухолевых клеток. Что и определило цель исследования.
Были поставлены задачи по выявлению уровней концентраций цитокинов — IL-ip, TNF-a и IL-4, а также проапоптотической и митотической активностей клеток опухолевой ткани у мышей-опухоленосителей после однократного введения Зр-гидрокси-20(29)-лупен-28-овой (бетулиновой), Зр-оксо-20(29)-лупен-28-овой (бетулоновой) и [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовой (амид с р-аланином бетулоновой кислоты) кислот.
Методика
В опытах использовали мышей-самцов линии С57В1/6, массой около 20-22 г (ИЦиГ СО РАН). В каждой подопытной и контрольной группах было по 9-12 мышей. Всем животным в мышцу правого бедра трансплантировали клетки перевиваемой мышиной аденокарциномы легких Lewis. Через 10 дней после перевивки всех животных разделили на 5 групп: 1 группа — «нелечениые» животные — служила контролем, мышам-опухоленоси-телям 2,3 и 4 групп однократно внутрижелудочно вводили Зр-гидрокси-20(29)-лупен-28-овую, Зр-
оксо-20(29)-луиен-28-овую или [3-оксо-20(29)-лупсн-28-оил]-3 аминопропионовую кислоты в дозах 500 мг/кг соответственно. Животным 5 группы в аналогичном режиме вводили препарат сравнения циклофосфамнд в дозе 125 мг/кг. Забор материала проводили через 48 часов после введения препаратов. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» |6].
Определение содержания 1Ь-1р, Т\Т-а и 1Ь-4 в сыворотке мышей проводили с помощью коммерческих наборов для иммуноферментиого анализа (ГЖО, Германия). Измерения концентраций ци-токинов, 1Ир,ТЫР-аи 1Ь-4, проводили на вертикальном спектрофотометре «Мультискан МСС-340» при длине волны 450 нм. Количественное содержание выражали в нкг/мл.
В мазках-отпечатках первичного опухолевого узла подсчитывали численную плотность атипичных митозов и апопгозных телец на 1000 опухолевых клеток. Дифференцирование данных объектов проводили на основании специфических морфологических изменений цитоплазмы и ядра [9,10].
Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием I критерия Стъюдента. Результаты считали достоверными при р<0,05.
Результаты исследования
Через 48 часов после введения бетулииовой (2 гр.) и бетулоновой кислот (3 гр.) мышам митотический индекс опухолевых клеток достоверно не изменялся. Многочисленными исследования-
□ Апоптозные тельца ■ Митозы
I
I
ж
I
Группы животых
Рис. 1. Апоптогеппое и антимитотическое действие изучаемых препаратов на опухолевые клетки мышиной аденокарциномы легких Lewis.
Примечание: 1 /р. — контроль; 2 гр. — бетулиновая кислота; 3 гр. - бетулоновая кислота; 4 гр. — введения 13-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовая кислота (амид с /1-аланином); 5 гр. — циклофосфамнд
ми показано, что скорость прогрессии опухолевых заболеваний зависит зачастую не столько от митотической активности, сколько от способности опухолевых клеток избегать апоптоза |2]. И действительно, у животных данных групп численная плотность апопгозных телец в опухоли увеличилась в 2,21 и 1,88 раза соответственно (Рис. 1).
Апоптозиндуцирующая активность сопровождалась значительным снижением плазменной концентрации IЬ-1 по сравнению с «нелеченны-мп» животными и группой животных, получавших циклофосфамнд (Рис. 2а). Уровень П.-1 у
ИЛ-1
4000
3500
3000
■§2500
It
2000
1500
1000
Группы животных
ИЛ-4
Г руппы животных ФНО
Рис. 2. Концентрации цитокинов в сыворотке крови мышей с аденокарциномой легких Lewis через 48 часов после однократного введения препаратов.
Примечание: 1 гр. — контроль; 2 гр. — бетулиновая кислота; 3 гр. — бетулоновая кислота: 4 гр. — введения [3-оксо-20(29) -лупен -28-оил /-3 аминопропионовая кислота (амид с Ц-аланином); 5 гр. — циклофосфамнд
животных 2-й и 3-й групп снизился относительно контрольной группы (гр. 1) в 4,15 и 4,73 раза, относительно группы сравнения (5 гр.) — в 3,80 и 4,33 раза. Концентрация IL-4 у мышей, получавших бетулоновую кислоту, превышала контрольные значения на 56,58% (Рис. 2в).
Через 48 часов после воздействия амида с Р-аланином бетулоновой кислоты (4 гр.) митотический индекс опухолевых клеток был ниже контрольных значений в 4,39 раз. Данный агент показал и хорошую проапоптотическую активность. Численная плотность апоптозных телец в опухоли была выше, чем 1, 2 и 3 группах в 4,77, 2,15 и 2,54 раза, соответственно (Рис. 1).
Динамика цитокинового профиля сыворотки мышей данной группы отличалась от таковой у животных, получавших бетулиновую и бетулоновую кислоты, отмечали снижение концентраций всех изучаемых цитокинов. В сравнении с контрольной группой уровень IL-1 снизился в 2,55, TNF — в 2,01 IL-4 — в 2,17 раза. При этом уровень IL-4 в сыворотке крови был ниже, чем во 2 и 3 группах в 2,72 и 3,40 раза соответственно.
Через 48 часов после введения циклофосфа-мида апоптотический индекс в опухоли возрос в 3,64 раза относительно нелеченных животных. Наряду с индукцией апоптоза, циклофосфамид в дозе 125 мг/кг вызывал некротическую гибель значительного процента опухолевых клеток. Митотический индекс снизился в 3,45 раз относительно контрольных значений (Рис. 1).
У мышей данной группы сохранялись высокие значения IL-1, тогда как концентрация ФНО была ниже в 2,16 и 2,07 раза по сравнению с 1-й и 3-й группами соответственно. Высокие значения IL-1 в сыворотке мышей, получавших циклофосфамид, коррелировали с более выраженным распадом опухолевой ткани и лейкоцитарной инфильтрацией.
Заключение
Исследования клеточных механизмов действия изучаемых препаратов на мышиную аденокарциному Lewis показывают, что их противоопухолевые эффекты при однократном введении реализуются через различные механизмы. Воздействие [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовой кислоты реализовалось посредством апоптогенного и цитостатического действий. Бетулиновая и бетулоновая кислоты также индуцировали апоптоз в данной опухоли, хотя в значительно меньшей степени, чем р-ала-ниамидное производное бетулоновой кислоты
— [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропио-новая кислота. Циклофосфамид наряду с индукцией апоптоза вызывал некротическую гибель опухолевых клеток.
Важная роль в инициации клеточных механизмов принадлежит цитокинам. Эффект цитокинов на клетки неоднозначен: для одних клеток они выступают в роли индукторов апоптоза, для других — в роли ингибиторов апоптоза. Это зависит от типа клетки, от стадии ее диффереицировки и функционального состояния [3]. Апоптогенное действие препаратов сопровождалось снижением концентрации основного провоспалительного цитокина, IL-ip, после введения бетулиновой, бетулоновой кислот и амидного производного бетулоновой кислоты. Тогда как через 48 часов после введения циклофосфамида, реализующего свой противоопухолевый эффект преимущественно через некрозогенное действие, высокие концентрации данного цитокина сохранялись. Это, вероятно, связано с важной ролью в инициации воспаления IL-ip, который активирует эндотелий и лейкоциты, усиливая экспрессию адгезивных белков, оказывает выраженное ираймирующее действие на нейтрофилы, существенно увеличивая уровень продукции фагоцитами активных форм кислорода.
Снижение уровня TNF-a — продукта Th-1 и 1L-4 — продукта Th-2 профилей происходило только после введения [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3 аминопропионовой кислоты и циклофосфамида, для которых было характерно и цитоста-тическое действие.
THE INVESTIGATION OF [3-OXO-20(29)-LUPEN-28-OYL]-3 AMINO-PROPIONIC ACID CYTOKINES LEVELS AND CELL MECHANISM OF ANTITUMOR ACTIVITY
S.V. Pozdnjakova, O.R. Grek, I.V Sorokina,
T.G. Tolstikova, N.A. Zhukova,
D.D. Cyrendorzhyev, N.A. Popova, V.I. Kaledin, V.P. Nikolin
The investigation deals with cell of betulininc acid derivatives antitumor effect. It was faund that the effect of [3-oxo-20(29)-lupen-28-oul]-3-amino-propionic acid is mediated by inducing apoptosis and inhibition of mitotic reactions in transplanted murine tumor. This fact correlated with decrease plasma concentration of IL-ip, IL-4 and TNF-a.
Литература
1. Бережная H.M. Система интерлейкинов и рак (новые аспекты взаимодействия опухоли и организма) / Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун. — Киев, 2000. — 224 с.
2. Бетулоновая кислота и ее производные — новая группа агентов, снижающих побочное действие ци-тостатиков / И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, Н.А. Жукова и др. // Доклады Академии наук. — 2004. — Т. 399.
— № 2. - С. 1-4.
3. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптотической смерти клеток / Е.Б. Владимирская // Гематология и трансфузиология. — 2002. — Т. 47. — № 2. — С. 35-40.
4. Владимирская Е.Б. Ростовые факторы, регулирующие аиоптоз / Е.Б. Владимирская, А.А. Масчан, А.Г Румянцев // Гематология и трансфузиология. — 1997. --№4.-С. 12-16.
5. Похило Н.Д. Изонреноиды различных видов рода Ве1:и1а / Н.Д. Похило, Н.И. Уварова // Химия природных соединений. — 1988. — №3. — С. 325-341.
6. Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755.
7. Синтез производных бетулоновой кислоты, содержащих аминокислотные фрагменты / Н.И. Петренко, Н.В. Еланцева, В.З. Петухова и др. //Химия при-
родных соединений. — 2002. — № 4. — С. 276-283.
8. Цитокины в патогенезе злокачественных новообразований / Н.В. Чердынцева, В.А. Белявская, II.А. Гервас и др. // Цитокины и воспаление. — 2005. — №2. - С. 103.
9. Triton Х-100 induces apoptosis in human hepatoma ceil lines /J.M. Ahn, S.J. Kim, Kim. et ai. // Yonsei Med. J.
- 1997. - Vol. 38. - № 1. - P. 52-59.
10. The nature of cytotoxic drug-induced cell death in murine intestinal erupts / T.V. Anilkumar, C.E. Sarraf, T. Hunt et al. //Br.J.Cancer. — 1992. — Vol. 65. — № 4.
- P. 552-558.
11. Kim D.S.H.L., Pezzuto J.M., Pisha E. // Bioorg. And Med. Chem. Lett. — 1998. — Vol. 8. — № 13. — P. 255.
