CC BY
23
УДК 617.7-006; 616-006.446.2
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИСТАТИНА С И ЦИСТАТИНА SN В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ КАК ВОЗМОЖНЫХ МАРКЕРОВ ВНУТРИГЛАЗНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
Мария Андреевна ДИКОВСКАЯ1, Александр Николаевич ТРУНОВ12, Ольга Николаевна КУЛЕШОВА1, Константин Валерьевич ЛОКТЕВ3, Валерий Вячеславович ЧЕРНЫХ1, Любомир Иванович АФТАНАС3, Татьяна Александровна КОРОЛЕНКО3
1 Новосибирский филиал ФГБУМНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова 630096, г. Новосибирск, ул. Колхидская, 10
2 ФГБУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
3 ФГБУ НИИ физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Цель исследования - определение концентрации цистатина С и цистатина SN как возможных биомаркеров опухолевого процесса в различных биологических жидкостях больных с объемными внутриглазными образованиями. С помощью иммуноферментного метода определена концентрация цистатина С и цистатина SN в сыворотке крови, слезе и внутриглазной жидкости у пациентов с меланомой хориоидеи, псевдотуморозной формой возрастной макулодистрофии и у здоровых добровольцев (контроль). Выявлено увеличение концентрации цистатина С и уменьшение концентрации цистатина SN во всех исследуемых биологических жидкостях у пациентов как с меланомой хориоидеи, так и с возрастной макулодистрофией в сравнении с контролем.
Ключевые слова: цистатин С, цистатин SN, меланома хориоидеи, слеза, внутриглазная жидкость.
Цистатины - группа эндогенных ингибиторов цистеиновых протеаз, открытая около 20 лет назад, биологическая роль которых активно исследуется в последние годы. Основная функция ци-статинов чрезвычайно важна для регулирования физиологических процессов, связанных с внутри-и внеклеточным протеолизом, они ограничивают потенциально повреждающую деятельность целевых протеаз. Цистатин С - низкомолекулярный белок, обнаруженный в различных типах клеток (макрофагах, гепатоцитах и др.), является эффективным и наиболее изученным эндогенным ингибитором цистеиновых протеаз - катепсинов В, L, Н, 8 и К [2, 3, 15]. Согласно современной классификации, наряду с цистатинами 8, 8А, SN и D он относится ко 2-му типу семейства цистатинов [2, 8], локализован преимущественно вне клетки и
обнаружен во всех биологических жидкостях человека. Наиболее высокое содержание цистатина С отмечено в спинно-мозговой жидкости, менее значительное - в сыворотке крови и существенно более низкое - в моче, слезе, ротовой жидкости, молоке [7, 15]. В тканях высокая концентрация этого ингибитора обнаружена в головном мозге [10].
В настоящее время изучается биологическая роль цистатина С в норме и при ряде заболеваний человека, включая сердечно-сосудистые [1, 15], онкологические [2, 5, 13], диабет [14]. Цистатин С предложено использовать в клинике для выявления ранних нарушений почек в качестве нового показателя скорости клубочковой фильтрации [2, 3, 15], причем оценка его содержания находит все более широкое применение по сравнению с опре-
Диковская М.А. - зав. офтальмологическим отделением, врач-офтальмолог, e-mail: dikovskayam@mail.ru
Трунов А.Н. - д.м.н., проф., зам. директора по научной работе, руководитель лаборатории иммунологии,
e-mail: trunov1963@yandex.ru
Кулешова О.Н. - д.м.н., проф., офтальмолог
Локтев К.В. - научный сотрудник
Черных В.В. - д.м.н., проф., директор, e-mail: rimma@mntk.nsk.ru Афтанас Л.И. - академик РАН, директор
Короленко Т.А. - д.м.н., проф., зав. лабораторией, e-mail: t.a.korolenko@physiol.ru
делением концентрации креатинина в сыворотке крови [1, 2]. Все возрастающее число работ посвящено исследованию цистатина С как возможного маркера ряда опухолей человека [1-6, 10]. Цисте-иновые протеазы (катепсин L и др.) участвуют в деградации внеклеточного матрикса, способствуя росту, инвазии и метастазированию опухолевых клеток, а также участвуют в ангиогенезе опухоли [4, 5, 8, 15]. Нарушения регуляции активности катепсинов В и L коррелируют с повышенной экспрессией ряда цистатинов, включая цистатин С [11, 13]. У пациентов с колоректальным раком высокий уровень внеклеточных ингибиторов сопряжен с уменьшением продолжительности жизни пациентов, что позволяет предполагать их канцерогенную роль в прогрессировании этого заболевания [17]. Полагают, что у пациентов со злокачественными новообразованиями уровень сывороточного цистатина С коррелирует с про-грессированием заболевания, а не только с клу-бочковой скоростью фильтрации [1]. Повышение его содержания в сыворотке крови и в тканях опухоли обнаружено у больных раком простаты [10], неходжкинской В-клеточной лимфомой [12], раком молочной железы и пр. [4, 6, 16].
Менее изучен по сравнению с цистатином С цистатин SN, ингибирующий большее количество цистеиновых протеаз (катепсинов В, Н и L), вовлеченных в развитие опухолей. Повышение концентрации цистатина SN в моче при ко-лоректальном раке может служить новым маркером этого заболевания [17]. Высокая экспрессия цистатина SN в опухоли коррелирует с развитой стадией при раке желудка. Полагают, что активность ингибиторов цистеиновых протеаз связана с инвазией и метастазированием опухолевых клеток [9]. Показано, что цистатин SN оказывает нейтрализующее действие на ингибирующий эффект цистатина С в отношении активности катепсина В [9]. Это интересное взаимодействие ингибиторов изучено недостаточно. Пациенты с плоскоклеточным раком пищевода, у которых повышена экспрессия цистатина SN, имеют лучший прогноз выживаемости, что позволило предложить ее как независимый показатель выживания [6].
Несмотря на огромный прогресс в развитии и внедрении в клинику глазных болезней современных высокотехнологичных диагностических методов в последние десятилетия, вопросы дифференциальной диагностики злокачественных опухолей органа зрения остаются нерешенными. Опухоли и симулирующие их заболевания нередко имеют сходную клиническую картину, как, собственно, и опухоли различного происхождения. Особенностью обследования пациента
в офтальмоонкологии является то обстоятельство, что диагноз, как правило, устанавливается на основании визуальной клинической картины и ультразвукового сканирования, без возможности проведения гистологического исследования новообразования. Поиск новых объективных маркеров такой часто встречающейся и тяжелой патологии как меланома хориоидеи является чрезвычайно актуальным.
Цель работы - определение концентрации цистатина С и цистатина SN как возможных маркеров опухолевого процесса в различных биологических жидкостях пациентов с меланомой хориоидеи (МХ) и псевдотуморозной формой возрастной макулодистрофии (ВМД).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Основную группу обследованных составили 57 пациентов, проходивших обследование и лечение в Новосибирском филиале МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С.Н. Федорова с диагнозом МХ (36 женщин и 21 мужчина), в возрасте от 28 до 80 лет (56,6 ± 2,4 года). Во всех случаях процесс носил односторонний характер. В связи с большим размером опухоли 17 пациентам выполнена операция энуклеация глазного яблока с последующей морфологической верификацией диагноза, 40 человек направлены на органосохранную операцию. Во вторую группу вошли 15 пациентов с псевдотуморозной формой ВМД (6 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 42 до 89 лет (68,0 ± 1,8 года). Дистрофический процесс носил двухсторонний характер. По показаниям пациентам проводили консервативное медикаментозное лечение и динамическое наблюдение.
Диагноз устанавливали на основании комплексного обследования, включающего, кроме стандартного офтальмологического осмотра, оф-тальмобиомикроскопию с асферической высокодиоптрийной лупой 78 диоптрий, фотографирование глазного дна, комплексное ультразвуковое исследование, по показаниям - флуоресцентную ангиографию и оптическую когерентную томографию сетчатки. Всем больным проводили общеклиническое обследование: сбор анамнестических данных, сопутствующих заболеваний, полный общий анализ крови и мочи, определение уровня глюкозы в крови, рентгенография органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости. Все пациенты с подозрением на онкологический процесс были осмотрены онкологом для исключения опухоли неглазной локализации и наличия метастазов МХ. Критерием исключения из исследования явилось наличие у пациента тяжелой почечной патологии,
злокачественной гипертонической болезни и тяжелых сердечно-сосудистых нарушений.
Группу контроля составили 37 здоровых добровольцев (медицинский персонал клиники и студенты Новосибирского государственного медицинского университета в возрасте от 20 до 49 лет (31,0 ± 4,1 года) и 7 пациентов (3 мужчин и 4 женщины) с возрастной неосложненной катарактой в возрасте от 57 до 80 лет (71,0 ± 2,6 года).
Слезную жидкость для исследования набирали микроканюлей из нижнего конъюнктивально-го свода глаза в сухую герметичную пробирку в количестве 0,3-0,5 мл. Слезопродукцию стимулировали посредством механического раздражения рецепторных окончаний тройничного нерва в слизистой оболочке глаза. Для получения сыворотки крови забор крови осуществляли из локтевой вены по стандартной методике. Для исследования внутриглазной жидкости использовали влагу передней камеры глаза, которую у пациентов с внутриглазной меланомой забирали из эну-клеированных глаз, а у пациентов контрольной группы - во время операции экстракции катаракты. Забор материала и все исследования проводили с информированного согласия пациентов и в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2000 г.).
Концентрацию цистатина С определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов Biovendor (Чехия) для количественного определения цистатина С человека. Концентрацию цистатина SN - методом иммунофермент-ного анализа для количественного определения цистатина SN с использованием коммерческих наборов Human Cystatin SN (CST1) Elisa Kit Cusabio (Китай).
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (т), и представляли в виде М ± т. Различия между группами оценивали с помощью теста Краскела - Уоллеса для межгрупповых сравнений. Связь между различными признаками в исследуемой выборке определялась с помощью корреляционного анализа величиной коэффициента корреляции Спирмена (г). За достоверные принимали значения р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В контрольной группе здоровых лиц наблюдали сходство в распределении цистатинов С и SN в биологических жидкостях: концентрация цистатина С в биологических жидкостях (в сыворотке крови, во внутриглазной жидкости и слезе) в сотни раз превышала концентрацию цистатина SN (см. таблицу). В сыворотке крови цистатина С содержится значительно больше, чем в слезе (р = 0,0000), и несколько больше, чем во внутриглазной жидкости (р > 0,05). Выявлена прямая корреляция между уровнем цистатина С у здоровых лиц в сыворотке крови и во внутриглазной жидкости (г = 0,82; р = 0,023). Концентрация цистатина SN в сыворотке крови была выше, чем в слезе (р = 0,0001) и во внутриглазной жидкости (р = 0,0003). Обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между концентрацией цистатина С и цистатина SN в сыворотке крови (г = -0,78; р = 0,02).
Выявлено достоверное увеличение концентрации цистатина С в сыворотке крови пациентов с МХ (р = 0,0191) и ВМД (р = 0,009) по сравнению
Таблица
Концентрация цистатина С и цистатина Ш в биологических жидкостях разных групп наблюдения
(нг/мл)
Контроль Меланома хориоидеи ВМД
Цистатин С Слеза пораженного глаза Слеза парного глаза Внутриглазная жидкость Сыворотка крови 287,5 ± 20,0 (n = 44) 522,0 ± 124,7 (n = 7) 809,9 ± 146,8 (n = 12) 441,7 ± 14,5 (n = 53) 483,9 ± 20,8*** (n = 39) 552,5 ± 54,2 (n = 15) 1023,5 ± 78,9* (n = 22) 435,6 ± 21,9 (n = 15) 449,5 ± 35,2** (n = 5) 1696,0 ± 268,9* (n = 7)
Цистатин SN Слеза пораженного глаза Слеза парного глаза Внутриглазная жидкость Сыворотка крови 0,70 ± 0,15 (n = 21) 2,60 ± 0,60 (n = 3) 3,12 ± 0,32 (n = 8) 0,61 ± 0,12 (n = 14) 1,43 ± 0,12 (n = 4) 1,45 ± 0,30** (n = 7) 0,61 ± 0,22 (n = 10) 1,39 ± 0,43* (n = 10)
Примечание. Отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо: * - прир < 0,05, ** - прир < 0,01, *** - прир < 0,001.
с контролем, при этом при ВМД она была больше, чем при МХ (р = 0,0179). В слезе больного глаза с меланомой хориоидеи уровень цистатина С имел тенденцию к повышению по сравнению с контролем и с концентрацией в слезе пациентов с ВМД (см. таблицу).
При сравнении концентрации цистатина С в пораженном и парном глазу различия обнаружены у пациентов с меланомой хориоидеи (р < 0,02) (см. таблицу). На непораженном глазу наблюдали более выраженное повышение. Достоверных различий в уровне цистатина С между глазами у пациентов с ВМД не было (дистрофический процесс, как правило, двусторонний). Выявлено, что концентрация цистатина С во внутриглазной жидкости больных МХ несколько выше, чем в контрольной группе (см. таблицу).
Концентрация цистатина SN в сыворотке крови и во внутриглазной жидкости пациентов с МХ ниже, чем у лиц контрольной группы (р = 0,0038), у больных с ВМД - только в сыворотке крови (см. таблицу). По содержанию цистатина SN в слезе обследованные разных групп не различались (см. таблицу).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Концентрация цистатина С в сыворотке крови, слезе и внутриглазной жидкости здоровых лиц значительно превышает концентрацию цистати-на SN. Наличие обратной корреляции между содержанием этих ингибиторов протеаз в сыворотке крови свидетельствует об их взаимосвязи. При развитии МХ и ВМД обнаружены реципрокные изменения - повышение концентрации цистати-на С и снижение концентрации цистатина SN во всех исследованных биологических жидкостях, что позволяет сделать заключение о вовлечении их в патологический процесс как дистрофического, так и опухолевого характера.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Короленко Т.А., Филатова Т.Г., Черкано-ва М.С. и др. Цистатины: регуляция цистеиновых протеаз и нарушения при опухолевых и воспалительных заболеваниях // Биомед. химия. 2008. 54. (2). 210-217.
2. Короленко Т.А. Цистатины - биологическая роль и нарушения в патологии // Вестн. РАМН. 2008. (4). 43-47.
3. Халикова Т.А., Короленко Т.А., Ильницкая С.И. Лизосомные катепсины В, L и D при развитии экс-
периментальных лейкозов мышей // Биомед. химия. 2009. 55. (5). 621-634.
4. Bobek L.A., Levine M.J. Cystatins inhibitors of cysteine proteinases // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1992. (3). 307-332.
5. Chen Y.F., Ma G., Cao X. et al. Overexpression of Cystatin SN positively affects survival of patients with surgically resected esophageal squamous cell carcinoma // BMC Surgery. 2013. 13:15. doi:10.1186/1471-2482-13-15.
6. Dikovskaya M., Trunov A., Chernykh V., Koro-lenko T. Cystatin C and lactoferrin concentrations in biological fluids as possible prognostic factors in eye tumor development // Int. J. Circumpolar Health. 2013. 72. 284-288.
7. Kay P., Yang Y.C., Paraoan L. Polarized secretion of Cystatin C from human fetal retinal pigment epithelium // ARVO Ann. Meet. Abstr. 2012. 53. 1604.
8. Keppler D. Towards novel anti-cancer strategies based on cystatin function // Cancer Lett. 2006. 235. 159-176.
9. Kim J-T., Lee S-J., Kang M. et al. Cystatin SN neutralizes the inhibitory effect of cystatin C on cathepsin B activity // Cell Death Dis. 2013. (4). e974. doi:10.1038/cddis.2013.485.
10. Kos J., Lah T.T. Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer (review) // Oncol. Rep. 1998. 5. (6). 1349-1361.
11. Ladero J.M., Cardenas M.C., Ortega L. et al. Serum cystatin C: a non-invasive marker of liver fibrosis or of current liver fibrogenesis in chronic hepatitis C? // Ann. Hepatol. 2012. 11. (5). 648-651.
12. Mulaomerovic A., Halilbasic A., Cickusic E. et al. Cystatin C as a potential marker for relapse in patients with non-Hodgkin B-cell lymphoma // Cancer Lett. 2007. 248. 192-197.
13. Mussap M., Plebani M. Biochemistry and clinical role of human cystatin C // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2004. 41. 467-550.
14. Sahakyan K., Lee K., Shankar A., Klein R. Serum cystatin C and the incidence of type 2 diabetes mellitus // Diabetologia. 2011. 54. (6). 1335-1340.
15. Turk V., Stoka V., TurkD. Cystatins: Biochemical and structural properties, and medical relevance // Front. Biosci. 2008. 13. 5406-5420.
16. Wegiel B., Jiborn T. et al. Cystatin C is down-regulated in prostate cancer and modulates invasion of prostate cancer cell via MAPK/Erk and androgen receptor pathways // PLoS One. 2009. 4. (11). e7953.
17. Yoneda K., Iida H., Endo H. et al. Identification of Cystatin SN as a novel tumor marker for colorectal cancer // Int. J. Oncol. 2009. 35. 33-40.
THE INVESTIGATION OF CYSTATIN C AND CYSTATIN SN AS POSSIBLE MARKERS OF EYE TUMOR DEVELOPMENT IN BIOLOGICAL FLUIDS
Maria Andreevna DIKOVSKAYA1, Аleksandr Nikolaevich TRUNOV12, Olga Nikolaevna KULESHOVA1, Konstantin Valerievich LOKTEV3, Valery Vyacheslavovich CHERNYKH1, Ljubomir Ivanovich Aftanas3, Tatyana Аleksandrоvna KOROLENKO3
1 S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk Branch 630096, Novosibirsk, Kolkhidskaya str., 10
2 Research Center of Clinical and Experimental Medicine of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
3 Institute of Physiology and Fundamental Medicine of SB RAMS Novosibirsk, 630117, Novosibirsk, Timakov str., 4
Objectives: to investigate the possible role of cystatin C and cystatin SN as potential biomarkers of eye tumor development in eye biological fluids locally and in serum. Serum, tear fluid and intraocular fluid samples obtained from the anterior chamber of eyes in patients with choroidal melanoma, pseudotumor form of age-related macular degeneration , and healthy volunteers were studied by enzyme immunoassay method. The increase of cystatin C concentration and the decrease of cystatin SN concentration were revealed in all biological fluids of examined patients: both with melanoma of the choroid and with age- macular degeneration.
Key words: cystatin C, cystatin SN, choroidal melanoma, tear, intraocular fluid.
Dikovskaya M.A. - ophthalmologist, head of the department for ophthalmology, e-mail: dikovskayam@mail.ru Trunov A.N. - doctor of medical sciences, professor, deputy director for scientific work, head of the laboratory of immunology, e-mail: trunov1963@yandex.ru
Kuleshova O.N. - doctor of medical sciences, professor, ophthalmologist Loktev K.V. - researcher
Chernykh V.V. - doctor of medical sciences, professor, director, e-mail: rimma@mntk.nsk.ru Aftanas L.I. - academician of RAS, director
Korolenko T.A. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory, e-mail: t.a.korolenko@physiol.ru
