CC BY
28
УДК 615.9:615.416:616-001.8-074
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ТРАНСДЕРМАЛЬНОГО ПЛАСТЫРЯ С ГИПОКСЕНОМ С.О. Лосенкова1, Г.Н. Фёдоров1, Э.Ф. Степанова2, А.П. Гераськина1
1Smolensk State Medical Academy, 214019, Krupskaya St., 28, Smolensk, Russia
2Пятигорская государственная фармацевтическая академия, Россия, 357532, Пятигорск, пр-т Калинина, 11
Проведено доклиническое изучение безопасности трансдермального пластыря с гипоксеном. Введение трансдермального гипоксена крысам в течение мес. в дозах 75-1500 мг/кг не вызывает гибели животных. Применение повреждающих доз 600-1500 мг/кг приводит кснижению прироста общей массы, изменению поведенческих реакций, нарушению функции почек, а также развитию несмертельных патологических изменений со стороны кроветворных органов крыс.
Ключевые слова: гипоксен, трансдермальный пластырь, субхроническая токсичность
COMPARATIVE STUDY OF TRANSDERMAL HYPOXEN PLASTER TOXICITY S.O. Losenkova1, G.N. Fyodorov1, E.F. Stepanova2, A.P. Geraskina1
1Smolensk State Medical Academy, Russia, 214019, Smolensk, Krupskaya St., 28 2Pyatigorsk state pharmaceutical academy, Russia, 357532, Pyatigorsk, Kalinin Av., 11
It is spent preclinical safety studying transdermal a plaster with hypoxen. Introduction transdermal of hypoxen to rats within a month in doses 75-1500 mg/Kg does not cause destruction of animals. Application of damaging doses 600-1500 mg/Kg results to decrease a lump gain, to change of behavioral reactions, infringement of function of kidneys, and also development of the nonlethal pathological changes from the party blooding bodies of rats.
Key words: hypoxen, transdermal plaster, subchronic toxicity
Известно, что любое новое химическое соединение или лекарственная форма независимо от предполагаемых целей его применения должно быть охарактеризовано с точки зрения его возможной токсичности и биологической активности. Тем более это касается потенциальных лекарственных препаратов (ЛП), тестирование которых в доклинических испытаниях должно обеспечить получение достоверной токсикологической оценки [1].
Нами разработан и сконструирован состав трансдермального пластыря матричного типа с гипоксеном (натрия полигидроксифенилентиосульфонатом). Гипоксен относится к группе антиоксидантов и антигипоксантов. Трансдермальный пластырь предназначен для лечебно-профилактического применения в качестве гастропротекторного средства.
Проведённые биофармацевтические исследования туШо с использованием модели биологической мембраны, моделирующей кожные покровы, указывают на то, что степень высвобождения лекарственного вещества (ЛВ) из пластыря при накожном его наложении в течение 7 дней составляет 23,7% [2].
Целью исследования явилось изучение общетоксических свойств трансдермального гипоксена (ТГ) при его применении в течение 1 мес. [3]. Изначально для исследования хронической токсичности выбран 2-месячный период применения трансдермального пластыря, но через 1 мес. эксперимента в контрольных группах животных зафиксировано раздражающее действие на кожу компонентов матрицы, при этом в опытных группах раздражающее действие отсутствовало. Период наложения в течение 1 мес. у животных соответствует длительности применения у человека в течение 7-14 дней.
Методика
Использованный в работе трансдермальный гипоксен представляет собой пластырь матричного типа площадью 25см2 (в 1 см2 содержится 2 мг гипоксена). В состав матричного слоя входит лекарственное вещество гипоксен, а также вспомогательные вещества: натрия метабисульфит, пропиленгликоль - 1,2-поливинилпирролидон среднемолекулярный ПВП К30 [3].
Для проведения эксперимента было использовано 14 групп животных, по 12 особей в группе (6 самок и 6 самцов; всего 168 животных, масса 220-240 г). Животным 1-й группы ежедневно трансдермально вводили гипоксен в дозе 75 мг/кг. Крыс 1-6-й, 11-13-й групп через 1 мес. декапитировали под лёгким эфирным наркозом. Оставшихся животных оставляли для дальнейшего наблюдения в течение 1 мес., при этом животное не подвергали воздействию препарата. 2-й группе аналогичным образом накладывали пластырь с гипоксеном в дозе 600 мг/кг в течение 1 мес. с 4-кратной заменой пластыря. Животным 3-й группы накладывали пластырь с гипоксеном в дозе 1500 мг/кг массы тела животного в течение 1 мес., животным 4-й, 5-й, 6-й групп накладывали пластырь без ЛВ в течение 1 мес. площадью соответственно опытным группам. Животные 7-й и 8-й групп находились в эксперименте в течение 1 мес. под воздействием повреждающих доз ТГ (600 и 1500 мг/кг) и далее 1мес. без пластыря для оценки степени восстановления животного. 9-я и 10-я группы, соответственно, явились контролями для 7-й и 8-й опытных групп. 11-й и 12-й группам в течение 1 мес. вводили гипоксен внутрибрюшинно в дозах 11,8 мг/кг и 23,6 мг/кг субстанции в 5 мл/кг 0,9% раствора натрия хлорида, 13-й группе вводили изотонический раствор натрия хлорида 5 мл/кг.
В ходе эксперимента общее состояние животных оценивали по тесту «открытое поле» [2]. Еженедельно измеряли массу тела крыс. Через 1 мес. эксперимента у животных собирали суточную мочу, оценивали прозрачность, относительную плотность и реакцию мочи (рН), изучали микроскопический состав осадка. Спустя сутки крыс декапитировали и проводили биохимические, гематологические исследования крови, патологоанатомические (гистологические) исследования органов. Предварительно у животных определяли массу органов (печень, сердце, почки, надпочечники, селезёнка, тимус) [2]. Статистическую обработку результатов исследований проводили на ПЭВМ типа IBMPC/ATPentium-IV с использованием пакета прикладных программ StatGraphics 5.0.
Результаты исследования
Поведение животных опытной группы, получавшей ТГ в повреждающих дозах 600 мг/кг и 1500 мг/кг массы, достоверно отличалось от контрольной группыи группы сравнения в дозе 23,6 мг/кг по всем показателям. Была заметно снижена двигательная активность животных: уменьшилось количество стоек, побежек, время в центре, но достоверно увеличилось количество болюсов. Поведение группы животных, получавшей ТГ в дозе 75 мг/кг, достоверно отличалось от контроля по таким показателям как количество стоек, побежек, грумингу, а от группы в сравнения (в дозе 11,8 мг/кг) по всем показателям, кроме числа пересечённых квадратов и числа болюсов.
Анализ мочи показал наличие солей (уратов, оксалатов), лейкоцитов, эритроцитов (до 12-и) в группах животных, получавших ТГ в дозах 600-1500 мг/кг. В контрольных группах прослеживалась аналогичная тенденция. Моча была прозрачна соломенно-желтого цвета. Показатели относительной плотности и реакции мочи (рН) у животных опытных групп отличались незначительно. Отмена препарата в опытных группах в течение 1 мес. способствовала снижению патологически завышенных показателей, но в контрольных группах значимых изменений при этом не наблюдали.
Результаты биохимического анализа сыворотки крови животных (крыс-самцов), получавших трансдермальный гипоксен в дозах 75, 600, 1500 мг/кг представлены в таблицах 1 и 2.
Длительное применение трансдермального пластыря с гипоксеном в дозах 600 мг/кг и 1500 мг/кг, а также матрицы без ЛВ (контроль) в течение 1 мес. способствовало значительному повышению уровня общего билирубина, как у самцов, так и у самок. Данные изменения, вероятно, связаны с нарушением функции печени. Изменения выходили за пределы физиологических норм. Данный показатель в опытных группах полностью не восстанавливался в течение 1 мес. без ЛП в отличие от контрольных групп.
При применении в течение 1 мес. ТГ в дозах 600 мг/кг и 1500 мг/кг, а также в группах сравнения с дозами 11,8 мг/кг и 23,6 мг/кг наблюдали случаи значительного снижения уровня в крови общего холестерина относительно контрольных групп. После отмены препарата в течение 1 мес. в опытных группах с дозами 600 мг/кг и 1500 мг/кг уровень холестерина также был достоверно ниже контрольных значений.
В ходе эксперимента установлено, что содержание общего белка в опытных группах достоверно ниже, чем в контрольных группах. Содержание альбуминов не превышало содержания глобулинов, что отчётливо заметно по значению альбумин/глобулинового коэффициента (>1,0). Понижение уровня альбуминов, возможно, связано с повреждением печени. После отмены препарата уровень общего белка повышался незначительно и был достоверно ниже контрольных значений. Повышение уровня глобулинов свидетельствовало о протекающем воспалительном процессе.
Проведение исследования в течение 1 мес. позволило установить, что активность АлАТ опытных групп с дозами 75 мг/кг, 600 мг/кг, 1500 мг/кг, а также в группах сравнения достоверно ниже значений контрольных групп и практически не отличались от интактных значений. Через 1 мес. после отмены препарата активность АлАТ повышалась только в контрольных группах. Уровень АсАТ достоверно не отличался в опытных группах от групп сравнения. При применении трансдермальной формы гипоксена в течение 1 мес. наблюдали резкое снижение активности щелочной фосфатазы в опытных группах как по отношению к контролю, так и по сравнению с интактными значениями. Через 1 мес. после отмены препарата наблюдали тенденцию повышения активности фермента.
Таблица 1. Сравнительные результаты биохимического анализа сыворотки крови экспериментальных животных при трансдермальном и внутрибрюшинном введении гипоксена (17 группы)
ГРУППЫ 1 группа 2 и 3 группы, 75 мг/кг 4 и 5 группы, 600 мг/кг 6 и 7 группы, 1500 мг/кг
Показатели Интакт контроль опыт контроль опыт контроль опыт
Глюкоза, моль/л 14,53 ± 14,12 ± 13,47 ± 8,22 ± 7,02 ± 8,60 ± 7,37 ±
1,67 1,43 1,32# 0,42 0,25*° 0,36 0,29°
Билирубин 7,69 8,68 7,41 20,42 16,40 (гемолиз) 22,55 19,92
общий, ± ± ± ± ± ± ±
мкмоль/л 0,41 0,72 0,92 1,44 0,85*^° 0,88 1,87*^°
Холестерин, ммоль/л 2,48 ± 0,33 1,91 ± 0,15 1,72 ± 0,13 3,01 ± 0,11 1,79 ± 0,22*^ 2,55 ± 0,16 1,83 ± 0,39*
Общий 73,00 70,92 61,04 74,33 64,67 88,17 74,17
белок, ± ± ± ± ± ± ±
г/л 7,00 3,84 1,71*# 3,62 2,27*^° 4,27 4,99*
Альбумины, г/л 26,00 ± 29,06 ± 23,61 ± 34,83 ± 29,83 ± 34,00 ± 34,33 ±
2,50 2,29 2,84#* 3,14 3,35*^ 2,30 3,16^°
Глобулин, г/л 47,00 + 41,86 + 37,43 + 39,50 + 34,84 + 54,17 + 39,83 +
2,78 4,82 4,91# 5,58 3,60° 5,33 6,21*°
А/Г коэффициент 0,55 0,69 0,63 0,88 0,87 0,64 0,86
± 0,08 ± 0,12 ± 0,15# ± 0,17 ± 0,18^° ± 0,10 ± 0,18*^°
АлАТ, 1,45 1,35 0,94 1,49 0,92 1,74 1,19
мМ/л/час 0,08 0,39 0,16 *# 0,06 0,19*^ 0,1 1 0,33*^
АсАТ, 1,72 2,25 2,14 2,55 2,44 2,65 2,58
мМ/л/час 0,05 0,09 0,08 0,04 0,12° 0,08 0,13°
Щелочная 315,83 298,45 134 314 137,5 377,5 155,33
фосфатаза, мМ/л/час ± 14,81 ± 8,34 10,42# * ± 6,37 ± 6,04*^° ± 5,74 ± 7,87*^°
Мочевина, мМ/л 6,93 ± 8,69 ± 9,32 ± 9,12 ± 9,90 ± 9,43 ± 8,75 ±
1,47 0,35 0,31# 0,20 0,24^° 0,37 0,71°
Примечание: * (р<0,05) - достоверно относительно контроля; # (р<0,05) - достоверно относительно субстанции гипоксена в дозе 11,8мг/кг; ° (р<0,05) - достоверно относительно субстанции гипоксена в дозе 23,6 мг/кг; □ (р<0,05) - достоверно относительно пластыря с гипоксеном после отмены препарата
При клиническом анализе крови уровень эритроцитов в опытных и контрольных группах животных не превышал физиологические нормы. Но в отдельных случаях в опытной группе, получавшей гипоксен в повреждающей дозе 1500 мг/кг, наблюдался гемолиз эритроцитов, при
этом количество эритроцитов было достоверно ниже контрольных показателей и групп сравнения. Через 1 мес. после отмены препарата показатели двух опытных групп проявляли тенденцию к повышению количества эритроцитов.
Таблица 2. Сравнительные результаты биохимического анализа сыворотки крови экспериментальных животных при трансдермальном и внутрибрюшинном введении гипоксена (814 группы)
8 и 9 группы 10 и 11 группы
ГРУППЫ через 7 дней после отмены пластыря, 600 мг/кг через 7 дней после отмены пластыря, 1500 мг/кг 12 и 14 группы, внутрибрюшинное введение
Показатели контроль опыт контроль опыт контроль 11,8мг/кг 23,6мг/ кг
Глюкоза, ммоль/л 14,98 14,65 15,02 14,83 10,31 9,67 7,52
± ± ± ± ± + +
0,35 0,53 0,86 0,66 1,28 1,08 1,43*
Билирубин 6,57 11,08 6,43 11,35 6,35 10,50 6,24
общий, ± ± ± ± ± ± ±
мкмоль/л 0,50 0,50* 0,32 0,41* 0,96 0,28* 0,21
Холестерин, ммоль/л 1,93 ± 1,63 ± 2,09 ± 1,87 ± 2,82 ± 1,91 + 2,28 +
0,08 0,07* 0,09 0,06* 0,17 0,02* 0,24*
Общий 85,67 77,17 88,50 78,6 67,30 83,17 76,50
белок, ± ± ± ± ± ± ±
г/л 5,08 3,84* 1,96 3,23* 2,03 2,34* 1,10*
Альбумины, г/л 20,50 ± 27,33 ± 27,83 ± 24,33 ± 52,72 ± 56,67 + 45,50 +
1,96 2,27* 3,0 2,71 2,41 1,95 1,10*
Глобулин, г/л 65,17 ± 49,83 ± 60,67 ± 54,34 ± 14,58 ± 26,50 + 31,00 +
4,85 2,43* 3,68 3,49* ,52 2,73* 2,24*
А/Г 0,32 0,55 0,46 0,45 3,62 2,14 1,47
коэффициент ± 0,04 ± 0,04* ± 0,08 ± 0,07 ± 0,08 ± 0,05 ± 0,03*
АлАТ, мМ/л/час 2,03 ± 0,96 ± 1,98 ± 1,42 ± 1,93 ± 0,51 + 0,31 +
0,13 0,05* 0,06 0,08* 0,06 0,04* 0,09*
АсАТ, мМ/л/час 1,95 1,65 2,40 2,10 2,59 2,44 2,16
± ± ± ± ± + +
0,05 0,04* 0,06 0,05* 0,07 0,06 0,11
Щелочная 173,83 169,0 251,83 216,67 228,18 112,00 94,29
фосфатаза, мМ/л/час ± 4,67 ± 3,93 ± 5,61 ± 4,53* ± 4,14 ± 3,92* ± 3,91*
Мочевина, мМ/л 6,72 ± 7,17 ± 7,82 ± 6,93 ± 6,75 ± 7,12 ± 7,72 ±
0,32 0,42 0,37 0,29 0,51 0,27 0,20
Примечание: * (р<0,05) - достоверно относительно контроля; # (р<0,05) - достоверно относительно субстанции гипоксена в дозе 11,8мг/кг; ° (р<0,05) - достоверно относительно субстанции гипоксена в дозе 23,6мг/кг; □ (р<0,05) - достоверно относительно пластыря с гипоксеном после отмены препарата
В опытных группах крыс-самцов, получавших ТГ в дозах 600 мг/кг и 1500 мг/кг, отмечено снижение содержания гемоглобина, что может быть следствием снижения количества эритроцитов в крови за счёт гемолиза эритроцитов. Данные изменения для самок не характерны.
После месячного периода отмены уровень гемоглобина в опытных группах крыс-самцов достоверно повышался. У самок данный показатель достоверно не изменялся.
Значения СОЭ в опытных и контрольных группах достоверно не отличались друг от друга. При этом зафиксированы отдельные случаи (16,7%) резкого подъёма значений СОЭ до 16,0 в опытной группе животных, получавших гипоксен трансдермально в дозе 1500 мг/кг. При отмене препарата в течение мес. прослеживалась тенденция к снижению значений СОЭ во всех исследуемых группах.
В ходе эксперимента установлено, что общее количество лейкоцитов при применении трансдермального пластыря с гипоксеном в течение 1 мес. у крыс-самцов в дозе 600 мг/кг достоверно увеличивалось аналогично значениям контрольной группы. Период отмены в течение 1 мес. среди самцов способствовал восстановлению значений в опытной группе по отношению к интакту. В опытной и контрольных группах наблюдалось снижение количества эозинофилов по отношению к интактным значениям. После отмены препарата в течение 1 мес. в опытной группе, получавшей гипоксен в дозе 600 мг/кг, а также соответствующей ей контрольной группе прослеживалась тенденция к увеличению количества эозинофилов. Снижение количества эозинофилов обычно наблюдается в начальном периоде острых воспалительных процессов. Появление эозинофилов является хорошим прогностическим признаком.
В крови экспериментальных крыс зафиксированы колебания уровня нейтрофилов. В опытной группе, получавшей гипоксен трансдермально в дозе 1500 мг/кг, а также в контрольных группах отмечалась лимфоцитопения. При отмене препарата данный показатель в вышеуказанной опытной и соответствующей ей контрольной группе не увеличивался, а продолжал снижаться.
Длительное трансдермальное введение гипоксена у крыс-самцов в дозе 600 мг/кг в течение 1 мес. способствовало достоверному увеличению количества тромбоцитов относительно контрольных и интактных значений, что проявлялось в увеличение её вязкости. Также зафиксировано достоверное увеличение количества тромбоцитов по отношению к контрольным и интактным значениям в опытной группе крыс-самцов и самок, получавшей ТГ в дозе 1500 мг/кг. Через 1 мес. отмены препарата количество тромбоцитов в опытных группах не восстанавливалось, а в одной из контрольных групп резко повышалось.
При применении ТГ у животных опытных групп значение коэффициента массы сердца достоверно менее значений коэффициента групп сравнения с дозами субстанции гипоксена 11,8 мг/кг и 23,6 мг/кг.
Коэффициенты массы печени в опытных группах, получавших ТГ в дозах 75 мг/кг (самки), 600 мг/кг, 1500 мг/кг (самцы) достоверно превышали значения групп сравнения.
Применение ТГ в дозах 600мг/кг способствовало достоверному увеличению значений коэффициента массы тимуса относительно контрольных значений. Отмена препарата (в дозе 600 мг/кг) способствовала уменьшению значений коэффициента массы тимуса у самок. Значения коэффициентов массы тимуса во всех опытных группах достоверно превышали значения групп сравнения.
Трансдермальное введение гипоксена в дозе 600 мг/кг способствовало достоверному уменьшению значений коэффициента массы правого надпочечника относительно контрольных значений. В дозе 1500 мг/кг наоборот, прослеживалась динамика достоверного увеличения значений коэффициентов массы органа, относительно контроля. Значения данного коэффициента во всех опытных группах были достоверно ниже значений групп сравнения в дозах 11,8 мг/кг и 23,6 мг/кг. Значения коэффициента массы селезёнки во всех опытных группах значимо не отличались от контрольных, но в дозе 1500 мг/кг коэффициент массы достоверно меньше значений группы сравнения с дозой 23,6 мг/кг. Все вышеперечисленные изменения отсутствовали при применении ТГ в дозе 75 мг/кг.
Заключение
Таким образом, длительное применение трансдермального пластыря с гипоксеном в течение 1 мес. приводит к некоторым изменениям в организме лабораторных животных, вероятно, что данные колебания в крови экспериментальных животных связаны не только с длительным трансдермальным введением ЛВ в повреждающих дозах, но и влиянием компонентов матрицы пластыря. Так как кожа является органом иммунной системы, поэтому удаление значительного количества шерстного покрова животного может оказать негативное влияние на исследуемые параметры. Отмена препарата в течение 1 мес. не всегда способствовала восстановлению патологически завышенных или заниженных параметров.
При введении трансдермального гипоксена в дозе 75 мг/кг в течение 1 мес. исследуемые показатели достоверно не отличались от контрольных, а также значений группы сравнения, получавшей раствор гипоксена внутрибрюшинно в дозе 11,8 мг/кг. Трансдермальные дозы 600 мг/кг и 1500 мг/кг явились повреждающими, но не вызывали гибели животных. Гипоксен в дозе 1500 мг/кг оказывал значительное повреждающее воздействие, что было отмечено при исследовании показателей крови, мочи, коэффициентов масс органов и свидетельствовало о протекающем воспалительном процессе в печени, почках, сердце, мочевыводящих путях крыс.
Список литературы
1. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. - СПб.: Морсар A.B. - 2003. - 239 с.
2. Лосенкова С.О., Степанова Э.Ф. Конструирование и биофармацевтические исследования трансдермальных композиций с антигипоксантом // Вестн. нов.мед. технологий. - 2009. - Т.16, №3. - С. 135-137.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ // Под ред. Р.У. Хабриева. - М.: ОАО «Медицина», 2005. - 832 с.
