CC BY-ND
35
28
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ НАНОЧАСТИЦ SiO2 И TiO2 БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
И.А. Ирхина1, Е.Н. Кобзев12, В.П. Холоденко12, И.И. Мартовецкая1, В.А. Чугунов12
ASSESSING TOXICITY OF SiO2 AND TiO2 NANO-SIZE PARTICLES BY THE BIOLUMINESCENT ASSAY
I.A. Irkhina, E.N. Kobzev, V.P. Kholodenko, I.I. Martovetskaya, V.A. Chugunov
'ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора,
2Пущинский Государственный Университет
В ходе проведённых исследований была выявлена высокая биологическая активность всех исследованных суспензий наноматериалов: наноматериал «TiO2 рутил», а также два типа наночастиц SiO2 стимулировали свечение биосенсора, наноматериалы «TiO2 анатаз» и «TiO2, модифицированный марганцем» ингиби-ровали биолюминесценцию. Наиболее токсичным из исследованных образцов оказался наноматериал «TiO2, модифицированная марганцем», который уже при концентрации 0,03 мг/мл вызывал практически полное подавление биолюминесценции.
Ключевые слова: наночастицы TiO2 и SiO, токсичность, биолюминесценция, гормезис. In the research all suspensions of tested nanomaterials were found to be biologically highly active. Luminescence of the biosensor intensified by TiO2 rutile suspension and by suspensions of two nano-size kinds of SiO2, whereas it quenched in the presence of TiO2 anatase and manganese-modified TiO2 suspensions. The agent manganese-modified TiO2 was the most toxic and inhibited almost completely the bioluminescence even when applied in the concentration of 0,03 mg/ml. Keywords: TiO2 and SiO2 nano-size particles, toxicity, bioluminescence, hormesis.
Введение. Анализ современной научно-технической литературы, посвященной развитию различных нанотехнологий, свидетельствует о возрастающем понимании потенциальных опасностей их широкого применения.
Многие исследователи считают необходимым проведение комплексного изучения токсичности наноматериалов, включая экологическую токсичность, прежде чем использовать их в различных нанотехнологиях [1].
МАЙ №5 (218)
29
Все большее внимание обращается на использование биотестирования для оценки токсичности наноматериалов. Биотестирование позволяет исследовать различные реакции живых организмов при их контакте с наноматериалами, что дает возможность получать интегральную оценку их токсичности. Из существующего многообразия биотестов особое место занимают биотесты с использованием микроорганизмов. Эти методы отличают быстротой, высокой чувствительностью, относительно низкой стоимостью, простотой и доступностью используемого оборудования [2]. Широкое применение микробных биотестов обусловливается также тем, что микроорганизмы являются основным звеном глобальной трофической цепи, а также главной движущей силой биогеохимических циклов на нашей планете. Все это делает микробные биотесты приоритетным инструментом для оценки экологической токсичности наноматериалов.
Одним из наиболее перспективных биотестов с использованием микроорганизмов является биолюминесцентный метод. Биолюминесценция — свечение различных живых организмов (в т. ч. фотобактерий) — следствие окисления субстрата (люциферина) под действием фермента (люциферазы). Реакция сопровождается интенсивной световой эмиссией в видимой сине-зеленой области с широкой полосой спектра с максимумом 490—495 нм и интенсивностью свечения до 103—105 квант-сек-1 на клетку.
Спектры свечения бактерий не зависят от внешних условий, в тоже время интенсивность свечения чрезвычайно зависима от изменений факторов внешней среды, таких как химический состав, температура, рН и др. Неблагоприятные для фотобактерий условия, в т. ч. и наличие в среде разнообразных токсикантов, изменяют уровень биолюминесценции тем в большей степени, чем более токсично вещество. Механизм широкой чувствительности реакции бактериальной биолюминесценции к действию химически различных веществ и физических факторов до конца не изучен, тем не менее, в настоящее время биолюминесцентный метод широко используется в токсикологической практике для анализа интегральной токсичности объектов окружающей среды, а также оценки токсичности различных химических веществ, полимеров, материалов и изделий [3; 4].
Цель работы — изучение токсичности пяти видов наночастиц 8Ю2 и ТЮ2 биолюминесцентным методом.
Материалы и методы. Биолюминесценцию определяли с помощью прибора «Биотокс-10М» (ООО «НЕРА-С») с использованием в качестве биосенсора препарата «Эколюм», представляющий собой лиофилизированные люминесцирующие бактерии (ТУ 2639-23600209792—01).
В работе была исследована токсичность пяти видов наночастиц, полученных по каталогу «АШпсИ»:
— «8Ю2 аморфный» (размер частиц 10— 20 нм);
— «8Ю2 аморфный» (размер частиц 5— 15 нм);
— «ТЮ2 рутил» (игольчатого строения, размер 10x40 нм);
— «ТЮ2 анатаз» (шарообразной формы, диаметр 5 нм);
— «ТЮ2, модифицированный марганцем» (размер < 100 нм).
Для приготовления рабочей суспензии навеску наноматериала суспендировали в небольшом объеме дистиллированной воды, затем обрабатывали ультразвуком (10 КГц) в течение 15 мин для повышения дисперсности пробы. После диспергирования в суспензию разбавляли в 10 раз дистиллированной водой и оставляли на сутки при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Через сутки полученную суспензию центрифугировали при 12 000 об./мин в течение 15 мин. Надоса-дочную жидкость (обозначенную как «рабочая суспензия») использовали в экспериментах по исследованию токсичности наночастиц, предварительно доведя рН до оптимального для биолюминесценции значения (7,0—7,1). Полученная рабочая суспензия была достаточно устойчивой: не расслаивалась в течение 2 недель. Реальная концентрация наночастиц в рабочей суспензии определялась гравиметрическим методом.
Рабочую суспензию использовали для подготовки ряда разведений в дистиллированной воде (6—10 концентраций). Затем в каждое из разведений вносили суспензию биосенсора и измеряли интенсивность свечения. Подобные замеры повторяли через 15 и 30 мин, а также через 1, 2, 3, 4 и 5 ч.
На основе полученных данных по интенсивности свечения биосенсора для каждой пробы рассчитывали биолюминесцентный индекс (БЛИ) по формуле: БЛИ=1о/1к, где 1о —
30
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
интенсивность свечения в опытной пробе, 1к — интенсивность свечения в контрольной пробе (без наночастиц). В случае, если БЛИ находился в диапазоне 0,8—1,2 отн. ед., анализируемая проба оценивалась как нетоксичная (допустимо токсичная); при отклонении от контроля более чем на 20 %, но менее чем на 50 % (со значениями 0,8 > БЛИ > 0,5 или 1,5 > БЛИ > 1,2) пробы оценивали как «токсичные» и, наконец, в случае превышения этих порогов делали заключение о сильной токсичности анализируемых проб. Также были определены «эффективные концентрации» ЕС20 и ЕС50, которые вызывают ингибирование (либо стимулирование) свечения соответственно на 20 и 50 %.
Результаты исследований. В ходе исследований было обнаружено, что по своему воздействию на биолюминесценцию оба препарата диоксида кремния практически не различались. В связи с этим в дальнейшем будут приводиться данные только по одному препарату наночастиц — аморфному 8Ю2 с размером частиц 5—5 нм. После 15-минутного контакта с биосенсором водные суспензии 8Ю2 при всех проверенных концентрациях вызывали незначительное снижение свечения (БЛИ не опускался ниже 0,8). Однако, начиная с 30-минутной экспозиции, регистрировалось стимулирование свечения, которое возрастало с увеличением концентрации анализируемого препарата и времени контакта препарата с биосенсором. Наибольшее значение БЛИ (3,7—3,8) наблюдалось при максимальной использованной концентрации препаратов (1 мг/мл) и длительной экспозиции их с биосенсором (4—5 ч).
Считается, что стимуляция свечения также представляет собой одно из проявлений токсичности и обычно развивается как результат действия токсичных веществ с высокой липо-фильностью, в то время как гидрофильные вещества преимущественно вызывают эффект тушения биолюминесценции. В ходе наших экспериментов при 30-минутной экспозиции обоих препаратов наночастиц 8Ю2 значение ЕС20 соответствовало концентрациям 0,02 мг/ мл. При увеличении продолжительности контакта препарата с биосенсором эти значения уменьшались до 0,008 мг/мл при экспозиции 4 ч, которые не изменялись в дальнейшем (экспозиция 5 ч). Расчетные значения ЕС50 составили для 30-минутной и 5-часовой экспозиции 0,05 мг/ мл и 0,02 мг/мл соответственно. Таким образом, высокие значения БЛИ (> 1,5) в данном экспе-
рименте позволили сделать вывод о сильной токсичности образцов наночастиц SiO2.
Исследование влияния на биолюминесценцию водноИ суспензии наноматериала «TiO2 рутил» показало сходную картину: стимулирование свечения, возрастающее с увеличением концентрации наноматериала и времени контакта его с биосенсором.
Максимальное значение БЛИ (3,6) также достигалось при концентрации суспензии 1 мг/мл и длительной экспозиции его с биосенсором (4—5 ч). Расчетные значения ЕС20 и ЕС50 составили для 30-минутной экспозиции — 0,09 мг/мл и 0,21 мг/мл, а для 5-часовой экспозиции — 0,02 мг/мл и 0,18 мг/мл соответственно.
Водная суспензия наноматериала «TiO2 анатаз» при концентрации менее 0,8 мг/мл не вызывала существенного влияния на биолюминесценцию даже при максимальной экспозиции с биосенсором (5 ч) — значения БЛИ попадали в диапазон 0,8—1,2.
Однако при повышении концентрации до 1 мг/мл наблюдалось резкое ингибирование свечения, развивающееся со временем и приводящее к практически полному подавлению биолюминесценции через 4 ч. При 30-минутной экспозиции водная суспензия данного образца с концентрацией 0,8 мг/мл имела допустимую токсичность с БЛИ = 0,81, а с концентрацией 1 мг/мл являлась сильно токсичной (БЛИ = 0,47). Такое скачкообразное изменение БЛИ в узком диапазоне концентраций (от 0,8 до 1 мг/мл) вероятно связано с агрегированием свободных наночастиц при достижении их критической концентрации, что может существенным образом изменять и их биологическую активность, в данном случае — ингибировать биолюминесценцию. В связи с немонотонным изменением БЛИ в зависимости от концентрации было невозможно было рассчитать «эффективные концентрации» ЕС20 и ЕС50 для данного наноматериала.
Водная суспензия наноматериала «TiO2, модифицированный марганцем» вызывала сильное подавление свечения, которое усугублялось при увеличении концентраций препарата и времени взаимодействия с биосенсором.
Значения ЕС20 и ЕС50 для данного наноматериала составили для 30-минутной экспозиции 0,01 мг/мл и 0,02 мг/мл, а для 4-часовой экспозиции — 0,004 мг/мл и 0,01 мг/мл соответственно.
МАЙ №5 (218)
31
Обсуждение. Таким образом, результаты проведенного биолюминесцентного анализа продемонстрировали высокую биологическую активность всех исследованных наноматериалов. Оба наноматериала SiO2, а также наноматериал «TiO2 рутил» стимулировали свечение биосенсора. Наноматериалы «TiO2 анатаз» и «TiO2, модифицированный марганцем» ин-гибировали биолюминесценцию. Наиболее токсичным из всех исследованных образцов оказался наноматериал «TiO2, модифицированная марганцем», который уже при концентрации 0,03 мг/мл и 15-минутной экспозиции с биосенсором вызывал практически полное подавление биолюминесценции.
Ярко выраженное стимулирование люминесценции биосенсора суспензиями нанома-териалов, на наш взгляд, может быть связан с так называемым эффектом «гормезиса». Эффект гормезиса был отмечен ещё Парацель-сом, однако сам термин был введен С. Зонт-маном и Д. Эрлихом в 1943 г. Под гормезисом они понимали стимуляцию какой-либо системы организма внешними воздействиями, имеющими силу, недостаточную для проявления вредных факторов. Наиболее изучен радиационный гормезис, который является следствием воздействия ультраслабых излучений. Однако, в последнее время появляются данные о том, что гормезис могут вызывать токсины и лекарства [5]. Таким образом, стимуляция люминесценции, отмеченная в ходе наших исследований, может являться первичным откликом биосенсора на низкие концентрации токсичных веществ.
Также результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что параметры, которые используют для оценки токсичности (БЛИ, ЕС20, ЕС50), очень сильно зависят от продолжительности контакта образца с биосенсором. Причем динамика проявления воздействия наноматериала на светящиеся бактерии с соответствующим изменением активности их биолюминесцентной системы индивидуальна для каждого образца наноматериала. Как правило, в экотоксикологической прак-
тике рекомендуется 30-минутная экспозиция токсиканта с биосенсором, но, как видно из наших результатов, такая выдержка не всегда достаточна для выявления токсического эффекта [4]. Поэтому нам представляется целесообразным для более адекватной оценки токсичности наноматериалов биолюминесцентным методом прослеживать динамику развития токсического эффекта как минимум в течение 3 ч.
Таким образом, учитывая простоту, экс-прессность и низкую стоимость биолюминесцентного метода, можно сделать вывод о целесообразности его использования для предварительного экспресс-анализа токсичности наноматериалов. Результаты, полученные с его помощью, могут быть полезными в дальнейших, более углубленных исследованиях аналитиков-токсикологов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Handy R.D., Owen R., Valsami-Jones E. The ecotoxicology of nanoparticles and nanomaterials: current status, knowledge gaps, challenges, and future needs //Ecotoxicology. 2008. V. 17. № 5. P. 315—325.
2. Фомченков В.М., Ирхина И.А., Новиков И.А., Гуров Б.Н., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Исследование интегральной токсичности водной среды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, с использованием бактериальных тестов //Прикладная биохимия и микробиология 2000. Т 36. № 6. С. 656—660.
3. Зарубина А.П., Мажуль М.М., Новоселова Л.А., Гапочка М.Г. Бактериальный люминесцентный биотест. //Ж. Сенсор. 2005. № 3. С. 14—21.
4. МР № 01.018-07. Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощь биотеста «Эколюм».
5. Calabrese E.J., Hoffmann G.R., Stanek E.J., Nascarella M. A. Hormesis in high-throughput screening of antibacterial compounds in E coli //Hum. Exp. Toxicol. 2010. V. 29. P. 667—677.
Контактная информация:
Кобзев Евгений Николаевич , Тел.8(4967)36-00-68, e-mail: [email protected]
Contact information:
Kobzev Evgeniy Nikolaevich, td.: 8(4967)36-00-68 , e-mail: kobzev [email protected]
