CC BY
61март -
ап рел ь 2012
УДК 541.64:678.745.842:541.697
Исследование токсичности
in vitro и in vivo полиакриламида и некоторых
анионных сополимеров акриламида
Соловский М.В.1, Еропкин М.Ю.2, Еропкина Е.М.2, Смирнова М.Ю.1, Белохвостова А.Т.3
1 УРАН Институт высокомолекулярных соединений РАН, г С.Петербург
2 ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ, г С.-Петербург
3 НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития РФ, г. С.-Петербург
Синтезированы полиакриламид с молекулярной массой 29000 Да и анионные сополимеры акриламида с акриловой кислотой и с 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислотой с молекулярными массами 20000-47000 Да, содержащие 20,1-32,5 мол.% анионоген-ных групп. Исследована токсичность полученных полимеров в опытах in vitro (на культуре фибробластов легкого эмбриона человека) и in vivo (на белых мышах при внутрибрюшинном введении).
Ключевые слова: полиакриламид, акриловая кислота, 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислота, сополимеры акриламида, токсичность in vitro, острая токсичность.
Введение. Гидрофильные гели на основе полиакриламида широко используются для иммобилизации в них различных биологических веществ (БАВ), а линейные реакцион-носпособные сополимеры акриламида (АА) - для модификации БАВ белковой природы [1,2]. В то же время в литературе практически отсутствуют количественные данные о токсичности полиакриламида и сополимеров АА - этого важного класса гидрофильных полимеров медико-биологического назначения.
Цель работы - исследовать цитотоксичность полиакриламида, некоторых анионных сополимеров акриламида и дать ей количественную характеристику. В некоторых случаях токсичность полимеров in vitro была сопоставлена со значениями DL50, определенными на мышах при внутрибрюшинном введении. В качестве анионных сополимеров АА были синтезированы сополимеры АА с акриловой кислотой (АК) и с 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислотой (ААМПСК) - потенциальные носители БАВ.
Материалы и методы исследования. Химические методы. Полиакриламид, сополимеры АА с АК и АА с ААМПСК получали путем гетерофазной радикальной (со)полиме-ризации (со)мономеров в запаянных ампулах в атмосфере аргона. Процесс проводили в абсолютизированном изопропаноле при 50 °С в присутствии инициатора азоизобутиро-нитрила. Состав сополимеров регулировали изменением состава исходной смеси мономеров, а молекулярную массу (ММ) - изменением концентрации исходной мономерной смеси. После окончания (со)полимеризации ампулу вскрывали, выпавший в осадок полимер многократно обрабатывали ацетоном ЧДА и сушили в вакууме. Выход полимеров достигал 98-99%. Состав сополимеров АА-АК определяли потенциометрическим титрованием карбоксильных групп на титраторе «PH-673». Состав сополимеров АА-ААМПСК устанавливали по данным элементного анализа на содержание серы. Характеристическую
вязкость полимеров АА [Г)] измеряли в вискозиметре Уббелоде при 30 °C в 1н растворе ЫаЫОз в воде. Среднемассовые молекулярные массы полученных полимеров (Mw) рассчитывали по уравнению [IJ] = 3,73 ■ 10-4 ■ Mw"0,66 , известному для полиакриламида [3]. Все полимеры хорошо растворялись в воде. w
Токсикологические методы in vitro. Цитотоксичность полиакриламида, сополимеров АА-АК, АА-ААМПСК разного состава определяли по их действию на митохондриаль-ные дыхательные ферменты фибробластов легкого эмбриона человека по ранее описанной методике [4]. Показателем цитотоксичности служила концентрация препарата IC50 в мг/мл, подавляющая жизнеспособность этих клеток на 50% по сравнению с интактным контролем. Значения IC50 для полимеров АА вычисляли по уравнениям линейной регрессии. Линеаризацию данных и вычисление параметров уравнений регрессии производили в программе Exel 2003.
Токсикологические методы in vivo. Острую токсичность полиакриламида и анионных сополимеров АА исследовали на белых нелинейных мышах-самцах при внутрибрюшин-ном введении в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздрав-соцразвития России от 23 августа 2010 г. №№ 708н). Значения DL5o рассчитывали по методу Кербера. Все полученные данные были обработаны статистически. Для определения достоверности межгрупповых различий результаты проанализированы с помощью критерия Стьюдента. Различия определялись при 0,05% уровне достоверности.
Результаты и обсуждение. Приведем формулы исследованных полимеров:
24
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
СН2-СН
С=0
Ж
т,
сн2-сн-
С=0 Ш2
ш
т,
I: полиакриламид;
II: сополимер АА-АК (т + т2 = 100 мол.%); III: сополимер АА-ААМПСК (т, + т2 = 100 мол.%)
сн2-
:н
с=о
ж
т,
II
СН,-
:н
с=о
от
Н3С — с — сц сн,
8СШ
т,
СН2-СН
соон
т,
Таблица
Токсичность полиакриламидов и анионных сополимеров акриламида
Полимер 1С50 мг/мл мг/кг
Наименование т2 мол.% ММОА
Полиакриламид 100 29000 18,74 ± 2,10 > 5000
Сополимер АА-АК 19,1 29000 10,75 ± 1,02
21,7 24000 11,8 ± 0,3 4900 ± 460
20,1 40000 10,1 ± 2,21
18,8 28000 9,9 ± 0,6
31,1 47000 6,6 ± 1,12
32,5 20000 6,8 ± 1,02 > 5000
Сополимер АА-ААМПСК 22,8 28000 16,3 ± 4,3 > 5000
18,5 37000 17,8 ± 3,2
25
март -
ап рел ь 2012
В таблице приведены показатели токсичности in vitro и in vivo полиакриламида и сополимеров АА-Ак, АА-ААМПСК. Как следует из таблицы, наименьшей цитотоксично-стью, т. е. наибольшим значением IC50, характеризуется полиакриламид. Для него найдено и высокое значение DL50 (> 5000 мг/кг). По классификации токсических веществ при парентеральных способах введения [5] его можно отнести к малотоксичным веществам. Для сополимеров АА-АК близкого состава (19-22 мол.%) найдены близкие (9,9-11,8 мг/ мл) показатели IC50, но несколько меньшие, чем у полиакриламида. В то же время эти сополимеры характеризуются таким же высоким, как полиакриламид, значением DL5o (4900 мг/кг) и поэтому также малотоксичны.
Увеличение содержания звеньев АК в сополимерах АА-АК до 31,1-32,5 мол.% приводит к заметному снижению значений IC50 (до 6,6-6,8 мг/мл), что связано с «закисле-нием» среды в результате диссоциации значительного числа карбоксильных групп сополимеров, а не с резким увеличением их цитотоксичности. Это подтверждает найденное для этих сополимеров высокое, как и у сополимеров с меньшим содержанием звеньев АК, значение DL^. Из таблицы видно, что сульфосодержащие сополимеры АА-ААМПСК характеризуются меньшей цитотоксичностью, чем карбоксилсодержащие сополимеры АА-АК близкого состава. В ряду исследованных сополимеров АА цитотоксичность сополимеров не зависит от их ММ. Проведенный анализ данных таблицы показывает, что полиакриламид и все полученные сополимеры АА могут быть отнесены к категории малотоксичных веществ [5]. Этот факт также свидетельствует о том, что все синтезированные полимеры АА не содержат примесей токсичного мономерного акриламида.
Низкая токсичность всех исследованных сополимеров АА в сочетании с найденными для них низкими значениями ММ, растворимостью в воде и достаточно высоким содержанием реакционноспособных карбоксильных или сульфогрупп делает их перспективными для использования в качестве носителей низкомолекулярных БАВ катионной природы.
Выводы. 1. Синтезированы водорастворимые полимеры: полиакриламид (ММ 29000 Да) и относительно низкомолекулярные (ММ 20000-47000 Да) сополимеры акри-ламида с акриловой кислотой и с 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислотой, содержащие 20,1-32,5 мол.% ионогенных групп.
2. На основании проведенных токсикологических исследований установлено, что все полученные полимеры акриламида относятся к категории малотоксичных веществ.
список литературы
1. 1. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах модификации и иммобилизации природных соединений. - М.: Наука, 1984. - 261 с.
2. 2. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. - М.: Химия, 1986. - 294 с.
3. 3. Энциклопедия полимеров. - М.: Изд-во «Советская энциклопедия» (под ред. В.А. Кар-гина), 1972. - Т. I. - С. 30.
4. 4. Еропкин М.Ю., Соловский М.В., Еропкина Е.М., Шульцева М.Л. Сравнительное иссле-
дование цитотоксического действия полимерных производных антибиотиков-аминогликози-дов // Токсикологический вестник, 2006. - № 5. - С. 18-21.
5. 5. Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журн. - 2003. - Т. 37. - № 3. - С. 32-34.
Solovskiy M.V.1, Yeropkin M.Yu.2, Yeropkina Ye.M.2, Smirnova M.Yu.1, Belokhvostova A.T.3
In vitro and in vivo studies of toxicity of polyacrylamide and certain acrylamide anionic copolymers
'Institute of High Molecular Compounds , Russian Academy of Sciences, 2Institute of Influenza, Ministry of Health and Social Development 3 N.N.Petrov Institute of Oncology, St.Petersburg
Polyacrylamide with M,29000 Da and acrylamide anionic copolymers were synthesized with acrylic acid and 2-acrylamido -2-methylpropan-sulfonic acid having M, 20000-47000 Da and anionic copolymers with acrylic acid having molar masses 20000-47000 Da which contained 20.1-32.5. mol% of anionogenic groups. The toxicity of the polymers obtained was studied in vitro (cell culture of human fetal lung fibroblasts) and in vivo (white mice, intra-peritoneal administration)
Материал поступил в редакцию 26.01.2011 r.
26
