CC BY
43УДК 504.5:581.5:547.5
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ВОДНЫЕ РАСТЕНИЯ
© 2010 г. Г.Г. Борисова, М.Н. Кислицина, Н.В. Чукина
Уральский государственный университет, г. Екатеринбург
Ключевые слова: водные объекты, загрязнение водных объектов, фенольные соединения, водные макрофиты, Elodea densa, токсичность, фенол, пирокатехин, резорцин, гидрохинон, полифенолоксидаза, флавоноиды, перекисное окисление липидов.
Представлены материалы модельных исследований по оценке влияния экзогенных фенольных соединений на анатомо-морфологические и биохимические показатели водных растений (на примере Elodea densa). В результате проведенных исследований установлено, что наиболее токсичными являются резорцин и пирокатехин. Показано, что выявление ответных реакций водных растений на действие фенольных соединений необходимо для прогнозирования их трансформации в водных объектах и разработки технологий фиторемедиации.
Фенольные соединения (ФС) — вещества ароматической природы, содержащие одну, две или несколько гидроксильных групп у ароматического кольца.
Присутствующие в поверхностных водах ФС по происхождению можно разделить на три группы: компоненты промышленных сточных вод и поверхностного стока, поступающие в результате первичного загрязнения; продукты, образующиеся в ходе процессов вторичного загрязнения; биогенные фенольные соединения, образуемые гидробион-тами [1].
ФС относят к числу наиболее опасных и распространенных загрязняющих веществ в водных объектах России [2]. Они нарушают естественный круговорот органических веществ в водоемах и водотоках и ухудшают условия функционирования большинства гидробионтов.
Концентрации фенольных соединений в поверхностных водах нередко многократно превышают значения предельно допустимых концентраций (ПДК) для водных объектов рыбохозяйственного назначения. Так, в морской части устья р. Урал концентрации фенолов достигали 0,030 мг/л (30 ПДК) [3]. По данным работы [4], на территории Свердлов-
*Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК П2364.
Водное хозяйство России
ской области наибольшая концентрация фенолов наблюдалась в бассейне р. Тавда: в створе ниже г. Новая Ляля их содержание составляло 13 ПДК. Согласно данным государственного мониторинга [5], за последние годы повторяемость случаев превышения ПДК по фенолам в водах рек Свердловской области: Исеть, Пышма и Чусовая варьировалась от 10— 29 до 50—100 %.
По объему, концентрации, токсичности и трудности очистки фенол-содержащие сбросы занимают среди стоков многих производств одно из первых мест [6].
Фенолы используются для дезинфекции, изготовления клеев и фе-нолформальдегидных пластмасс; они входят в состав выхлопных газов бензиновых и дизельных двигателей; присутствуют в больших количествах в сточных водах нефтеперерабатывающих, лесохимических, ами-нокрасочных и ряда других предприятий. Высокими концентрациями этих соединений отличаются сточные воды коксохимических производств, в которых уровни содержания летучих фенолов достигают 250— 350 мг/л, многоатомных фенолов — 100—140 мг/л.
В продуктах термического разложения каменных углей содержатся преимущественно фенол и его моно- и диалкилпроизводные — кре-золы и ксиленолы. Содержание полифенолов ограничено небольшой долей резорцина и пирокатехина. В продуктах пирогенной переработки бурых углей и торфа содержание и набор многоатомных фенолов увеличиваются за счет производных пирокатехина [6]. В продуктах термического разложения горючих сланцев содержание многоатомных фенолов, в частности, резорцина и его алкилпроизводных, доходит до 80—94 % от суммарной смеси фенолов [7]. Кроме того, источником поступления фенолов в водоемы и водотоки служат сточные воды целлюлозно-бумажных комбинатов, содержащие лигнин. В водном гидролизате лигнина обнаружено более 20 различных фенолов [8].
В самоочищении водных объектов от органических соединений, в том числе от ФС, участвуют следующие группы факторов [9]:
— гидродинамические (смешение, разбавление);
— физико-химические (химическое окисление, превращения веществ, коагуляция, сорбция, хемоседиментация);
— биологические (биохимические превращения, биологическое окисление, фотосинтез, фильтрация).
Многими авторами отмечено [10—15], что некоторые высшие и низшие водные растения могут активно участвовать как в процессах самоочищения водных объектов, так и очистке сточных вод от поллютантов антропогенного происхождения, в том числе от фенолов. Эту положи-
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
тельную роль водных растений обусловливает суммарный результат нескольких процессов, таких как:
— улучшение кислородного режима водных объектов за счет фотосинтетической деятельности;
— создание благоприятных условий для развития как эпифитных, так и обитающих в водной среде микроорганизмов;
— снижение концентрации токсикантов в воде за счет их аккумуляции в корневых системах;
— метаболизация загрязняющих веществ непосредственно в растительных клетках с участием ферментных систем или их трансформация под действием биологически активных метаболитов, выделяемых растениями в среду обитания.
Воздействие первых двух факторов является косвенным, а другие связаны с непосредственным участием водных макрофитов в элиминировании токсикантов. Очевидно, в реальных условиях имеет место комплексное действие факторов с преобладающим эффектом того или иного.
К настоящему времени механизмы действия экзогенных ФС на функционирование растений и их вторичный метаболизм изучены слабо, в литературе имеются лишь единичные сведения по этому вопросу [6, 16].
В связи с этим целью данной работы было исследование в модельных условиях влияния различных ФС на некоторые биохимические (активность фермента полифенолоксидазы, содержание флавоноидов, интенсивность перекисного окисления липидов) и анатомо-морфологичес-кие показатели Elodea densa Planchón.
Объекты и методы исследований
Elodea densa — погруженный в воду, заносный многолетний макро-фит, растущий в водоемах и водотоках со стоячей или медленно текущей водой. Растение имеет ветвистые длинные стебли, листья по 3—6 в мутовке линейно-ланцетные, лист достигает 25 мм длины и 2—5 мм ширины. Элодея может формировать очень плотные заросли. Родиной этого растения является Южная Америка, но оно распространилось по водным объектам всего мира. Известно, что Elodea densa обладает способностью к биотрансформации тринитротолуола [16], однако сведения о взаимодействии элодеи с другими ФС отсутствуют.
Для исследования влияния ФС на биохимические показатели водных макрофитов были взяты пять сосудов объемом 3 л. В каждый сосуд помещали по три растения Elodea densa и в течение двух суток инкубировали в дистиллированной воде с добавлением монофенола, гидрохинона,
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
пирокатехина и резорцина, соответственно. Концентрация каждого из экзогенных ФС составляла 1 мг/л. Контролем служили растения, инкубированные в дистиллированной воде.
Определение активности полифенолоксидазы (ПФО) в листьях растений проводилось объемным методом с использованием аскорбиновой кислоты [17].
Содержание флавоноидов определялось спектрофотометрически после проведения реакции, основанной на способности флавоноидов реагировать с лимоннокислым борным реактивом с образованием окрашенного комплекса [18]. Для максимального извлечения флавоноидов из биологического материала использовался раствор 96 % этанола с 1 % тритоном Х-100, способным извлекать из мембранных структур не растворимые в воде соединения.
Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) определялась спектрофотометрическим методом, основанным на способности продуктов ПОЛ реагировать с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [19].
Каждое определение проводилось в усредненной пробе листьев в трех биологических и трех аналитических повторностях.
Для исследования влияния ФС на анатомо-морфологические параметры растений верхушки побегов Elodea densa длиной 6 см помещались в сосуды с 5 % средой Хогланда. Сосуд № 1 использовался в качестве контроля, а в остальные сосуды был добавлен гидрохинон в концентрации 0,1; 1,0 и 10 мг/л, соответственно. Растения инкубировали в среде с гидрохиноном в течение 60 дней при естественном освещении. Новые побеги, которые сформировались за этот период, были зафиксированы в 3,5 % растворе глутарового альдегида для последующего определения анатомо-морфологических показателей листа.
Размеры клеток верхнего и нижнего эпидермиса определялись с использованием компьютерной установки и программного обеспечения Siams Mesoplant в 30-кратной повторности.
Математическая обработка данных осуществлялась при помощи программ MS Excel, Statistica 6.0. Достоверность результатов оценивалась при уровне значимости р < 0,05. Для оценки достоверности различий использовался непараметрический критерий Манна—Уитни.
Результаты и их обсуждение
Известно, что в условиях загрязнения водных экосистем у макрофи-тов формируются защитные механизмы, благодаря которым исключается проникновение поллютантов в клетку, либо осуществляется их де-токсикация, которая способствует активизации ряда ферментов, в том
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
Таблица 1. Активность полифенолоксидазы, содержание флавоноидов и содержание ТБК-реагирующих продуктов в листьях Elodea densa при инкубировании в водной среде с различными фенольными соединениями
Вариант опыта Активность полифенолоксидазы, мкМ/г сухой массы-мин Содержание флавоноидов, мг/г сухой массы Содержание ТБК-реагирующих продуктов, мМ/г сухой массы
Контроль 224,5±17,7 67,1±4,5 0,37±0,02
Монофенол, 1 мг/л 164,8±11,9 50,7±3,7 0,38±0,04
Гидрохинон, 1 мг/л 140,3±6,1 88,3±13,4 0,36±0,02
Пирокатехин, 1 мг/л 100,8±0,0 41,8±3,3 0,26±0,03
Резорцин, 1 мг/л 99,2±4,7 51,2±3,9 0,30±0,02
Примечание: ± ошибка среднего.
числе полифенолоксидазы (ПФО), или дифенолоксидазы. ПФО (1.14.18.1) ( медьсодержащий фермент, обладающий монофенолазной и дифенолазной активностью. Считается, что этот фермент окисляет ор-тодифенолы, но не активен в отношении пара- и метадифенолов [6].
Как показали наши исследования, все экзогенные ФС в концентрации 1 мг/л оказывали токсичное действие на Elodea densa, что проявлялось в снижении активности ПФО в ее листьях по сравнению с контролем (табл. 1). Однако степень токсичности исследованных ФС различалась, что можно объяснить их физико-химическими особенностями. Наибольшее снижение активности ПФО в листьях элодеи происходило под влиянием пирокатехина и резорцина (на 55 и 56 %, соответственно), наименьшее — при добавлении монофенола и гидрохинона (на 27 и 37 %, соответственно). Известно, что монофенол является летучим соединением и очень легко подвергается биохимическому окислению. Очевидно, что на вторые сутки инкубирования значительная часть монофенола была элиминирована из водной среды, поэтому его фактическая концентрация в среде была существенно ниже 1 мг/л. Подтверждением этому служат проведенные нами ранее эксперименты с инкубированием растений в водной среде с разными концентрациями монофенола. В результате этих экспериментов установлено, что при исходной концентрации в воде не только 1 мг/л, но и 10 мг/л, монофенол не обнаруживался уже через 7 суток (даже в контрольных вариантах, при отсутствии растений).
Характерной реакцией высших растений на действие абиотических стрессоров является накопление флавоноидов (природные биологически активные соединения, представляющие собой гетероциклические со-
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
единения с атомом кислорода в кольце) в различных компартментах растительной клетки. Флавоноиды в растительных организмах выполняют целый ряд функций, включая и защитную. Значительное повышение концентрации флавоноидов может свидетельствовать о наличии негативного воздействия на организм растения [20]. Как правило, в растениях, способных адаптироваться к действию стрессора, наблюдается более значительное их накопление по сравнению с растениями, отличающимися низкой резистентностью и, соответственно, слабой адаптивной реакцией.
Содержание флавоноидов в листьях элодеи за двое суток инкубирования в вариантах с пирокатехином, резорцином и фенолом понизилось на 38; 23 и 24 %, соответственно, в варианте с гидрохиноном — возросло на 32 % по сравнению с контролем (табл. 1).
Такое поведение флавоноидов можно объяснить, исходя из физико-химических особенностей исследованных ФС. Известно, что пирокатехин обладает слабой летучестью, вследствие чего его элиминация из среды инкубирования выражена значительно слабее, чем у монофенола. Кроме того, пирокатехин способен образовывать промежуточные продукты окисления, в частности, бензохиноны, которые обладают несопоставимо более высокой реакционной способностью, чем соответствующие им ФС. Хиноны с большой скоростью вовлекаются в реакции присоединения, окислительной конденсации или окислительно-гидролитического распада с различными веществами, находящимися как в водных растениях, так и в окружающей их среде, включая ФС, вследствие чего происходит снижение их токсичности. Вместе с тем, при высоких концентрациях токсикантов в среде обитания повреждаются сами растения, а также ослабляется их способность удалять ФС. При этом угнетение физиологических процессов макрофитов проявляется тем сильнее, чем интенсивнее идет превращение ФС в хиноны [6].
В нашем исследовании содержание флавоноидов в листьях Elodea densa, инкубированной с пирокатехином, уменьшилось на 38 %, по сравнению с контролем, активность ПФО упала на 55 %.
Существенную роль в откликах растений на действие неблагоприятных факторов играют липиды, участвующие в адаптационных механизмах клеток как непосредственно, так и через многообразные метаболические пути. Одной из универсальных реакций на изменение условий обитания, включая загрязнение, является индукция свободнорадикаль-ных процессов и, в частности, перекисного окисления липидов. В результате активации ПОЛ в клетке накапливаются гидропероксиды, диеновые конъюгаты, кетодиены, ТБК-реагирующие продукты, шиффо-вы основания, обладающие выраженным токсическим эффектом [1].
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
Как показали исследования (табл. 1), в листьях Elodea densa, инкубированной с пирокатехином, не только упала активность ПФО и уменьшилось содержание флавоноидов, но и снизилась интенсивность ПОЛ (на 30 %).
Снижение ПОЛ по сравнению с контролем, вероятно, свидетельствует о частичном разрушении ТБК-реагирующих продуктов под действием пирокатехина, в результате чего они были обнаружены в меньшем количестве, чем было образовано в действительности. Все это свидетельствует о высокой токсичности пирокатехина для данного растения.
Хиноидный путь — лишь один из возможных путей проявления токсичности ФС. Как было уже отмечено, содержание флавоноидов в листьях Elodea densa, инкубированной с резорцином, уменьшилось на 23 % по сравнению с контролем, активность ПФО упала на 56 %, интенсивность ПОЛ снизилась на 19 % (табл. 1). Следовательно, резорцин оказывал не менее токсичное действие на Elodea densa, чем пирокатехин. Известно, что резорцин не подвергается окислению ПФО, то есть токсическое действие резорцина не связано с образованием хинонов. Имеются данные [6], что некоторые ФС токсичны для растений из-за повышенных электроноакцепторных свойств в связи с их способностью образовывать хелатные комплексы и выступать в роли денатурирующих агентов или биологических депрессантов. Очевидно, в некоторых случаях фитотоксичность ФС может отражать суммарный эффект, который определяется одновременно различными свойствами молекулы. Вопрос о том, какие именно свойства резорцина лежат в основе его фитотоксичности, остается не совсем ясным.
Содержание флавоноидов в листьях Elodea densa, инкубированной с гидрохиноном, возросло на 32 %, по сравнению с контролем, активность ПФО уменьшилась на 37 %, интенсивность ПОЛ осталась на уровне контроля. Физико-химические свойства гидрохинона сходны с некоторыми свойствами резорцина, однако, судя по увеличению содержания флавоноидов в листьях растений, гидрохинон является менее токсичным для Elodea densa по сравнению с другими ФС.
Подтверждением этому служат проведенные нами эксперименты с инкубированием Elodea densa в течение двух месяцев с разными концентрациями гидрохинона. Было обнаружено, что данное растение проявляло резистентность к гидрохинону: при всех концентрациях токсиканта был отмечен интенсивный рост новых побегов (табл. 2). При концентрации гидрохинона 10 мг/л прирост побегов элодеи за два месяца был в 3 раза выше по сравнению с контролем. Площадь поверхности и объем клеток в завершивших рост и дифференцировку функционально активных листьях средней части вегететативных побегов Elodea densa также возрастали с увеличением концентрации гидрохинона.
водное хо;
Водное хозяйство России
Таблица 2. Анатомо-морфологические параметры побегов Elodea densa, выросших при различных концентрациях гидрохинона
Показатель, Контроль Концентрация гидрохинона, мг/л
единицы измерения 0,1 1,0 10,0
Площадь поверхности клетки листа, тыс. мкм2 Объем клетки листа, тыс. мкм3 Прирост побегов, см 12,30±0,81 120,62±12,53 2,50±0,61 15,76±0,86 165,61±14,33 5,20±1,17 22,70±1,18 285,70±25,74 5,50±0,76 22,11±1,75 304,00±36,83 7,30±0,34
Примечание. ± ошибка среднего.
Следует отметить, что, согласно имеющимся в литературе данным [6], интенсивный рост побегов в присутствии ФС был отмечен и на Elodea canadensis. Известно, что для обеспечения длительной вегетации элодеи канадской необходимо поступление извне органических веществ, пусть даже таких, как фенолы.
Интенсивные исследования детоксикационных способностей растений, проводимые в разных странах, наглядно показывают возможность эффективного использования растительности для создания ряда качественно новых фитотехнологий. Однако подавляющая часть исследований, проводимых в этом направлении, посвящена изучению роли растений в аккумуляции и детоксикации тяжелых металлов, в то время как по органическим поллютантам в литературе имеются лишь разрозненные сведения.
Проведенные нами исследования по выращиванию элодеи в среде с гидрохиноном, в результате которых отмечены усиление прироста побегов и увеличение размеров клеток, свидетельствуют о способности водных растений не только адаптироваться к высоким концентрациям в воде некоторых ФС, но и использовать их в процессе своей жизнедеятельности.
Для повышения эффективности биологической очистки или доочи-стки вод от ФС необходимо знать, для какой конкретной ситуации и каких токсикантов, использование каких видов макрофитов окажется оптимальным.
Следует отметить, что ФС обладают синергическим эффектом при воздействии на объекты окружающей среды: совместное токсическое
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
действие нескольких соединений может превышать сумму эффектов отдельных соединений [1]. Поэтому при разработке фиторемедиационных технологий, направленных на очистку вод от ФС, необходимо также учитывать их совместный эффект.
Выводы
Таким образом, проведенные исследования показали следующее:
1. Под действием всех исследованных экзогенных фенольных соединений активность ПФО в листьях Elodea densa снижалась по сравнению с контролем.
2. Изменения, вызванные действием фенольных соединений на содержание флавоноидов в листьях элодеи, оказались неоднозначными: инкубирование растений в присутствии большинства экзогенных ФС привело к снижению содержания флавоноидов, в то время как под влиянием гидрохинона их количество возрастало. Значения анатомо-мор-фологических показателей побегов, выросших в присутствии гидрохинона, также увеличились.
3. При инкубировании Elodea densa с фенолом и гидрохиноном интенсивность ПОЛ не изменялась, тогда как при инкубировании с резорцином и пирокатехином происходило снижение содержания ТБК-реаги-рующих продуктов.
4. На основании полученных данных можно заключить, что пирокатехин и резорцин более токсичны для растений по сравнению с монофенолом и гидрохиноном.
5. Выявление биохимических основ взаимовлияния водных растений и ФС представляется важным для понимания роли макрофитов в процессах самоочищения водных объектов, для разработки научно обоснованных методов интенсификации фиторемедиационных технологий и для прогнозирования трансформации ФС в водоемах и водотоках.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Моисеенко Т.И. Водная экотоксикология: Теоретические и прикладные аспекты. М.:
Наука, 2009. 400 с.
2. Вода России. Экосистемное управление водопользованием / под ред. А.М. Черняева;
ФГУП РосНИИВХ. Екатеринбург: Изд-во «АКВА-ПРЕСС», 2000. 356 с.
3. Общая экология: уч. пос. / под ред. А.С. Степановских [и др.]. М.: ЮНИТИ, 2000.
510 с.
4. Водные ресурсы Свердловской области / под ред. Н.Б. Прохоровой; ФГУП РосНИ-
ИВХ. Екатеринбург: АМБ, 2004. 432 с.
5. Государственный доклад о состоянии окружающей среды и влиянии факторов среды
обитания на здоровье населения Свердловской области в 2008 году. Екатеринбург: Изд-во Урал. ун-та, 2009. 354 с.
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
6. Кирсо У.Э., Стом Д.И., Белых Л.И., Ирха НИ. Превращение канцерогенных и ток-
сических веществ в гидросфере. Таллин: Валгус, 1988. 271 с.
7. Лилле Ю.Э., Кундель Х.А. Добыча и переработка горючих сланцев. Вып. 16. Л.: Не-
дра, 1967. 250 с.
8. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины. М.: Лесн. пром-сть,
1978. 368 с.
9. Попов А.Н., Сапрыкина А.Ю. Влияние физико-химических и биохимических факто-
ров на процессы деградации водорастворимой фракции нефти в воде // Водное хозяйство России. 2002. Т. 4. < 6. С. 530—536.
10. Винберг Г.Г., Сивко Т.Н. Участие фотосинтезирующих организмов планктона в про-
цессах самоочищения загрязненных вод // Гидробиология и ихтиология внутренних водоемов Прибалтики. Рига. 1963. С. 34—39.
11. Телитченко М.М. О возможности управления процессами самоочищения биологиче-
скими методами // Теория и практика биологического самоочищения загрязненных вод. М. 1972. С. 29—34.
12. Филимонова Н.А. Бактериопланктон и бактериальный перифитон в различных биотопах Сямозера // Микробиология. 1965. Т. 34. № 1. С. 133—139.
13. Кузьменко М.И., Станшевская Т.Ю. Пероксидазное окисление экзогенных метабо-
литов в культуре Nostoc muscorum (Ag) Elenk // Гидробиологический журнал. 1977. Т. 13. < 3. С. 67—73.
14. Кравец В.В. Интенсификация процессов доочистки и обеззараживания сточных вод в биологических прудах и их санитарная оценка // Водные ресурсы. 1976. № 5. С. 205—209.
15. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М.: Пищ. промышленность. 1972. 335 с.
16. Tront Jacqueline M. Plant activity and organic contaminant processing by aquatic plants: dis-
sertation presented to the academic faculty. Georgia. 2004. 341 p.
17. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. Киев: Наукова думка, 1976. 334 c.
18. Рогожин В.В. Практикум по биологической химии: уч. пос. СПб: Лань, 2006. 256 с.
19. Health R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiome-
try of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 125. P. 189—198.
20. Храмова Е.П., Тарасов О.В., Крылова Е.И., Сыева С.Я. Особенности накопления флавоноидов у растений в условиях радиоактивного загрязнения // Вопросы радиационной безопасности. 2006. < 4. С. 13—20.
Сведения об авторах
Борисова Галина Григорьевна, д. г. н., профессор кафедры физиологии и биохимии растений, Уральский государственный университет им. A.M. Горького (УрГУ), 620083, г. Екатеринбург, пр. Ленина 51, УрГУ, биологический факультет, кафедра физиологии и биохимии растений; e-mail: borisova59@mail.ru;
Кислицина Мария Николаевна, магистрант кафедры физиологии и биохимии растений УрГУ, г. Екатеринбург; e-mail: Kislitsina@KM.ru;
Чукина Надежда Владимировна, ассистент кафедры физиологии и биохимии растений УрГУ, г. Екатеринбург; e-mail: nady_dicusar@mail.ru.
Водное хозяйство России № 4, 2010
Водное хозяйство России
