CC BY
29
УДК 577.152.3:579.234
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ АНТИСТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНДОЛИЗИНОВ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Л.Ю. Филатова1, Д.М. Донован2, С.С. Беккер2, А.Д. Прийма1, А.В. Кабанов1, Н.Л. Клячко1
(кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; лаборатория биологических наук и биотехнологии Института природных ресурсов, исследовательский центр Белтсвилла, США)
С помощью кинетических методов анализа исследованы особенности строения и функционирования антистафилококковых ферментов фагов phi11 и phi80a. Показано, что, несмотря на высокую степень гомологии первичной структуры (99,9%), оптимальные условия функционирования ферментов (температура, рН, концентрация фермента) могут иметь различия. Подтверждено участие в катализе катионов металлов (Ca2+, Mg2+) для эндолизина фага phi11, показана возможность участия в катализе сульфгидрильных групп эндолизинов фагов phi11 и phi80a.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, фаговые эндолизины, катион металла, структура и функции.
Стафилококковые инфекции входят в число самых распространенных и наиболее тяжелых заболеваний. Лечение стафилококковых инфекций осложняется тем, что около 90% штаммов этого микроорганизма устойчивы к антибиотикам. В связи с этим становится актуальным поиск альтернативных методов борьбы с золотистым стафилококком. Бактериофаги - вирусы бактерий, продуцирующие в процессе жизненного цикла ферменты, которые способны лизировать (разрушать) бактериальные клеточные стенки. Эти ферменты могут рассматриваться в качестве серьезной альтернативы антибиотикам. В литературе они получили название «лизины» или «лизоцимы», большинство из них получены методами генетической инженерии [1-3]. Разрушение (лизис) клеточной стенки происходит за счет гидролиза химических связей в пептидогликане. Ферменты фагов рЫ11 и рЫ80а эффективно лизируют клетки золотистого стафилококка, в том числе штаммы, устойчивые к метициллину [4]. Данные ферменты мало изучены как биокатализаторы и представляют интерес как потенциальная основа для разработки лекарственных препаратов. Цель данной работы - характеризация структурно-функциональных свойств ферментов фагов рЫ11 и рЫ80а кинетическими методами.
Материалы и меотды Материалы
В работе использованы рекомбинантные ферменты, полученные по методике [5]. Это водные раство-
ры эндолизинов фагов phi80a и phill (концентрация 3,84 и 10,15 мг/мл соответственно) в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола и 30% глицерина (рН 8,0).
Молекулы эндолизинов фагов phi80a и phi11 являются моносубъединичными белками с молекулярной массой ~56 кДа. Известны аминокислотные последовательности этих ферментов, они отличаются одной аминокислотой в положении 13 с N-конца. Молекулы ферментов характеризуются наличием двух каталитических (CHAP и Amidase 2) и одного адсорбционного (SH3_5) доменов, а также участков с негомологичными структурами. Домен CHAP может содержать остаток цистеина, ответственный за катализ, а домен Amidase2 - катион металла, принимающий участие в катализе или играющий структурную роль. В качестве субстрата использовали препарат клеток Staphylococcus aureus (штамм 209 В-580), любезно предоставленный сотрудниками ОАО «Вектор» (г. Новосибирск). Для приготовления буферных растворов использовали KH2PO4, Трис, цитрат натрия («Sigma»), гидроксид натрия и соляную кислоту фирмы «Диа М».
В работе использованы CaCl22H2O чистоты >99,0% («Sigma»), FeCl2, CuSO45H2O, MnCl2 4H2O, MgSO4 7H2O, Pb(NO3)2 («ч.д.а.», «РеаХим»), DL-дитиотрейтол (ДТТ), восстановленный глутатион (rSH), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) фирмы «Sigma», окисленный глутатион (rSSr) и мер-каптоэтанол (МЭ) фирмы «Fluka».
Методы
Измерение активности ферментов. В спектрофо-тометрическую кювету объемом 0,5 мл, содержащую суспензию клеток золотистого стафилококка с А600 = 0,6 в 20 мМ КН2Р04 (рН 7,5) при температуре 37°С, вносили аликвоту раствора фермента (с = 0,4 мг/мл) и следили за изменением оптической плотности во времени. Активность фермента определяли как тангенс угла наклона линейного участка.
Определение рН-профиля ферментов. В спек-трофотометрическую кювету объемом 0,5 мл, содержащую суспензию клеток золотистого стафилококка с А600 = 0,6 в универсальном буфере (20 мМ КН2Р04, 20 мМ Трис, 20 мМ цитрат натрия) с рН 6,0-9,0 при температуре 37°С, вносили 10 мкл раствора фермента (с = 0,4 мг/мл) и следили за изменением оптической плотности во времени. Активность фермента определяли как тангенс угла наклона линейного участка.
Исследование влияния температуры на активность ферментов. В спектрофотометрическую кювету объемом 0,5 мл, содержащую суспензию клеток золотистого стафилококка с А600 = 0,6 в 20 мМ КН2Р04 (рН 7,5) при температуре 20-50°С (время доведения кюветы до нужной температуры составляло 3 мин), вносили 10 мкл раствора фермента (с = 0,4 мг/мл) и следили за изменением оптической плотности во времени. Активность фермента определяли как тангенс угла наклона линейного участка.
Исследование влияния ионов металлов на активность ферментов. В спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,5 мл суспензии клеток золотистого стафилококка с А600= 0,6 в деионизованной воде, добавляли 10 мкл раствора, содержащего смесь фермента (с = 0,4 мг/мл) с катионом металла (РЬ2+, Са2+, Си2+, Мп2+, Mg2+, Бе2+ с = 1-10 мМ) и следили за изменением оптической плотности при 37°С.
Исследование влияния ионов металлов на стабильность ферментов. Готовили серии растворов, содержащих фермент (с = 0,4 мг/мл) и катион металла (Са2+, Мп2+, Mg2+) в концентрации 1 мМ или 10 мМ, выдерживали при температурах 37 и 4°С, а затем измеряли активность полученных образцов через фиксированные промежутки времени.
Исследование влияния реагентов тиол-дис-ульфидного обмена и ЭДТА на активность ферментов. В спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,5 мл суспензии клеток золотистого стафилококка (20 мМ калий-фосфатный буфер (КФБ) с рН 7,5, А600 = 0,6), добавляли 10 мкл раствора, содержащего смесь фермента (с = 0,4 мг/мл) с реагентом тиол-дисульфидного обмена (дитиотреитол, мер-
каптоэтанол, глутатион, с = 10 мМ) или ЭДТА (с = 0,5-2,0 мМ), и следили за изменением оптической плотности при 37°С.
Исследование влияния реагентов тиол-дисуль-фидного обмена и ЭДТА на стабильность ферментов. Готовили серии растворов, содержащих фермент (с = 0,4 мг/мл) и дитиотреитол, меркаптоэтанол, глу -татион в концентрации 10 мМ или ЭДТА в концентрации 0,5 или 2 мМ (20 мМ КФБ с рН 7,5), выдерживали при температуре 37°С и измеряли активность полученных образцов через фиксированные промежутки времени.
Результаты и их обсуждение
Оптимизация условий хранения и функционирования ферментных препаратов - важный процесс для обеспечения высокой эффективности работы биокатализаторов. С этой целью было исследовано влияние рН, температуры и концентрации фермента на активность эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а.
Для лизинов фагов рЫ11 и рЫ80а зависимости активности от их концентрации линейны в диапазоне до 30 мкг/мл фермента. Полученные данные являются доказательством отсутствия процессов диссоциации-ассоциации белковых молекул при условиях измерения. Стоит отметить, что все эксперименты, описанные в настоящей работе, проводили при значениях концентрации ферментов, находящихся в области линейности.
Величины удельной активности эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а эквивалентны при значениях рН, больших 7,0 (рис. 1). Несмотря на сходство в первичной структуре более чем на 99,9%, эндолизи-
Рис. 1. Зависимость активности от рН для лизинов фагов рЫ11 (1) и рЫ80а (2). Условия эксперимента: 37°С, А600 = 0,6, клетки суспендированы в универсальном буфере (20 мМ Трис-фосфат-цитрат), концентрация ферментов при измерении 8 мкг/мл
ны фагов phi11 и phi80a в кислой среде (рН 6,0-6,5) обладают значениями активности, отличающимися приблизительно вдвое. Стоит отметить, что препараты ферментов не содержали примесных белков (это было подтверждено электрофоретическим методом), что является доказательством корректного расчета удельной активности. Зависимость активности ферментов от рН среды имеет колоколообразный вид с резко выделяющимся максимумом в районе рН 6,5. На основании этого можно предположить наличие в их молекулах двух участвующих в катализе групп с разными значениями рК. Это могут быть остатки Cys и His каталитического домена CHAP.
На рис. 2 приведены зависимости активности эн-долизинов от температуры. Видно, что зависимость активности от температуры для лизина фага phi11 характеризуется наличием максимума в интервале температур 35-40°С. Эндолизин фага phi80a наиболее активен при температурах, близких 20°С. Несмотря на высокую гомологию в первичной структуре, эндо-лизины фагов phi80a и phi11 не только сильно отличаются по активности в кислых средах, но и имеют разные температурные оптимумы.
Стоит отметить, что сотрудниками ОАО «Вектор» (г. Новосибирск) методом электронной микроскопии показано, что клетки золотистого стафилококка идентичны при температурах от 20 до 80°С. Таким образом, можно заключить, что описанные выше закономерности связаны с влиянием температуры именно на фермент, а не на клетки.
Согласно данным моделирования третичной структуры в молекулах ферментов фагов phi 11 и phi80a, есть домен Amidase-2, в котором может присутство-
Рис. 2. Зависимость активности от температуры для лизинов фагов рЫ11 (1) и рЫ80а (2). Условия эксперимента: А600 = 0,6, клетки суспендированы в 20 мМ КФБ (рН 7,5), концентрация ферментов при измерении 8 мкг/мл
вать катион Ме2+. Катион металла может играть существенную роль в процессах катализа и в поддержании структуры белковой молекулы. Для выяснения роли катионов металлов в обеспечении функционирования ферментов мы исследовали влияние катионов двухвалентных металлов (РЬ2+, Си2+, Са2+, Мп2+, Ре2+, Mg2+) на активность и стабильность эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а.
Для количественной оценки влияния катионов металлов на активность ферментов удельную активность нативных ферментов принимали за 100%. Было установлено, что при добавлении катионов свинца, меди и железа (с = 1 мМ) ферменты фагов рЫ11 и рЫ80а полностью теряют активность, а катионы кальция, магния и марганца не вызывают подобных явлений.
Рис. 3. Влияние катионов кальция (1) и магния (2) на активность эндолизина фага рЫ11.Условия эксперимента: 37°С, А600 = 0,6, клетки суспендированы в деионизованной воде, концентрация фермента 8 мкг/мл, А/А
фермента
- от-
ношение активности фермента в присутствии катиона Ме2+ к активности фермента без добавок (в мМ указана концентрация катиона металла в инкубируемом образце)
Рис. 4. Влияние катионов кальция (2, 3), марганца (4, 5), магния (6, 7) в концентрациях 1 и 10 мМ на активность эндолизина фага рЫ80а (1). Условия эксперимента: 37°С, А600 = 0,6, клетки суспендированы в деионизованной воде, концентрация фермента 8 мкг/мл, А/Афермента - отношение активности фермента в присутствии катиона Ме2+ к активности фермента без добавок
Катионы Са2+ и Mg2+ в диапазоне концентраций 1-10 мМ увеличивают активность лизина фага рЫ11 в 1,5-2,5 раза (рис. 3). Возможно, что ввиду близости значений радиусов катионов Са2+ и Mg2+ процесс активации фермента происходит неселективно. Катионы Mn2+ (с = 1-10 мМ) идентичны катионам Са2+ по
влиянию на активность лизина фага рЫ11. Катионы
2+ 2+
Са и Mn в концентрации 1 или 10 мМ не влияют на активность лизина фага рЫ80а, в то время как в присутствии катионов Mg2+ активность фермента возрастает приблизительно в 1,5 раза (рис. 4). Перечисленные выше экспериментальные факты являются доказательством того, что эндолизины фагов рЫ80а и рЫ11 являются металлозависимыми ферментами.
Стабилизирующую способность катионов металлов исследовали при двух значених температуры: 37°С (физиологическая температура) и 4°С (температура хранения). В качестве количественного критерия для оценки стабилизирующей способности катиона металла при 37°С использовали величину времени полуинактивации фермента (табл. 1). Из табл. 1 видно, что катионы Са2+, Mn2+, Mg2+ практически не оказывают стабилизирующего влияния на эндолизин фага рЫ11. Величины времени полуинактивации эндоли-зина фага рЫ80а как в присутствии катионов Са2+, Mn2+, Mg2+, так и в их отсутствие слишком малы для достоверной оценки стабилизирующей способности катионов металлов. Однако они имеют одинаковый порядок, из чего можно заключить, что катионы Са2+, Mn , Mg незначительно повышают стабильность лизина фага рЫ80а.
Стабилизирующую способность катионов Mn2+ и Mg2+ при 4°С оценивали путем сравнения величин остаточной активности индивидуальных фер-
Т а б л и ц а 2
Влияние катионов металлов на стабильность эндолизинов фагов рЫ11 и рМ80а (4°С, концентрация фермента в инкубируемом образце 0,4 мг/мл)
Остаточная активность (2 не-
Фермент Аддитив дели при 4°С), %
1 мМ 10 мМ
Без добавок 70
Лизин фага Са2+ 60 73
РЫ11 Mn2+ 67 66
Mg2+ 68 72
Без добавок 70
Лизин фага РЫ80а Са2+ 57 80
Mn2+ 63 76
Mg2+ 88 74
ментов и эндолизинов в присутствии катионов металлов через 2 недели инкубации. Как видно из табл. 2, при 4°С катионы Са2+, Mn2+ и Mg2+ не влияют на значение остаточной активности ферментов. Таким образом, исходя из анализа температурной зависимости инактивации эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а, можно заключить, что катионы металлов не важны для поддержания структуры ферментов.
Известно, что домен СНАР, который является частью третичной структуры эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а, содержит пару Су8/И8, отвечающую за каталитические процессы. Для выяснения роли групп БН в поддержании структурно-каталитических свойств эн-долизинов фагов рЫ11 и рЫ80а было изучено влияние дитиотрейтола (ДТТ), меркаптоэтанола (МЭ) и глута-тиона в восстановленной (ГБН) и окисленной (ГББГ) формах на активность и стабильность ферментов.
Известно, что ДТТ, МЭ и ГБН - хорошие восстановители -Б-Б-мостиков, под воздействием этих реагентов не наблюдалось значительного изменения активности эндолизинов (табл. 3). Это либо отрицает участие БН-групп в процессах катализа, либо -Б-Б-мостики находятся глубоко в структуре белка
Т а б л и ц а 3
Влияние реагентов тиол-дисульфидного обмена и ЭДТА на активность эндолизинов фагов рМ11 и рМ80а при
37°С
Т а б л и ц а 1
Влияние катионов металлов на время полуинактивации эндолизинов фагов рЫ11 и рМ80а (37°С, концентрации фермента в инкубируемом образце 0,4 мг/мл)
Фермент Аддитив Т1/2 при 37°С, мин
1 мМ 10 мМ
без добавок 8
Лизин фага Са2+ 10 9
РЫ11 Mn2+ 10 13
Mg2+ 10 8
без добавок 3
Лизин фага РЫ80а Са2+ 5 7
Mn2+ 5 7
Mg2+ 7 9
Реагент Лизин фага рЫ11 Лизин фага рЫ80а
На мостик Б Б ДТТ, 10 мМ 1,2±0,5 1,0±0,5
МЭ, 10 мM 0,7±0,2 1,0±0,3
ГБН, 10 мM 0,8±0,2 0,9±0,3
На БН-группу ГББГ, 10 мM 0,09±0,03 0,10±0,02
На катион металла ЭДТА, 0,5 мМ 0,7±0,5 1,1±0,4
ЭДТА, 2 мМ 0,8±0,5 1,0±0,4
Нет добавок 1,0 1,0
и не подвергаются действию реагентов. Под действием глутатиондисульфида активность ферментов рЫ11 и рЫ80а снизилась примерно до 10%. Можно предположить, что происходит образование -8-8-мостиков либо с дезактивацией 8Н-групп, ответственных за катализ, либо с созданием стерических затруднений вблизи активного центра. Установлено, что реагенты тиол-дисульфидного обмена не влияют на стабильность эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а (табл. 4). ЭДТА также не влияет на активность и стабильность эндолизина фага рЫ80а, но дезактивирует и дестабилизирует эндолизин фага рЫ11, что (наряду с активацией катионами кальция и марганца) является доказательством металлозави-симости этого фермента.
Таким образом, выявлены оптимальные условия функционирования эндолизинов фагов рЫ11 и рЫ80а (температура, рН, концентрация фермента). Показано, что высокогомологичные эндолизины фагов рЫ11 и рЫ80а обладают разными свойствами. Подтвержде-Работа выполнена в рамках Гран
Т а б л и ц а 4
Влияние реагентов тиол-дисульфидного обмена и ЭДТА на время полуинактивации эндолизинов фагов phill и phi80a при 37°С
Т 1 1/2' мин
Реагент Лизин фага Лизин фага
phi11 phi80a
- - 24 2
На мостик S S ДТТ, 10 мМ 30 2
МЭ, 10 мM 30 3
rSH, 10 мM 22 2
На SH- rSSr, 10 мM 22 2
группу
На катион ЭДТА, 0.5 мМ 15 2
металла ЭДТА, 2 мМ 15 2
но участие в катализе катионов металлов (Са2+, Mg2+) для эндолизина фага рЫ11. Показана возможность участия в катализе сульфгидрильных групп эндоли-зинов фагов рЫ11 и рЫ80а. I Правительства РФ 11G34.31.0004.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fishetti V.A. // Current Opinion in Microbiology. 2008. 11. P. 393.
2. Borysowski J., Weber-DabrowskaB., Gorski A. // Experimental Biology and Medline. 2006. 231. P. 366.
3. Lopez R., Garcia E., Garcia P. // Drug Discovery Today:
Therapeutic Strategies. 2004. 1. P. 469.
4. Donovan D.M., Lardeo M., Foster-Frey J. // FEMS Microbiology Letters. 2006. 265. P. 133.
5. Becker S.C., Foster-Frey J., Donovan D.M. // FEMS Microbiology Letters. 2008 287. P. 185.
Поступила в редакцию 30.01.14
INVESTIGATION OF STRUCTURE AND FUNCTION OF ANTISTAPHYLOCOCCAL ENDOLYSINS BY KINETIC METHODS
L.Y Filatova1, D.M Donovan2, S.C Becker2, A.D Priyma1, A.V. Kabanov1, Klyachko N.L.1
(Division of chemical enzymology, Chemistry department of M.V. Lomonosov Moscow State University; Animal Biosciences and Biotechnology, USA)
Peculiarities of structure and function of phages phi11 и phi80a antistaphylococcal endolysins were investigated by kinetic measurements. In spite of high extent of homology in primary structure, both enzymes possess some differences in optimal conditions of functioning. As it was shown, phage phi11 endolysin was activated by metal cations (Ca2+, Mg2+). Sulfhydryl groups can play an important role in catalytic processes for both phage phi11 и phi80a endolysins.
Key words: Staphylococcus aureus, phage endolysins, cation of metal, structure and functions.
Сведения об авторах: Филатова Любовь Юрьевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (luboff.filatova@gmail.com); Дэвид. М. Донован - профессор лаборатории биологических наук и биотехнологии Института природных ресурсов, исследовательский центр Белтсвилла, США (david.donovan@ars.usda.gov); Стивен С. Беккер - профессор лаборатория биологических наук и биотехнологии Института природных ресурсов, исследовательский центр Белтсвилла, США; Прийма Анастасия Дмитриевна - аспирант химического факультета МГУ (nastyshka03@ mail.ru); Кабанов Александр Викторович - зав. лабораторией кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ; директор Центра нанотехнологий и доставки лекарств Университета Северной Каролины (США), докт. хим. наук (skabanov@me.com; Клячко Наталья Львовна - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (nlklyachko@gmail.com).
