CC BY
53
Физиология и иммунология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 256-261
УДК 612.118+612.73+612.627+ 612.621.5+612.63
ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС ПРОЯВЛЯТЬ СТИМУЛИРУЮЩУЮ ИЛИ ИНГИБИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ В ОПЫТАХ С ДЕПОЛЯРИЗОВАННЫМ МИОМЕТРИЕМ КРЫС
© 2012 г. О.В. Колчанова1, В.И. Циркин1,2
1 Вятский государственный гуманитарный университет, Киров
2 Казанский государственный медицинский университет
o. kolchanova@mail. т
Поступила в редакцию 17.02.2012
Исследован механизм действия эндогенных активатора и ингибитора сократимости миоцитов сыворотки крови крыс, изменяющих сократимость недеполяризованного миометрия крысы. Показано, что сыворотка крови самцов, небеременных и беременных самок утрачивает способность изменять сократимость миометрия, деполяризованного избытком К+. Следовательно, активатор и ингибитор сократимости миоцитов влияют на миоциты путем изменения свойств их потенциалчувствительных ионных каналов.
Ключевые слова: сыворотка крови, гладкие мышцы, матка, эстральный цикл, беременность, крыса.
Введение
Ранее отдельные авторы отмечали способность сыворотки крови беременных и небеременных женщин повышать сократительную активность изолированного миометрия животных [1-4]. В последующем в нашей лаборатории была подробно исследована эта способность в отношении различных разведений сыворотки крови человека. В частности было показано, что 10-, 50-, 100-, 500- и даже 1000-кратные разведения сыворотки крови человека обратимо повышают фазную активность продольных полосок рога матки небеременных крыс, используемых в качестве удобного для этих целей тест-объекта [5-15]. Это объяснялось наличием в сыворотке крови гипотетического фактора, который было предложено назвать эндогенным активатором сократимости миоцитов (ЭАСМ). Выявлено также, что в ряде случаев сыворотка крови (в разведениях 1:250, 1:500, 1:1000 и выше) вместо миоцитстимулирующей активности проявляла миоцитингибирующую активность, т.е. обратимо снижала фазную активность продольных полосок рога матки небеременных крыс [5, 7, 16, 17]. Первоначально это объяснялось наличием в крови эндогенного бета-адреномиметика, отличающегося от известных катехоламинов [5, 6], но в последующем -наличием в крови специального фактора, подавляющего фазную и тоническую активность миометрия, который предложено называть эндогенным ингибитором сократимости миоци-тов, или ЭИСМ [7, 16, 17]. Вопрос о природе этих двух факторов, механизме их действия и
физиологической роли до настоящего времени остается открытым. Одним из методических приемов, позволяющих изучить механизм действия ЭАСМ и ЭИСМ, является оценка способности сыворотки крови проявлять соответствующие эффекты на фоне тонуса, вызванного деполяризующим раствором, например ги-перкалиевым раствором Кребса (ГРК). Ранее такое исследование было проведено в отношении сыворотки крови беременных женщин (2633 нед.), для которой характерна низкая мио-цитстимулирующая активность [11]. В этом исследовании, проведенном на продольных полосках рога матки небеременных крыс, тоническая активность повышалась с помощью гиперкалиевого (60 мМ KCl) раствора Кребса. Автором показано, что вызываемая таким способом калиевая контрактура не изменялась под влиянием 10-, 50-, 500-, 1000- и более кратных разведений сыворотки крови, но статистически значимо снижалась (до 90.0%) под влиянием 100-кратного разведения. Косвенно это означало, что миоцитингибирующая активность сыворотки крови может проявляться в условиях деполяризации. Других исследований в этом направлении больше не проводилось. Нами ранее было показано [18], что сыворотка крови небеременных и беременных крыс, а также крыс-самцов в опытах со спонтанно активными продольными полосками рога матки небеременных крыс, подобно сыворотке крови человека, способна проявлять миоцитстимулирующую и миоцитингибирую-щую активность. Рис. 1 отражает фрагмент этих исследований.
В экспериментах нами было установлено, что проявление обоих видов активности сыворотки крови крыс зависит и от кратности разведения (с повышением кратности снижается вероятность проявления миоцитстимулирующей активности), и от гормонального статуса (вероятность наблюдения миоцитингибирующей активности повышается при исследовании сыворотки крыс, взятой в фазу метаэструса или в первой половине беременности). Поэтому, пытаясь изучить механизм влияния ЭАСМ и ЭИСМ на сократимость миометрия, мы считали целесообразным оценить способность сыворотки крови крыс проявлять эти виды активности в условиях калиевой контрактуры, вызываемой ГРК, т.е. на фоне деполяризации. С учетом всего сказанного в работе поставлена цель - изучить способность 50-, 100-, 500- и 1000-кратных разведений сыворотки крови крыс-самцов, а также небеременных крыс, находящихся в фазе проэструса, эструса, метаэструса, диэструса, и крыс на сроках 5-14 и 15-21 день беременности проявлять миоцитстимулирующую и миоцитин-гибирующую активность в опытах с деполяризованным миометрием крыс.
Методика
Исследованы 50-, 100-, 500- и 1000-кратные разведения сыворотки крови небеременных крыс, находящихся в фазе проэструса, эструса, метаэструса или диэструса (соответственно группы 1, 2, 3 и 4), беременных крыс на сроках 5-14 и 15-21 день (соответственно группы 5 и 6) и самцов (группа 7). Фазу эстрального цикла определяли по картине влагалищного мазка [19], а срок беременности - по размерам концепта [20]. Кровь из сердца крысы (по 4-5 мл) забирали шприцом под эфирным наркозом. После свертывания ее подвергали центрифугированию при 1000 об/мин в течение 20 минут. В качестве тест-объекта для изучения миоцитсти-мулирующей или миоцитингибирующей активности сыворотки крови крыс использовали продольные полоски (п = 310) рога матки небеременных крыс (п = 77), взятых в опыт в фазу метаэструса или диэструса. Забой крысы осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР от 12.08.77). Регистрацию сократительной активности продольных полосок рога матки, имеющих длину 5 -8 мм и ширину 2-3 мм, проводили по методике Циркина В.И. и соавт. [8] на «Миоцито-графе» при 38°С, при постоянной скорости перфузии раствора Кребса, равной 0.7 мл/мин, пассивной аэрации рабочей камеры и исходной
нагрузке полосок, равной 500 мг (4.9 мН). «Миоцитограф» включал самопишущие приборы типа Н-3020, механотроны 6МХ1Б, измерители-регуляторы температуры ТРМ1А «Овен» и шприцевые дозаторы (все - российского производства). Для появления стабильной спонтанной сократительной активности (СА) первоначально полоски перфузировались раствором Кребса (рН = 7.4), содержащим (мМ): NaCl -136; KCl - 4.7; CaCb - 2.52; MgCb - 1.2; KH2PO4 - 0.6; NaHCOs - 4.7; СбИ^Об - 11. Затем перфузию проводили гиперкалиевым раствором Кребса, содержащим 60 мМ KCl, в результате чего полоски развивали калиевую контрактуру (рис. 2). По достижению ею устойчивого уровня, полоску перфузировали ГРК, содержащим адреналин в концентрации 10-8 или 10-7 г/мл, тем самым оценивали способность деполяризованного тест-объекта снижать тоническую активность под влиянием веществ, вызывающих релаксацию интактного (недеполя-ризованного) миометрия. Затем проводили перфузию стандартным раствором Кребса, в результате которого полоски снижали тонус до исходного базального уровня. Затем повторно полоску перфузировали ГРК и после развития устойчивой калиевой контрактуры в раствор вводили исследуемое разведение сыворотки крови, т.е. оценивали ее способность изменять тоническую активность, вызванную ГРК. Каждый этап эксперимента длился в пределах 10 минут. Величину калиевой контрактуры, т.е. ГРК-вызванного тонуса, выражали в мН, а величину этого тонуса при воздействии адреналина или сыворотки - в мН и в процентах к исходному тонусу, вызванному ГРК. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке [21] с использованием программы Bio-Stat2009 Professional. 5.8.4. (фирма Аnalyst Soft). Влияние адреналина и сыворотки крови на величину тонуса, вызываемого ГРК, оценивали с помощью таких непараметрических критериев как критерий Уилкоксона (для сравнения с исходным уровнем, т.е. зависимых выборок), критерий Крускала-Уоллиса (для оценки влияния сывороток крови разных групп крыс и разных разведений, т.е. независимых выборок) и критерия ранговой корреляции Спирмена (для оценки зависимости эффекта сыворотки крови от кратности ее разведения). Во всех случаях различия принимали статистически значимыми при р < 0.05.
Результаты исследования и их обсуждение
Во всех сериях ГРК повышал тонус полосок, который, достигнув максимума, удерживался на
Рис. 1. Механограммы продольных полосок рога матки небеременных крыс, демонстрирующие миоцитинги-бирующий (Панель А) эффект 100-кратного разведения сыворотки крови крысы (Сыв 1:100), полученной на 5-е сутки беременности, и миоцитстимулирующий эффект (Панель Б) 50-кратного разведения сыворотки крови крысы на 20-й день беременности (Сыв 1:50). Калибровка 10 мН, 10 мин
Рис. 2. Механограмма, демонстрирующая релаксирующий эффект адреналина 10" г/мл (Ад7) и отсутствие миоцитактивных свойств 500-кратного разведения сыворотки крови самца крысы (Сыв500) на вызванный гипер-калиевым раствором Кребса (ГРК) тонус полоски рога матки небеременной крысы. Калибровка 10 мН, 10 мин. РК - стандартный раствор Кребса
постоянном уровне на протяжении всего периода перфузии ГРК (рис. 2). Таким образом, подтверждены многочисленные данные литературы о способности продольных полосок рога матки развивать в условиях ГРК калиевую контрактуру [11, 22-24]. В наших опытах величина калиевой контрактуры (в дальнейшем - тонуса, вызванного ГРК) варьировала в разных группах от 5.8 до 20.3 мН (табл. 1). Это не противоречит данным других исследователей [11, 24], согласно которым ГРК-вызванный тонус продольных полосок рога матки небеременных крыс, взятых в опыт в фазу метаэструса или диэструса, варьирует в широких пределах (от 10 до 16 мН). По этой причине, оценивая влияние адреналина или сыворотки крови на величину ГРК-вызванного тонуса, мы использовали нормированные величины, т.е. выражали тонус в процентах к его исходному уровню. В то же время следует отметить, что в каждом отдельном опыте ГРК-вызванный тонус характеризовался устойчивостью, быстрым снижением до базального уровня после замены ГРК на обычный рас-
твор Кребса и такой же его величиной при повторном воздействии ГРК (рис. 2). Стабильность ГРК-вызванного тонуса позволяла в относительно продолжительных экспериментах исследовать влияние адреналина и сыворотки крови на тоническую активность гладких мышц матки крысы.
Установлено, что во всех опытах адреналин в концентрации 10-8 или 10-7 г/мл снижал тонус, вызванный ГРК (до 20.0-96.4% от его исходной величины, а в среднем до 66.3±1.1%). Это согласуется с данными литературы [11, 22, 24] и указывает на то, что деполяризация не препятствует релаксации, вызываемой активацией ме-таботропных рецепторов, к которым, как известно, относятся бета2-адренорецепторы мио-метрия крысы [22, 24, 25].
При исследовании влияния 50-, 100-, 500- и 1000-кратных разведений сыворотки крови крыс на ГРК-вызванный тонус продольных полосок рога матки крысы установлены следующие закономерности (табл. 1). Сыворотка крови небеременных крыс, находящихся в проэструсе
Таблица 1
ГРК-вызванный тонус продольных полосок рога матки небеременных крыс - до (А, мН) и при воздействии 50-1000-кратных разведений сыворотки крови разных групп крыс
(Б, в % к исходному уровню)
№ серии Группа крыс Разведение сыворотки р
1:50 1:100 1:500 1:1000
I II III IV
А, мН Б, % А, мН Б, % А, мН Б, % А, мН Б, %
1 Проэструс п 11 11 11 10 -
М ±т 10.2 ±1.6 92.2 ±5.3 8.5 ±1.3 95.2 ±6.4 7.4 ±0.9 98.9 ±10.2 9.1 ±1.1 101.5 ±9.2
2 Эструс п 13 14 10 8 -
М ±т 9.4 ±1.0 104.0 ±3.9 9.1 ±1.3 106.9 ±7.0 8.9 ±1.0 105.0 ±3.9 9.0 ±1.4 105.0 ±3.4
3 Метаэструс п 13 13 12 13 рш- IV
М ±т 6.4 ±0.9 96.0 ±4.1 8.5 ±0.9 95.0 ±3.2 7.8 ±0.8 94.7 ±2.4* 8.4 ±1.3 103.1 ±3.1
4 Диэструс п 13 10 10 10 -
М ±т 11.5 ±1.3 95.5 ±4.0 7.4 ±0.9 108.7 ±4.7 10.4 ±0.8 106.7 ±3.1* 10.4 ±1.6 101.6 ±2.4
5 Беременные 5-14 дней п 10 10 10 11 ри- га
М ±т 16.2 ±1.6 96.8 ±6.5 16.3 ±2.2 97.1 ±3.4 18.4 ±2.2 107.6 ±4.4 20.3 ±2.4 108.6 ±4.0*
6 Беременные 15-21 день п 12 13 14 9 -
М ±т 15.2 ±2.1 105.3 ±6.0 15.4 ±2.8 105.3 ±3.7 18.2 ±2.9 100.2 ±5.5 14.5 ±2.2 105.8 ±2.4*
7 Самцы п 10 10 10 9 -
М ±т 7.4 ±1.6 96.7 ±6.4 5.8 ±1.0 95.3 ±6.7 9.7 ±1.6 100.5 ±2.8 6.1 ±1.8 96.1 ±3.9
- р - - р3-4, 5 р6-8 -
Примечание (для значений, выраженных в процентах): символ «*» означает, что различия с исходным уровнем статистически значимы при р < 0.05 по критерию Уилкоксона, «р» - означает, что различия между разведениями в группах (римские цифры І-ІУ) или между группами (арабские цифры 1-7) статистически значимы по критерию Крускал-Уоллиса.
(группа 1), эструсе (группа 2), а также сыворотки крови крыс-самцов (группа 7), независимо от кратности разведений (1:50, 1:100, 1:500 и 1:1000), не вызывала статистически значимого изменения ГРК-вызванного тонуса тест-объекта. В то же время сыворотка крови других групп в определенных разведениях либо повы-
шала ГРК-вызванный тонус, либо снижала его. В частности, статистически значимое повышение выявлено для 500-кратного разведения сыворотки крови небеременных крыс группы 4 (диэструс), а также для 1000-кратных разведений сыворотки крови беременных крыс со сроком 5-14 и 15-21 день. Статистически значимое
Таблица 2
Коэффициент ранговой корреляции Спирмена в опытах с миометрием небеременных крыс в условиях ГРК-вызванного тонуса при исследовании миоцитактивных свойств сыворотки крови крыс
в зависимости от кратности ее разведения
№ Группа животных Число опытов Коэффициент Спирмена, тъ Показатель статистической значимости, р
1 Проэструс 43 -0.079 0.612
2 Эструс 49 -0.047 0.745
3 Метаэструс 51 -0.165 0.246
4 Диэструс 43 -0.096 0.540
5 Беременные (5-14 дней) 41 -0.170 0.286
6 Беременные (15-21 день) 48 -0.010 0.945
7 Самцы 39 0.087 0.597
снижение ГРК-вызванного тонуса наблюдалось при действии 500-кратного разведения сыворотки крови небеременных крыс, находящихся в фазе метаэструса (группа 3) (табл. 1).
Анализ зависимости тонотропных эффектов сыворотки крови от кратности ее разведения (или от концентрации сыворотки в среде) с помощью расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена показал (табл. 2), что ни в одной из 7 групп животных такой зависимости не обнаружено. Действительно, значения этого коэффициента находились в пределах от -0.170 до +0.087, а уровень статистической значимости (р) варьировал от 0.246 до 0.945. Это означает, что выявляемые в отдельных сериях статистически значимые изменения тонуса (повышение в группах 4-6 и снижение в группе 3) являются, скорее всего, случайными.
Таким образом, результаты исследования указывают на то, что в условиях деполяризации миометрия как тест-объекта сыворотка крови крыс утрачивает способность проявлять мио-цитстимулирующую или миоцитингибирую-щую активность, наблюдаемую в опытах с ин-тактным (т.е. недеполяризованным) миометри-ем.
Ранее в нашей лаборатории было показано [26], что миоцитстимулирующая активность 10-кратного разведения сыворотки крови небеременных женщин в опытах с изолированным миокардом крысы блокируется верапамилом. Косвенно это означает, что в основе механизма действия ЭАСМ лежит его способность повышать проницаемость Са-каналов Ь-типа для Са2+. С этих позиций можно утверждать, что действие ЭИСМ связано с уменьшением проницаемости этих каналов для Са2+. Результаты наших экспериментов, представленные в данной работе, дают основание считать, что в условиях ГРК-вызванного тонуса, т.е. в усло-
виях деполяризации, содержащиеся в сыворотке крови ЭАСМ и ЭИСМ, скорее всего, не способны влиять на сократимость миоцитов,
гл 2+
т.е., соответственно, повышать вход Са в миоцит матки или, наоборот, снижать его. Это означает, что способность этих факторов изменять сократимость миоцитов матки в условиях обычного для них уровня мембранного потенциала, скорее всего, связана с их воздействием на потенциалчувствительные Са-каналы. Наиболее вероятно, что ЭАСМ снижает уровень мембранного потенциала мио-
цитов, т.е. вызывает деполяризацию и тем
2+
самым повышает вход Са через потенциал-чувствительные Са-каналы Ь-типа, в то время как ЭИСМ, наоборот, повышает уровень мембранного потенциала, т.е. приводит к гиперполяризации мембраны, что снижает вход Са2+ в миоциты через эти каналы. С этих позиций ЭАСМ и ЭИСМ можно рассматривать в качестве эндогенных модуляторов Са-прони-цаемости различных клеток, и в том числе гладкомышечных клеток и кардиомиоцитов. Полагаем, что дальнейшее изучение природы и механизма действия этих двух факторов перспективно с точки зрения их применения в медицине и ветеринарии.
Вывод
В условиях деполяризации, вызванной ги-перкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса, т.е. на фоне калиевой контрактуры продольных полосок рога матки крысы 50-, 100-, 500- и 1000-кратные разведения сыворотки крови крыс-самцов, небеременных и беременных самок утрачивают способность изменять (повышать или, наоборот, снижать) сократительную активность, выявляемую на недеполяризован-ном миометрии.
Список литературы
1. Sapak K. Oxytocicka aktivita krvnych extraktov v priebehu porodu s normal non a patologickou porodnou cinnostou // Cs. Ginec. Pol. 1966. V. 31. № 2. P. 326-331.
2. Uszynski M. Wplyw surowicy kobiet ciezamych na kurzliwosc i zjawiska electrobiologiszne macicy szczura in vitro // Ginec. Pol. 1968. V. 39. № 2. P. 187192.
3. Ландау Я.М., Беккерман И.Я. Рациональный метод возбуждения родовой деятельности при переношеной беременности // Акушерство и гинекология. 1968. № 1. С. 31-35.
4. Гордина В.З. Окситотическая и окситоциназ-ная активность сыворотки крови у женщин во время беременности // Акушерство и гинекология. 1991. № 4. С. 11-13.
5. Помаскин И.Н., Медведев Б.И., Циркин В.И., Захаров В.В. Эндогенный p-адреномиметик как компонент p-адренорецепторного ингибирующего механизма // Акушерство и гинекология. 1989. № 6. С. 23-27.
6. Помаскин И.Н. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. Омск, 1990. 19 с.
7. Джергения С.Л. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. М., 1995. 19 с.
8. Циркин В.И и соавт. Р-Адреномиметический эффект сыворотки крови человека и животных // Физиология человека. 1997. Т. 23. № 3. С. 88-96.
9. Морозова М.А. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. М., 2000. 18 с.
10. Сизова Е.Н. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. М., 1998. 16 с.
11. Сизова Е.Н. Автореферат дис. ... д-ра биол. наук. М., 2005. 32 с.
12. Хлыбова С.В. Автореферат дис. ... д-ра биол. наук. М., 2007. 32 с.
13. Демина Н.Л., Циркин В.И., Тарловская Е.И., Кашин Р.Ю. а и р -адрено-, М-холиномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. № 2. С. 16-22.
14. Циркин В.И. и соавт. Содержание в сыворотке крови эндогенных модуляторов адренореактивности и эндогенного активатора сократимости миоцитов как отражение их участия в регуляции артериального давления // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 3 (Биология). 2008. Вып. 2. С. 69-82.
15. Циркин В.И. и соавт. Эндогенный активатор сократимости миоцитов и артериальная гипертензия // Вятский медицинский вестник. 2008. № 1. С. 55-66.
16. Туманова Т.В. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. М., 1998. 17 с.
17. Трухин А.Н. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. Киров, 2003. 20 с.
18. Колчанова О.В., Циркин В.И. // Сб. тез. V Всерос. с междунар. участием школы-конф. «Физиология кровообращения», Москва, 31 января-
3 февраля 2012 г. С. 80.
19. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии. М.: Высшая школа, 1969. 256 с.
20. Дыбан А.П. и соавт. Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975. 567 с.
21. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
22. Циркин В.И., Дворянский С.А. Сократительная деятельность матки (механизмы регуляции). Киров: Б.и., 1997. 270 с.
23. Сизова Е.Н., Циркин В.И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов р-адрено- и М-холинореактивности. Киров: Изд-во ВСЭИ, 2006. 183 с.
24. Торопов А.Л. и соавт. Совместное действие сыворотки крови как источника эндогенного сенсибилизатора р-адренорецепторов и его аналогов - гистидина, триптофана, тирозина, милдроната и предуктала // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 151. № 1. С. 96-99.
25. Циркин В.И., Трухина С.И. Физиологические
основы психической деятельности и поведения человека. Учебник. М.: Медицинская книга-Н.
Новгород: Изд-во НГМА, 2001. 524 с.
26. Коротаева К.Н. и соавт. Влияние сыворотки крови человека на сократимость и р-адрено-реактивность изолированного миокарда человека // Физиология человека. 2011. Т. 37. № 2. С. 1-9.
THE STUDY OF RAT BLOOD SERUM ABILITY TO SHOW PROMOTIONAL OR INHIBITORY ACTIVITY IN EXPERIMENTS WITH DEPOLARIZED RAT MYOMETRIUM
O.V. Kolchanova, V.I. Tsirkin
The action mechanism has been studied of an endogenous activator and an endogenous inhibitor of myocyte contractility of rat blood serum which change the contractility of nondepolarized rat myometrium. The blood serum of males, nonpregnant and pregnant females has been shown to lose the ability to change the contractility of myometrium depolarized by K+ excess. Hence, an endogenous activator and en endogenous inhibitor of myocyte contractility influence myocites by changing the properties of their voltage-sensitive ion channels.
Keywords: blood serum, smooth muscles, uterus, estrous cycle, pregnancy, rat.
