CC BY
178
УДК 636.2:578.228
ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НОРМАЛЬНОГО ПРИОННОГО БЕЛКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПРОБАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ*
О.В. МУДРИКОВА, ассистент А.Ю. ПРОСЕКОВ, доктор технических наук, проректор
О.В. КРИГЕР, кандидат технических наук, доцент А.Р. ХАНАНОВА, студент С.Ю. ГАРМАШОВ, студент
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности
Е-таН: mudrikovaov@mail.ru
Резюме. Исследования проводили с целью определения содержания нормального прионного белка в мясе и продуктах его переработки с целью выявления образцов, обладающих наибольшей опасностью инфицирования патогенным при-онным белком. Наиболее высокой степенью инфективности в отношении патогенной формы прионного белка отличаются плазма крови и водоратсворимая фракция белков мяса. Концентрация нормального прионного белка в сыворотке крови составляет 0,1 г/100 г пробы, а его молекулярная масса - 34,89 кДа, в водорастворимой фракции мяса величины этих показателей соответственно равны 0,51 г/100 г пробы и 32,38 кДа.
Ключевые слова: прионный белок, SDS-электрофорез.
Сегодня Российская Федерация находится на стадии гармонизации стандартов с нормативной базой стран ЕС. Над вопросами, касающимися прионов, там давно существуют соответствующие документы. Такой интерес обусловлен возникновением вспышек прионных заболеваний, к числу которых относится, например, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота или «коровье бешенство».
Патогенные прионные белки выделяют в отдельный новый класс инфекционных агентов, которые представляют собой аномальную изоформу нормального прионного белка. Его нормальная или клеточная форма обозначается как РгР° (аббревиатура от англ. - Prion Protein of Cell) и представляет собой сиалогликопротеид с молекулярной массой 33000...35000 дальтон, который состоит из 254 аминокислот. Он найден у всех млекопитающих и входит в состав наружных клеточных мембран. Ген, кодирующий синтез нормального прионного белка, высококонсервативен, высокие уровни его экспрессии обнаруживаются в нейронах. Более низкую экспрессию гена можно наблюдать и в других тканях. Он регулируется в процессе развития и поддерживает устойчивую экспрессию во время всей жизни организма [3, 4].
В организме людей и животных, страдающих прион-ными заболеваниями, прионный белок обнаруживается в форме, обозначаемой как РгРSc. Подобная аббревиатура обусловлена тем, что природным резервуаром инфекционной формы прионов служат овцы и козы, у которых спонтанно может развиваться заболевание под названием «скрепи» (Scrapie) [7].
Прионный белок, вызывающий коровье бешенство, отличается от нормального тем, что имеет два спиральных участка вместо четырех, то есть только третичной структурой. При его взаимодействии с
*Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2008-2012 годы», ГК 16.512.11.2087
нормальным прионным белком структура последнего тоже искажается и становится патогенной. Таким образом, происходит «заражение» всех белков в клетке, в соседних клетках и далее. Доказана возможность передачи патогенной формы прионного белка людям в результате употребления в пищу продуктов из мяса зараженных животных.
Патогенные прионы очень устойчивы. Они выдерживают кипячение в течение двух часов, не утрачивают своих свойств при попадании в органы пищеварения [5].
Изучение прионов и вызываемых ими заболеваний
- новая, быстро развивающаяся область биомедицинских исследований. В последние годы проблема приобрела важное научно-практическое значение.
Все системы, допущенные к исследованию на патогенность прионных форм белка крупного рогатого скота, предполагают изучение образцов в течение 24 часов. В нашей стране расстояния между сельскохозяйственными объектами и современными ветеринарными лабораториями, которые способны провести такую оценку, слишком велико. В связи с этим необходима разработка высокочувствительных методов определения патогенных форм прионного белка из различных частей туши крупного рогатого скота.
Туша крупного рогатого скота служит сырьем для многих отраслей промышленности: пищевые продукты, изделия медицинского назначения, биотехнологическое производство ферментов, вторичные сырьевые ресурсы [9]. А при забое скота клетки мозговой ткани разрушаются и прионные белки попадают в кровоток, таким образом, они могут оказаться в любой части туши, хотя и в низкой концентрации.
Цель нашего исследования - определить содержание нормального прионного белка в туше крупного рогатого скота и продуктах ее переработки для выявления образцов, которые с наибольшей вероятностью могут быть инфицированы патогенным прионным белком.
Условия, материалы и методы. Объектами исследования служили мясо, кровь, продукты переработки крови, желатин. Образцы отбирали у животных, прошедших ветеринарный контроль, туши которых были признаны пригодными для употребления в пищу.
Молекулярно-массовое распределение белков в объектах оценивали с помощью белкового электрофореза методом Лэмли [3]. В ходе исследования использовали ячейку для электрофореза PROTEAN II xi. Белки разделяли на денатурирующем полиакриламидном геле (12 % разделяющий и 4 % фокусирующий) с 0,1 % -ным додецилсульфатом натрия. Форез проводили на
Таблица 1. содержание общего белка и фракционное распределение белков__________________
Наименование образца Общий белок, Число фракций белков, шт. в диапазоне
г/100 г 15...30 кДа 30.40 кДа 40.250 кДа
Водорастворимая фракция 6,83 1 2 б
Солерастворимая фракция 8,78 О О б
Фракции стромы 3,90 О О 2
Плазма крови 9,73 1 2 В
Желатин 84,32 О О 3
Таблица 2. характеристика белковых фракций
Номер полосы Молекулярная масса, кДа Доля от общего содержания белков, % Концентрация белка, г/100 г пробы
А 7 37,42 10,78 0,74
А 8 32,38 7,41 0,51
С 9 39,17 21,03 2,05
С 10 34,89 1,03 0,1
однократном электродном буфере с добавлением 0,1 % додецилсульфата натрия при 15 мА. Гель окрашивали 0,2 % Coomasie Brilliant Blue R250, приготовленным на ледяной уксусной кислоте, при повышенной температуре в течение 7.10 мин, затем трижды отмывали дистиллированной водой.
Просмотр и фотографирование гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе TCP-20M. Сохранение и обработку данных осуществляли с помощью системы «Doc-It LS» (версия 6).
Перед началом электрофореза образцы инкубировали в присутствии додецилсульфата натрия. Дополнительная обработка белков меркаптаном, восстанавливающим дисульфидные связи, приводит к полному разрушению белок-белковых комплексов. В этом случае единственным фактором, который может повлиять на подвижность белка в полиакриламидном геле, - молекулярная масса [2].
Калибровку геля осуществляли, используя набор белковых маркеров производства SibEnzyme, содержащий 12 высокоочищенных рекомбинантных белков молекулярной массы от 10 до 250 кДа, которые образуют дискретные полосы. Для количественной оценки содержания фракций белков проводили калибровку по белкам сывороточного альбумина человека с известными концентрациями.
Пробоподготовку жидких образцов осуществляли разбавлением дистиллированной водой таким образом, чтобы содержание белков в кармашке геля не превышало 5 мкг на 20 мкл раствора.
Подобрать условия для электрофоретического разделения образцов, состоящих из цельной крови крупного рогатого скота, не удалось, поэтому изучали плазму крови, которую получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Для исследований использовали супернатант, содержащий легкие фракции белков крови.
Содержание общего белка в пробах определяли методом сжигания по Дюма, основанным на измерении теплопроводности молекулярного азота, образующегося после сжигания анализируемого образца при температуре 960 0С в атмосфере кислорода и последующего восстановления всех оксидов азота при помощи восстанавливающего агента, с использованием анализатора белкового азота RAPID N Cube.
Полный аминокислотный состав определяли методом капиллярного электрофореза на приборе Капель-105М. Исследования проводили по методике М-04-38-2004
Анализ выполняли в следующих условиях: полная длина капилляра - 60 см, эффективная длина (от входа до окна детектора) - 50 см, рабочее напряжение, поданное на электроды - +13 кВ, внутренний диаметр капилляра - 50 мкм, детектирование при 267 нм косвен-
ное, температура 20 0С, ввод пробы под давлением 150 мбарс, состав рабочего буфера - 5 мл бензимидазола (20 ммоль/л), 2,5 винной кислоты (5 ммоль/л), 2 мл 18-краун-6 (2,0 ммоль/л) и 0,5 мл дистиллированной воды.
При пробоподготовке образцы белка гидролизовали раствором соляной кислоты (1:1 с водой) при температуре 130°С в течение суток. Затем осуществляли перевод аминокислот в ФИТЦ-производные, согласно методике.
В связи с тем, что в литературных источниках нет никакой информации о том, в какой из фракций белка могут содержаться прионные белки, мы изучили все фракции белков крупного рогатого скота, выделенные в соответствии со стандартной методикой [1].
Результаты и обсуждение. Содержание общего белка в говядине составило 19,51 %, в том числе водорастворимой фракции - 6,83 г/100 г солерастворимой
- 8,78 г/100 г, стромы - 3,90 г/100 г.
Результаты проведения денатурирующего электрофореза указывают на то, что в строме и солерастворимых белках нет легких фракций (табл. 1), в то время как водорастворимые белки содержат сразу две фракции размером от 30 до 40 кДа (диапазон нормального при-онного белка).
Электрофореграммы проб плазмы крови указывают на наличие также 2 фракций белков в диапазоне от 30 до 40 кДа.
Электрофоретическое разделение промышленных образцов желатина, который получают частичным гидролизом коллагена из костей, шкур, кож, жил и сухожилий крупного рогатого скота, показывает высокую степень очистки продукта. Легкие фракции белков не обнаруживаются.
Отсутствие белковых фракций массой от 30 до 40 кДа в образцах свидетельствует о низкой инфективности исследуемых проб. Для допуска их к использованию достаточно стандартной процедуры ветеринарного контроля.
Относительное содержание белков массой от 30 до 40 кДа в водорастворимой фракции белков мяса составляло 18,19 % от общего количества, или 1,25 г/100 г мяса (табл. 2), в пробах плазмы крови - 22,06 % и 2,15 г/100 г соответственно.
Расчет процентного соотношения аминокислот в каждом образце и его сравнение с величиной этого показателя для нормального прионного белка показал, что в сыворотке крови нормальному прионному белку соответствует белок с молекулярной массой 34,89 кДа, а в водорастворимой фракции мяса - 32,38 кДа.
Выводы. Определение содержания нормального прионного белка в образцах мяса крупного рогатого скота и продуктах его переработки показало, что наиболее высокой степенью инфективности в отношении патогенной формы прионного белка отличаются плазма крови и водоратсворимая фракция белков мяса. Концентрация нормального прионного белка в сыворотке крови составляет 0,1 г/100 г пробы, а его молекулярная масса - 34,89 кДа, в водорастворимой фракции мяса величины этих показателей соответственно равны 0,51 г/100 г пробы и 32,38 кДа. Полученные данные можно использовать при проведении контроля качества сырья животного происхождения.
Литература.
1. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. - Методы исследования мяса и мясных продуктов - М.: Колос, 2001. - 376 с. 2.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Практическое пособие/- М.: Наука, 1981. - 288с.
3. Полещук Н.Н., Капитулец С.П., Илькевич Ю.Г, Квачева З.Б. //Лабор. дело. - 1991. - № 4. - С. 42—44.
4. Полещук, Н.Н., Илькевич Ю.Г, Капитулец С.П. и др. // Вопросы вирусологии. - 1991. - Т. 37, № 1. - С. 37—40.
5. Попова Н.А., Юшкова А.А., Баймак Т.Ю. Основы молекулярной генетики. - Новосибирский государственный университет, 2010. - 72 с.
6. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. //Молекулярно-клиническая диагностика. Методы. - М. «Мир», 1999, с.395-425.
7. Montowska M., Pospiech E. Species identification of meat by electrophoretic methods ///Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. - 2008. - №6(1). - Р. 5-16.
8. Electrophoretic isofocusing in studies on meat protein from various animal species and pork stored under different conditions/E. Pospiech, G. Peltre, M.L. Greaser, B. Mikoiajczak//Polishjournal of food and nutrition sciences. - 2005. - Vol. 14/55. - № 3. - Р. 299-302.
10. WHO Guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies in relation to Biological and Pharmaceutical Products, 2003 (www.who.int/bloodproducts/publications/en/WH0_TSE_2003.pdf).
THE INVESTIGATION OF QUANTITY OF NORMAL PRION PROTEIN OF BOVINE IN SAMPLE OF BIOLOGICAL ORIGIN O.V. Mudrikova, A.Yu. Prosekov, O.V. Kriger, A.R. Hananova, S.Yu. Garmashov
Summary. The authors have carried an investigation of various samples of cattle carcasses and other products of agricultural raw materials for the presence of normal prion protein to identify their potential infectivity.
Key words. Normal prion protein, sDs-electrophoresis.
УДК 664.22
ПРИМЕНЕНИЕ МЕМБРАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ РАЗБАВЛЕННОГО КАРТОФЕЛЬНОГО СОКА
Н.В. ВОЛКОВ, аспирант
Н.Д. ЛУКИН, доктор технических наук, зам. директора
Л.В. КРИВЦУН, кандидат технических наук, зав. лабораторией
ВНИИ крахмалопродуктов Россельхозакадемии E-mail:
Резюме. Сброс разбавленного сока, образующегося при переработке картофеля на крахмал, оказывает вредное воздействие на окружающую среду. Вместе с тем он содержит белок, который можно использовать в производстве кормов для животных.
В статье приведены результаты исследований по применению мембранной технологии для очистки и концентрирования картофельного сока. Полученные данные свидетельствуют о высокой селективности нанофильтрационной мембраны ЭРН 500 Да по разбавленному картофельному соку. Определена возможность концентрирования картофельного сока для последующего его использования в смеси с картофельной мезгой с целью повышении ее кормовой ценности. Ключевые слова: мембрана, ультрафильтрация, нанофильтрация, картофельный сок, сточные воды.
При переработке некондиционного картофеля и твердых отходов, образующихся в производстве кар-тофелепродуктов с использованием гидроциклонной установки, получают отход - смесь мезги с картофельным соком. При ее разделении выделяется мезга, которую можно использовать на корм скоту и разбавленный картофельный сок с содержанием 1,8...3,0 % сухих веществ, который направляют на очистные сооружения.
Традиционные методы очистки воды (биологические, адсорбционные, коагуляционные, флотационные) высокозатратны, зачастую недостаточно эффективны и могут быть успешно заменены на методы, предусматривающие применение полимерных и керамических мембран [1.5].
Цель наших исследований - определить возможность очистки и концентрирования разбавленного картофельного сока с использованием ультрафильтрационных (УФ) и нанофильтрационных (НФ) мембран, уточнить основные технологические параметры мембранного процесса для проектирования промышленной установки.
Условия, материалы и методы. Эксперименты проводили на пилотной установке контурного типа с непрерывным отбором фильтрата. Процесс осуществляли в режиме максимального концентрирования раствора, контроль проводили по следующим параметрам: давление, температура, производительность по фильтрату с помощью манометра, контактного термометра и расходомера соответственно.
Для проведения экспериментов использовали мембраны следующих типов: керамические одноканальные УФ мембраны КУФЭ с селективным слоем на основе карбида кремния с номиналом пор 67 кДа; «INNOPOR» с селективным слоем на основе оксида титана и номиналом пор 70 кДа; полимерный рулонный нанофильтра-ционный элемент ЭРН с номиналом пор 500 Да.
Объект исследования - разбавленный картофельный сок с содержанием сухих веществ (СВ) 2,6 % в виде мутной жидкости темно-коричневого цвета с рН 4,3. Разделение сточной воды на мембране проводили за счет градиента давлений на ее поверхности. Трансмембранный перепад давления в аппарате составлял 0,3 МПа. Площадь мембраны - 0,015 м2, температуру жидкости в установке поддерживали на уровне 45.50 °С. В процессе эксперимента исходный модельный раствор разделяли мембраной на два потока: пермеат и концентрат. Пермеат выводили из установки, а концентрат направляли в исходный резервуар.
Эксперимент проводили следующим образом. Исходный раствор картофельного сока концентрировали вначале на мембранах КУФЭ или «INNOPOR» с получением ультрафильтрата (УФ-фильтрат) и концентрата; затем УФ-фильтрат разделяли на мембране ЭРН, получая нанофильтрат (НФ-фильтрат) и НФ-концентрат.
После каждого эксперимента мембранные элементы регенерировали путём промывки кислотно-щелочными растворами с проведением замеров их удельной производительности на дистиллированной воде для оценки степени регенерации.
Результаты и обсуждение. На стадии ультрафильтрации происходит концентрирование в резервуаре всех взвешенных частиц и белковой составляющей
