CC BY
261
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
биохимия
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—11, 13—21 см. REFERENCES)
12. Калитин Н.Н., Буравцова И.В. Корреляция экспрессии транскрипционного фактора RARa и генов VEGFRS-зависимой сигнальной системы при множественной миеломе. Клиническая он-когематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2015; 8(1): 31—6.
22. Калитин Н.Н., Буравцова И.В. Дифференциальная экспрессия изоформ р2 и р4 гена рецептора ретиноевой кислоты RAR| в качестве возможного прогностического фактора при множественной миеломе. Вопросы онкологии. 2015; 61(6): 945—8.
Поступила 13.04.16
REFERENCES
1. LeBien T.W., Tedder T.F. В lymphocytes: how they develop and function. Blood. 2008; 112(5): 1570—80.
2. Palumbo A., Anderson K. Multiple myeloma. N. Engl. J. Med. 2011; 364(11): 1046—60.
3. Bjorklund C.C., Baladandayuthapani V., Lin H.Y., Jones R.J., Kui-atse I., Wang H. et al. Evidence of a role for CD44 and cell adhesion in mediating resistance to lenalidomide in multiple myeloma: therapeutic implications. Leukemia. 2014; 28(2): 373—83.
4. Boyle E.M., Davies F.E., Leleu X., Morgan G.J. Understanding the multiple biological aspects leading to myeloma. Haematologica. 2014; 99(4): 605—12.
5. Hjalt T.A., Murray J.C. Genomic structure of the human retinoic acid receptor-a1 gene. Mamm. Genome. 1999; 10(5): 528—9.
6. Leroy P., Krust A., Zelent A., Mendelsohn C., Garnier J.M., Kastner P. et al. Multiple isoforms of the mouse retinoic acid receptor a are generated by alternative splicing and differential induction by retinoic acid. EMBO J. 1991; 10(1): 59—69.
7. Brand N.J., Petkovich M., Chambon P. Characterization of a functional promoter for the human retinoic acid receptor-alpha (hRAR-a). Nucleic Acids Res. 1990; 18(23): 6799—806.
8. Parrado A., Despouy G., Kra@ba R., Le Pogam C., Dupas S., Cho-quette M. et al. Retinoic acid receptor alpha1 variants, RARalph-a1DeltaB and RARalpha1DeltaBC, define a new class of nuclear receptor isoforms. Nucleic Acids Res. 2001; 29(24): 4901—8.
9. Salazar M.D., Ratnam M., Patki M., Kisovic I., Trumbly R., Iman M. et al. During hormone depletion or tamoxifen treatment of breast cancer cells the estrogen receptor apoprotein supports cell cycling
through the retinoic acid receptor al apoprotein. Breast Cancer Res. 2011; 13(1): R18.
10. Van der Leede B.J., Folkers G.E., van den Brink C.E., van der Saag P.T., van der Burg B. Retinoic acid receptor alpha 1 isoform is induced by estradiol and confers retinoic acid sensitivity in human breast cancer cells. Mol. Cell. Endocrinol. 1995; 109(1): 77—86.
11. Durie B.G., Salmon S.E. A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survival. Cancer. 1975; 36(3): 842—54.
12. Kalitin N.N., Buravtsova I.V. Correlation between expression of RARa transcription factor and genes of VEGFR3-dependent signaling system in multiple myeloma. Klinicheskaya onkogematologiya. Fundamental'nye issledovaniya i klinicheskayapraktika. 2015; 8(1): 31—6. (in Russian)
13. Durie B.G., Bataille R. Therapeutic implications of myeloma staging. Eur. J. Haematol. Suppl. 1989; 51: 111—6.
14. Collins C.D. Multiple myeloma. Cancer Imaging. 2004; 4 Spec. No A: s47—53.
15. Barlogie B., Jagannath S., Desikan K.R., Mattox S., Vesole D., Siegel D. et al. Total therapy with tandem transplants for newly diagnosed multiple myeloma. Blood. 1999; 93(1): 55—65.
16. Attal M., Harousseau J.L., Stoppa A.M., Sotto J.J., Fuzibet J.G., Rossi J.F. et al. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. Intergroupe Fran@ais du My@lomc. N. Engl. J. Med. 1996; 335(2): 91—7.
17. Child J.A., Morgan G.J., Davies F.E., Owen R.G., Bell S.E., Hawkins K. et al. High-dose chemotherapy with hematopoictic stem-cell rescue for multiple myeloma. N. Engl. J. Med. 2003; 348(19): 1875—83.
18. Kyle R.A., Rajkumar S.V. Multiple myeloma. Blood. 2008; 111(6): 2962—72.
19. Wang S., Tricot G., Shi L., Xiong W., Zeng Z., Xu H. et al. RARalpha2 expression is associated with disease progression and plays a crucial role in efficacy of ATRA treatment in myeloma. Blood. 2009; 114(3): 600—7.
20. Pozzi S., Rossetti S., Bistulfi G., Sacchi N. RAR-mediated epigenetic control of the cytochrome P450 Cyp26a1 in embryocarcinoma cells. Oncogene. 2006; 25(9): 1400—7.
21. Xu X.C. Tumor-suppressive activity of retinoic acid receptor-beta in cancer. Cancer Lett. 2007; 253(1): 14—24.
22. Kalitin N.N., Buravtsova I.V. Differential expression |2 and |4 isoforms of retinoic acid receptor gene RAR| as possible prognostic factor at multiple myeloma. Voprosy onkologii. 2015; 61(6): 945—8. (in Russian)
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.72-008.8-076.4
Доценко Т.Г.1, Шлыкова Г.И.1, Теплякова О.В.1,2
исследование синовиальной жидкости — клиническая значимость полученных результатов
1 Медицинское объединение «Новая больница», 620109, Екатеринбург; 2 ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет Минздрава России, 620028, Екатеринбург, Российская Федерация
В обзоре представлены современные данные об особенностях взятия синовиальной жидкости (СЖ), а также об информативности ряда ее показателей для решения основной клинической дифференциально-диагностической задачи, а именно — выделения группы септических и микрокристаллических артритов. Показано, что минимальный общедоступный объем исследования СЖ должен включать: определение числа лейкоцитов (пороговый уровень для диагностики септических артритов — 50 000—100 000 кл/мкл) и доли полиморфноядерных клеток (пороговый уровень — 90%), исследование с помощью световой микроскопии на содержание кристаллов, окраску по Граму и культуральное исследование СЖ; все это — при обязательном учете клинических данных. Традиционная оценка содержания глюкозы и протеина в СЖ малоинформативна. Определение концентрации прокальцитонина и лактата в СЖ перспективно для установления септического генеза артрита. Чувствительность и специфичность световой микроскопии достаточно высоки, в связи с чем отсутствие поляризационного микроскопа не может являться препятствием для проведения кристаллографического исследования СЖ.
Д л я к о р р е с п о н д е н ц и и: Теплякова Ольга Вячеславовна, д-р мед. наук, проф. каф. поликлинической терапии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, 620028, Екатеринбург, е-таП: [email protected]
russian clinical laboratory diagnostics. 2016; 61(8) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
biochemistry
Ключевые слова: синовиальная жидкость; септический артрит; окраска по Граму; микрокристаллический артрит; моноурат натрия; пирофосфат кальция. Для цитирования: Доценко Т.Г., Шлыкова Г.И., Теплякова О.В. Исследование синовиальной жидкости — клиническая значимость полученных результатов. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8): 478-484. D0I:10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
Dotsenko T.G.1, Shlikova G.I.1, Teplyakova O.V.12
THE ANALYSIS OF SYNOVIAL FLUID: CLINICAL SIGNIFICANCE OF DERIVED RESULTS
1 The medical association "New Hospital'; 620109 Yekaterinburg, Russia; 2 The Uralskii state medical university of Minzdrav of Russia, 620028 Yekaterinburg, Russia
The review presents modern data concerning characteristics of drawing of synovialfluid and also informativeness of its particular indices for resolving main clinical differential diagnostic task namely - selection group of septic and micro-crystal arthritis. It is demonstrated that minimal generally available span of analysis of synovial fluid is to include: finding number of leukocytes (threshold level for diagnostic of septic arthritis is 50 000 - 100 000 kl/mkl) and percentage ofploymorpho-nuclear cells (threshold level is 90%); analysis of content of crystals, Gram's stain and culture analysis of synovial fluid using light microscopy; and all this with mandatory registration of clinical data. The common evaluation of content ofglucose and protein in synovialfluid is not enough informative. The detection of concentration of procalcitonin and lactate in synovial fluid is perspective for establishing septic genesis of arthritis. The sensitivity and specificity of light microscopy are quite high. Because of it absence of polarized microscope is no obstacle for implementation of crystallographic analysis of synovial fluid.
Keywords: synovialfluid; septic arthritis; Gram's stain; microcrystallic arthritis; sodium monourate; calcium pyrophosphate. For citation: Dotsenko T.G., Shlikova G.I., Teplyakova O.V. The analysis of synovial fluid: clinical significance of derived results. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (8): 478-484 (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
For correspondence: Teplyakova O.V, doctor of medical sciences, professor of the chair of polyclinic therapy. e-mail: [email protected]
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support.
Received 26.02.2016 Accepted 15.03.2016
Введение. Исследование синовиальной жидкости (СЖ) должно являться рутинной процедурой в практике врачей, осуществляющих пункцию суставов. Традиционно основное значение в исследовании СЖ отводится установлению диагнозов септического и микрокристаллического артритов, однако пока не существует консенсуса в отношении того, какие тесты при анализе СЖ следует считать наиболее значимыми, равно как не определены окончательно их чувствительность и специфичность. Кроме того, следует признать утрату определенных позиций российской школы лабораторной диагностики, когда молодое поколение врачей, в силу отсутствия опыта, не способно идентифицировать различные виды кристаллов, а врачи-клиницисты не всегда могут правильно сопоставить данные клинической картины и результаты исследования СЖ.
Целями работы явились критическая оценка данных современной литературы и попытка представить значимость результатов анализа СЖ в реальной клинической практике.
В качестве метода использован поиск литературы с помощью электронных баз данных Medline и PubMed; в качестве иллюстративного материала представлены данные собственных клинико-лабораторных наблюдений.
К вопросу об особенностях взятия синовиальной жидкости на исследование. Несмотря на то, что нормальная СЖ не содержит факторов свертывания, при артритах любой этиологии в результате повышенной проницаемости сосудов данные факторы могут быть обнаружены в СЖ и, как следствие, приводить к ее коагуляции в контейнере прежде, чем она будет доставлена в лабораторию [1]. Для предотвращения этого явления при транспортировке СЖ в некоторых рекомендациях предлагается использовать пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта [2]. Однако использование ЭДТА принципиально ограничено его свойствами связывать кальций и, следовательно, приводить к невозможности верификации кристаллов пирофосфата кальция (CPPD). Решение
данной проблемы возможно при применении иного антикоагулянта. С этой целью P. Stirling и соавт. [3] предлагают использовать контейнеры с лития гепарином, который не изменяет свойств кристаллов и не кристаллизуется сам, а поэтому не будет оказывать влияния на частоту ложноположительных и ложноотрицательных исследований при определении содержания кристаллов в СЖ.
Однако с целью оценки наличия бактериальной культуры СЖ необходимо использование дополнительного контейнера (флакона), заполненного теми же средами, что и для культу-рального исследования крови. В этом случае правила взятия СЖ полностью соответствуют правилам исследования гемо-культуры. Следует отметить, что этот метод применим при диагностике септических артритов как нативных, так и протезированных суставов [4, 5].
Значимость традиционных тестов, используемых для оценки синовиальной жидкости. Традиционно в реальной клинической практике на основании визуальных и лабораторных тестов проводят разделение СЖ по характеру на несколько типов: нормальная, невоспалительная, воспалительная, септическая и геморрагическая, в последующем сопоставляя полученные данные с предполагаемым диагнозом [6].
Однако, рассматривая вопрос о значимости тестов, используемых для оценки СЖ, нужно понимать, что основной клинической целью является не выделение типов СЖ, а дифференциация тех заболеваний, которые имеют различный прогноз и различную терапевтическую тактику. В большей степени это касается своевременного выявления на основании оценки показателей СЖ двух типов заболеваний, таких как септические артриты и микрокристаллические артропа-тии, с последующей идентификацией вида кристаллов. Последнее представляет особую значимость, поскольку уратная артропатия на сегодняшний день признана потенциально обратимым состоянием, тогда как пирофосфатная артропатия требует только симптоматической терапии.
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
биохимия
Следует обратить особое внимание на то, что при основных для дифференциальной диагностики заболеваниях, таких как септический и микрокристаллический артриты, СЖ может иметь характеристики как воспалительной, так и септической, поэтому оценка, основанная сугубо на результатах традиционных показателей (цитоз, содержние глюкозы, протеина), может оказаться недостаточной для решения данной клинической задачи.
Цитоз и качественный состав клеток синовиальной жидкости. Многолетними исследованиями была доказана высокая диагностическая значимость определения количества клеток и их состава в СЖ при острых септических артритах. Пороговым значением, практически исключающим септический артрит (98% AUC — площадь под ROC-кривой), является уровень лейкоцитов менее 12 800 кл/мкл; в то же время, в случае содержания лейкоцитов в СЖ в диапазоне 50 000—100 000 кл/мкл септический артрит может быть диагностирован в 47%, а при более чем 100 000 кл/мкл — в 77% случаев. Для сравнения: при микрокристаллических ар-тропатиях и РА при отсутствии септического поражения сустава количество лейкоцитов у 81% пациентов было ниже и составило 15 000—50 000 кл/мкл. Но все же низкий уровень лейкоцитов в СЖ при остром септическом артрите (менее 20 000 кл/мкл) не позволяет полностью исключить наличия инфекционного воспаления. Подобная ситуация чаще наблюдается при нестафилококковом поражении суставов [7].
Итоговые данные представлены в обзорах, выполненных M.E. Margaretten и соавт. [8] в 2007 г и C.R. Carpenter и со-авт. [9] в 2011 г. Так, отношение правдоподобия (LR) наличия септического артрита для уровня лейкоцитов в СЖ 0—25 000 кл/мкл составляет LR = 0,33; для 25 000—50 000 кл/мкл LR = 1,06—2,9; для 50 000—100 000 кл/мкл LR = 3,59—7,7; при превышении 100 000 кл/мкл LR = 12,6—66 соответственно.
Что касается клеточного состава СЖ, то пороговый диагностический показатель для острого септического артрита (AUC = 91%) соответствует 89% полиморфонуклеарных (PMN) клеток в составе СЖ [10], что также подтверждено обзором M.E. Margaretten и соавт. [8], где отношение правдоподобия составило LR = 0,34 при количестве PMN менее 90% и LR = 3,4 при уровне PMN 90% и более.
Результаты еще одной работы, выполненной S. Baran и соавт. (2014) [11], демонстрируют, что у иммунокомпетент-ных пациентов при уровне лейкоцитов в СЖ более 50,000 кл/ мкл вероятность выявления септического артрита составляет 0,727 (95% ДИ 0,570—0,845), а специфичность — 0,923 (95% ДИ 0,806—0,975). Более важным показателем, по мнению этой группы исследователей, является доля PMN. При содержании PMN не менее 80%, 85% и 90% чувствительность составила 0,932, 0,886 и 0,818 соответственно, а специфичность — 0,598, 0,577 и 0,673 соответственно.
Достаточно схожие результаты были получены и у имму-носкомпрометированных пациентов. Так, вероятность септического артрита при содержании лейкоцитов в СЖ более 50 000 кл/мкл составила 0,714 (95% ДИ 0,420—0,904), а специфичность — 1,0 (95% ДИ 0,732—1,000). Чувствительность показателя PMN как предиктора положительного результата бактериологического исследования в данной группе пациентов составила 1,0, 0,929 и 0,786 при доле PMN 80%, 85% и 90% соответственно, а специфичность — 0,50, 0,643 и 0,714 соответственно. Подчеркнем, что, независимо от иммунного статуса, в 27—29% случаев синовиальная жидкость пациентов, у которых при бактериологических исследованиях были получены положительные результаты, содержала менее 50 000 кл/мкл лейкоцитов.
Следует акцентировать внимание на возможности противоположной ситуации, связанной с тем, что ряд асептических воспалительных заболеваний суставов могут протекать
с крайне высоким содержанием лейкоцитов в СЖ. Еще в 1975 г J. Frischknecht и соавт. [12] описали 5 случаев пиро-фосфатной артропатии с содержанием лейкоцитов от 65 000 до 100 000 кл/мкл и долей полиморфноядерных клеток от 93 до 100%. Четверо из пяти пациентов первоначально получали лечение по поводу гнойных артритов, и только идентификация кристаллов CPPD и отрицательные результаты бактериологического исследования позволили изменить тактику их последующего ведения.
В случае наличия протезированных коленных суставов пороговым значением в диагностике хронической перипро-тезной инфекции следует считать уровень клеток, превышающий 1100 кл/мкл, и число PMN более 64%. Когда оба показателя были ниже указанных значений, отрицательная прогностическая ценность данной комбинации увеличивалась до 98,2% (95% ДИ 95,5—99,5%); когда результаты обоих тестов превышали соответствующие значения, инфекция была подтверждена в 98,6% (95% ДИ 94,9—99,8%) случаев
[13]. Последующие исследования подтвердили значимость подсчета количества клеток в СЖ протезированных коленных суставов, предлагая в качестве пороговых значений очень близкие показатели, соответствующие 3000 кл/мкл
[14], — в то время как результаты единственного исследования хронического инфекционного перипротезного процесса тазобедренного сустава указали на пороговую величину для диагностики, равную 3000 кл/мкл для общего содержания лейкоцитов и 80% для PMN [15].
Напомним, что в двух из трех случаев развитие септического артрита происходит гематогенным путем, поэтому бактериологическое исследование важно в качестве компонента первичной диагностики у пациентов с подозрением на инфицирование сустава. Однако большинством исследователей признается невысокая ценность исследования гемокультуры: чувствительность метода в данной клинической ситуации не превышает 24—35% [16, 17].
Огромное значение приобретает бактериологическое исследование непосредственно СЖ. В случае септического артрита чувствительность метода существенно выше по сравнению с гемокультурой: положительные результаты могут быть получены у 67—84% пациентов [16, 17]. Однако следует помнить, что культуральное исследование может иметь ложно-отрицательный результат из-за предшествующей антибактериальной терапии [18], а в ряде случаев — в связи с использованием несоответствующей культуральной среды, например, для таких микроорганизмов, как Abiotrophia defectiva или Granulicatella adiacens, которые хотя и редко, но могут являться этиологическим фактором септического артрита.
В то же время при однократном исследовании велика вероятность ложноположительных результатов за счет получения культуры с кожных покровов. Особенно важно учитывать этот факт при подозрении на наличие перипротезной инфекции протезированного сустава. Культуры перипротез-ной ткани представляют собой наиболее надежное средство диагностики только в случае неоднократного обнаружения возбудителя, в связи с чем рекомендовано проведение исследований по крайней мере трех интраоперационных образцов. Установлено, что однократный положительный результат не имеет диагностического значения (LR = 0,7), при двукратном положительном исследовании LR = 4,3, тогда как при трехкратном положительном результате происходит увеличение LR до 25,9 [19].
Бактериологическое исследование СЖ является одним из основных требований при оценке СЖ. Доступными методиками являются окраска по Граму и культуральное исследование СЖ. В настоящее время представлено ограниченное число работ, оценивающих диагностическую точность данных методов. На основании проведенного сравнения СЖ в
RussIAN CLINICAL LABORATORY diagnostics. 2016; 61(8) DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
biochemistry
19 случаях септического артрита и образцов СЖ, полученных от 100 пациентов с неинфекционными артритами, R.H. Shmerling [20] установил, что чувствительность составляет 75—95% для культурального исследования СЖ и 50—75% — для окраски по Граму, в то время как специфичность превышает 90% для первого метода и охарактеризована как «достаточно высокая» для окраски по Граму. В случае предшествующего использования антибиотиков диагностическая ценность обоих методов существенно снижается.
Несколько позже V.C. Weston и соавт. [16] на основании оценки результатов 242 образцов СЖ подтвердили эти данные и показали, что окраска по Граму дала положительные результаты в 50% случаев септических артритов, тогда как инфекционный агент в культуре СЖ был выявлен в 67%.
Ситуацией, когда существенно снижается вероятность выявления бактериального патогена, является септический артрит, этиология которого связана с гонококковой инфекцией. В данном случае чувствительность культурального исследования СЖ не превышает 10—50%, а окраски по Граму — даже 10% [20].
Таким образом, и окраска по Граму, и культуральное исследование СЖ остаются необходимыми методами оценки состояния СЖ, но, учитывая их недостаточную чувствительность, полученные результаты не могут быть интерпретированы без приложения к клинической картине и без учета результатов других тестов, оценивающих СЖ. Собственные результаты получения положительного результата при окраске по Граму (грамположительная кокковая флора) представлены на рис. 1.
Концентрация глюкозы в синовиальной жидкости. В обычных условиях концентрация глюкозы в СЖ близка к ее сывороточным концентрациям, поскольку глюкоза поступает в СЖ из крови путем диффузии. В условиях воспаления или инфекционного процесса концентрация глюкозы в СЖ снижается в ходе метаболической активности нейтрофилов и бактерий. Ранее уделялось существенное внимание уровню глюкозы в СЖ, однако последующие исследования не продемонстрировали значимых различий в концентрации глюкозы при различных типах воспалительного ответа — септического и неинфекционного [21]. А одна из последних работ показала недостаточный дифференциально-диагностический потенциал содержания глюкозы в СЖ, соответствующий AUC = 0,853, по сравнению с другими маркерами, например уровнем лактата или прокальцитонина в СЖ [22].
Заметим также, что и концентрация протеина в СЖ в настоящее время считается ненадежным критерием дифференциальной диагностики между септическим и неинфекционным генезом воспаления.
Обнаружение кристаллов в синовиальной жидкости. В СЖ могут быть обнаружены несколько видов кристаллов, включая моно-урат натрия (monosodium urate monohydrate — MSU), пирофосфат кальция (calcium pyrophosphate dehydrate — CPPD), гидрокси-апатит натрия, кристаллы холестерина, ок-салата кальция, глюкокортикоидов и прочее. Несмотря на огромный перечень кристаллических структур, клиническое значение, т.е. значение для выбора методов лечения и оценки прогноза, имеет только выявление кристаллов Msu и cppD. Внедрение в рутинную лабораторную диагностику методов идентификации
Рис. 1. Септический артрит. Окраска по Граму. Иммерсия *1000. В препарате на фоне лейкоцитов — грамположительная кокковая флора.
кристаллов затруднено в силу традиционного мнения о необходимости использования поляризационной микроскопии (с последующим применением компенсатора) для обнаружения кристаллов. Однако проведенные Е. Pascual и соавт. [23] две серии исследований диагностической значимости световой микроскопии по сравнению с поляризационной продемон-
Рис. 2. Подагрический артрит. Нативный препарат *400. Цитоз 11 500 кл/ мкл. В препарате — бесцветные игольчатые кристаллы кислого мочекислого натра, «фагоцитированные» лейкоцитами.
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
биохимия
Рис. 3. Подагрический тофус. Нативный препарат *400. В препарате на фоне клеток крови — большое количество бесцветных игольчатых кристаллов кислого мочекислого натра, расположенных как по отдельности, так и в виде пучков.
стрировали чувствительность первого метода для обнаружения кристаллов, равную 96,2—100% при специфичности 100—97,1%. В целом диагностическая значимость световой микроскопии для диагностики кристаллических структур в двух описанных сериях наблюдений соответствовала 0,90 (0,897—0,902) и 0,96 (0,958—0,961). Таким образом, можно сделать важный для практической деятельности вывод о том, что при недоступности поляризационной микроскопии исследование СЖ должно проводиться с помощью обычного светового микроскопа.
Аналогичное мнение высказано В. Lumbreras и соавт. [24], которые подчеркивают, что кристаллы MSU и CPPD достаточно легко увидеть при обычной световой микроскопии, при этом объектив ><600 обеспечивает большее поле зрения, тогда как объектив ><1000 лучше использовать в процессе обучения, поскольку он обеспечивает лучшую оценку полиморфизма CPPD-кристаллов. И только после использования обычной микроскопии следует применять оценку кристаллов в поляризованном свете.
Суть действия поляризационного микроскопа заключается в том, что стекло с нанесенной на него СЖ помещается между двумя перпендикулярно расположенными поляризационными фильтрами. Линейный поляризационный фильтр позволяет свету проходить только вдоль одной плоскости, а при перпендикулярно расположенном втором фильтре последний препятствует прохождению данного линейного пучка света. Если кристалл обладает двулучепреломляющи-ми свойствами, он способен повернуть ось светового пучка, и, следовательно, свет попадает на второй фильтр под измененным углом. Именно поэтому двулучепреломляющие кристаллы видны как «блестящие» объекты в темном поле микроскопа.
Использование поляризационной микроскопии помогает идентифицировать на четверть
больше кристаллов МБи, чем при обычной световой микроскопии. При этом следует учитывать, что кристаллы СРРБ обладают слабым двулучепреломлением, в связи с чем их наличие зачастую может быть существенно лучше определено без применения поляризационного микроскопа — которое, напротив, снижает в пять раз возможность их идентификации [25, 26].
По общему мнению исследователей, использование компенсатора, который за счет получаемого цветного изображения позволяет оценить ориентацию кристаллической решетки, не обеспечивает дополнительных диагностических возможностей и не дает никакой дополнительной клинической информации [24, 25].
При интерпретации результатов кристаллоскопии СЖ клиницисту следует помнить о лож-нопозитивных и ложнонегативных результатах. Так, идентификационным порогом для выявления кристаллов является их концентрация около 10—100 мк/мл, в то время как в естественных условиях концентрация кристаллов может составлять всего 2—3 мк/мл [27]. Кроме того, размеры кристаллов СРРБ могут находиться в диапазоне от 0,4 до 20 мкм, а большинство из них имеют длину менее 1 мкм — как раз того порогового значения, которое позволяет выявить их с помощью световой микроскопии [28]. Ложнопо-зитивные заключения чаще всего связаны с недостаточным опытом и квалификацией врачей лабораторной диагностики и с неправильной идентификацией артефактов.
Кристаллы МSU хорошо видны при обычном свете, они имеют форму иглы, и их размер колеблется от очень маленького до примерно в 2 раза превышающего диаметр нейтро-фильного лейкоцита. Кристаллы МSU могут располагаться и внутриклеточно, и внеклеточно (рис. 2). Для обучения
Рис. 4. Пирофосфатная артропатия. Нативный препарат ><400. Цитоз 87 500 кл/мкл, нейтрофилы — 85%. В препарате на фоне детритных масс — большое количество лейкоцитов с выраженными дегенеративными изменениями. Обнаружены кристаллы пирофосфата кальция в значительном количестве в виде разнообразных форм — игольчатые и ромбовидные.
russian clinical laboratory diagnostics. 2016; 61(8)
doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-478-484
идентификации кристаллов MSU полезным является микроскопия содержимого тофуса. Белый крошковидный материал помещается на предметное стекло, и при микроскопии хорошо видно, что образец состоит почти исключительно из кристаллов MSU (рис. 3).
Клиническое значение, определяющее дальнейшую тактику ведения пациентов — а именно инициацию уратснижающей терапии, — имеет тот факт, что кристаллы MSU могут быть определены в СЖ, полученной из асимптомных суставов, например, в межприступный период. Е. Pascual и V.A. Jovani [29], исследуя СЖ не воспаленных на момент артроцентеза суставов пациентов с подагрой, обнаружили кристаллы MSU в 43 из 43 образцах СЖ у больных, не получающих гипоурикемические препараты, и у 34 из 48 пациентов на фоне уратснижающей терапии. Наличие кристаллов в СЖ может являться потенциалом, способствующим периодическим обострениям подагрического артрита. Возможно, что обнаружение или отсутствие кристаллов Msu могло бы являться критерием для определения длительности уратснижающей терапии, однако до настоящего времени подобные работы не проводились.
Кристаллы CPPD имеют полиморфную структуру: можно обнаружить ромбовидные кристаллы, кристаллы с формой параллелепипеда, а также игловидные (рис. 4), что требует проведения дифференциальной диагностики с Msu (именно в этом случае может оказаться полезной поляризационная микроскопия). Важно учитывать, что очень часто кристаллы CPPD располагаются внутриклеточно [30], даже в отсутствие воспаления, обычно в виде небольших квадратов или игл.
И наконец, следует указать, что в ряде случаев возможно одновременное наличие двух патологий — микрокристаллической артропатии и септического артрита [31]; таким образом, выявление кристаллов в СЖ не исключает необходимости окраски по Граму и проведения бактериологического исследования.
Новые диагностические возможности в исследовании синовиальной жидкости. Продолжаются поиски новых биохимических маркеров, которые бы позволили с более высоким уровнем чувствительности и специфичности диагностировать септическое поражение суставов. Ниже мы приводим результаты некоторых работ и хотим подчеркнуть, что на сегодняшний день они выполнены на небольших выборках пациентов и носят наблюдательный характер.
Прокальцитонин. Среди новых лабораторных методик заслуживает внимания определение содержания прокальци-тонина (PCT) в СЖ. Оказалось, что чувствительность метода для диагностики септического артрита при уровне РСТ более 0,5 нг/мл составляет 87%, а специфичность — 94,4%. С учетом AUC = 95,1% (95% ДИ 90,5—99,6%) для PCT синовиальной жидкости можно предположить, что именно последний показатель может иметь диагностическое значение в дифференциальной диагностике септического и негнойного артритов [32].
Лактат. Определение концентрации лактата в СЖ выделено как перспективный тест с высоким дифференциально-диагностическим потенциалом в случае инфекционного и асептического генеза артрита. При оценке 82 проб СЖ установлено, что чувствительность метода составляет 89,5%, специфичность — 77,3%, отрицательное отношение правдоподобия LR = -0,14, а AUC = 0,901. Уровень лактата в СЖ выше 10 ммоль/л является практически патогномонич-ным признаком септического артрита, а концентрация ниже 4,3 ммоль/л делает этот диагноз крайне маловероятным [33].
Заключение. В настоящее время не существует общепринятых протоколов исследования синовиальной жидкости. В реальной клинической практике прикладное значение имеет раннее выявление септического характера поражения суставов, а также установление микрокристаллического генеза ар-тропатий. С этой целью минимальный общедоступный объ-
biochemistry
ем исследования синовиальной жидкости должен включать определение числа лейкоцитов в объеме жидкости и доли полиморфноядерных клеток, исследование на содержание кристаллов при обычной световой микроскопии, окраску по Граму и культуральное исследование СЖ, все это — с обязательным учетом клинических данных. Традиционная оценка содержания глюкозы и протеина в СЖ малоинформативна. Поляризационная микроскопия может являться дополнительным методом выявления кристаллов, однако чувствительность и специфичность световой микроскопии достаточно высока, в связи с чем отсутствие поляризационного микроскопа не может являться препятствием для верификации кристаллов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/ REFERENCES
1. Denton J. Synovial fluid analysis in the diagnosis of joint disease. DiagnosticHistopathology. 2012; 18(4): 159—68.
2. Brannan S.R., Jerrard D.A. Synovial fluid analysis. J. Emerg. Med. 2006; 30(3): 331—9.
3. Stirling P., Faroug R., Amanat S., Ahmed A., Armstrong M., Sharma P. et al. False-negative rate of gram-stain microscopy for diagnosis of septic arthritis: suggestions for improvement. Int. J. Microbiol. 2014; 2014: 830857.
4. Von Essen R. Culture of joint specimens in bacterial arthritis: impact of blood culture bottle utilization. Scand. J. Rheumatol. 1997; 26(4): 293—300.
5. Font-Vizcarra L., Garcia S., Martinez-Pastor J.C., Sierra J.M., Soriano A. Blood culture flasks for culturing synovial fluid in prosthetic joint infections. Clin. Orthop. Relat. Res. 2010; 468(8): 2238—43.
6. Walker H.K., Hall W.D., Hurst J.W. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. Boston: Butterworths; 1990.
7. Coutlakis P.J., Roberts W.N., Wise C.M. Another look at synovial fluid leukocytosis and infection. J. Clin. Rheumatol. 2002; 8(2): 67—71.
8. Margaretten M.E., Kohlwes J., Moore D., Bent S. Does this adult patient have septic arthritis? JAMA. 2007; 297(13): 1478—88.
9. Carpenter C.R., Schuur J.D., Everett W.W., Pines J.M. Evidence-based diagnostics: adult septic arthritis. Acad. Emerg. Med. 2011; 18(8): 781—96.
10. Trampuz A., Hanssen A.D., Osmon D.R., Mandrekar J., Steckelberg J.M., Patel R. Synovial fluid leukocyte count and differential for the diagnosis of prosthetic knee infection. Am. J. Med. 2004; 117(8): 556—62.
11. Baran S., Price C., Hak D.J. Diagnosing joint infections: synovial fluid differential is more sensitive than white blood cell count. Eur. J. Orthop. Surg. Traumatol. 2014; 24(8): 1469—74.
12. Frischknecht J., Steigerwald J.C. High synovial fluid white blood cell counts in pseudogout; Possible confusion with septic arthritis. Arch. Intern. Med. 1975; 135(2): 298—9.
13. Ghanem E., Parvizi J., Burnett R.S., Sharkey P.F., Keshavarzi N., Aggarwal A. et al. Cell count and differential of aspirated fluid in the diagnosis of infection at the site of total knee arthroplasty. J. Bone Joint Surg. Am. 2008; 90(8): 1637—43.
14. Della Valle C.J., Sporer S.M., Jacobs J.J., Berger R.A., Rosenberg A.G., Paprosky W.G. Preoperative testing for sepsis before revision total knee arthroplasty. J. Arthroplasty. 2007; 22(6 Suppl.2): 90—3.
15. Schinsky M.F., Della Valle C.J., Sporer S.M., Paprosky W.G. Perioperative testing for joint infection in patients undergoing revision total hip arthroplasty. J. Bone Joint Surg. Am. 2008; 90(9): 1869—75.
16. Weston V.C., Jones A.C., Bradbury N., Fawthrop F., Doherty M. Clinical features and outcome of septic arthritis in a single UK Health District 1982—1991. Ann. Rheum. Dis. 1999; 58(4): 214—9
17. Geirsson A.J., Statkevicius S., Vikingsson A. Septic arthritis in Iceland 1990—2002: increasing incidence due to iatrogenic infections. Ann. Rheum. Dis. 2008; 67(5): 638—43.
18. Hindle P., Davidson E., Biant L.C. Septic arthritis of the knee: the use and effect of antibiotics prior to diagnostic aspiration. Ann. R. Coll. Surg. Engl. 2012; 94(5): 351—5.
19. Atkins B.L., Athanasou N., Deeks J.J., Crook D.W., Simpson H., Peto T.E. et al. The osiris collaborative study group prospective evaluation of criteria for microbiological diagnosis of prosthetic-joint infection at revision arthroplasty. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(10): 2932—9.
клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8) doi 10.18821/0869-2084-2016-61-8-484-489
биохимия
20. Shmerling R.H. Synovial fluid analysis: a critical reappraisal. Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994; 20: 503.
21. Swan A., Amer H., Dieppe P. The value of synovial fluid assays in the diagnosis of joint disease: a literature survey. Ann. Rheum. Dis. 2002; 61: 493—8.
22. Lenskia M., Scherera M.A. Analysis of synovial inflammatory markers to differ infectious from gouty arthritis. Clin. Biochem. 2014; 47(1—2): 49—55.
23. Pascual E., Tovar J., Ruiz M.T. The ordinary light microscope: an appropriate tool for provisional detection and identification of crystals in synovial fluid. Ann. Rheum. Dis. 1989; 48(12): 983 —5.
24. Lumbreras В., Pascual E., Frasquet J., González-Salinas J., Rodríguez E., Hernández-Aguado I. Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency. Ann. Rheum. Dis. 2005; 64(4): 612—5.
25. Dieppe P., Swan A. Identification of crystals in synovial fluid. Ann. Rheum. Dis. 1999; 58: 261—3.
26. Ivorra J., Rosas J., Pascual E. Most calcium pyrophosphate crystals appear as non-birefringent. Ann. Rheum. Dis. 1999; 58: 582—4.
27. Gordon C., Swan A., Dieppe P. Detection of crystals in synovial fluid crystal by light microscopy: sensitivity and reliability. Ann. Rheum. Dis. 1989; 48: 737—42.
28. SwanA.J., Chapman B., Heap P., Seward H., Dieppe P. Submicroscopic crystals in osteoarthritic synovial fluids. Ann. Rheum. Dis. 1994; 53(7): 467—70.
29. Pascual E., Jovani V.A. Quantitative study of the phagocytosis of urate crystals in the SF of asymptomatic joints of patients with gout. Br. J. Rheumatol. 1995; 34(8): 724 —6.
30. Martinez-Sanchis A., Pascual E. Intracellular and extracellular CPPD crystals are a regular feature in synovial fluid from uninflamed joints of patients with CPPD related arthropathy. Ann. Rheum. Dis. 2005; 64: 1769—72.
31. Yu K.H., Luo S.F., Liou L.B., Wu Y.J., Tsai W.P., Chen J.Y. et al. Concomitant septic and gouty arthritis — an analysis of 30 cases. Rheumatology (Oxford). 2003; 42(9): 1062—6.
32. Wang C., Zhong D., Liao Q., Kong L., Liu A., Xiao H. Procalcitonin levels in fresh serum and fresh synovial fluid for the differential diagnosis of knee septic arthritis from rheumatoid arthritis, osteoarthritis and gouty arthritis. Exp. Ther. Med. 2014; 8(4): 1075—80.
33. Lenski M., Scherer M.A. Analysis of synovial inflammatory markers to differ infectious from gouty arthritis. Clin. Biochem. 2014; 47(1—2): 49—55.
Поступила 26.02.16 Received 26.02.16
© БОРМОТОВА Е.А., ГУПАЛОВА Т.В., 2016 УДК 616.633.962.3-074
Бормотова Е.А., Гупалова Т.В.
тест-система для определения микроальбуминурии с использованием нового рекомбинантного альбумин-связывающего полипептида
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», 197376, Санкт-Петербург, Российская Федерация
Наиболее значимыми патологиями, обусловливающими нарушение экскреции белка с мочой, являются СД и АГ — именно эти заболевания наиболее опасны для почек. Поэтому важное значение имеет поиск ранних признаков поражения почек у больных этими заболеваниями. Одним из ранних признаков поражения почек у больных СД и АГ является микроальбуминурия. Только эта ранняя (доклиническая) стадия поражения почек является единственной обратимой при своевременном назначении медикаментозной терапии. Практически все применяемые в настоящее время диагностические тест-системы для выявления микроальбуминурии основаны на иммунологическом полуколичественном и количественном определении концентрации ЧСА в моче. В настоящей работе использован новый рекомбинантный ЧСА-связывающий полипептид А3 из штамма стрептококка группы G, выделенного из коровьего молока. Изучена ЧСА-связывающая способность полипептида А3 в сравнении с таковой у полипептида А2. Рекомбинантный ЧСА-связывающий полипептид А2 ранее был впервые применен в тест-системе для выявления микроальбуминурии вместо обычно используемых антител. Изучение ЧСА-связывающей способности рекомбинантных полипептидов А3 и А2 показало, что оба они способны вступать во взаимодействие с ЧСА как в растворе, так и в адсорбированном состоянии. Это свойство позволило использовать полипептид А3 в иммобилизованном виде в количественной тест-системе для определения микроальбуминурии. В настоящей работе также предлагается специфический и чувствительный метод скрининга и мониторинга больных СД и АГ, в котором был использован меченый ЧСА-связывающий полипептид А3 в сочетании с технологией микрочипа. В результате сравнения тест-систем с использованием рекомбинантных полипептидов А2 и А3 было выявлено, что использование в тест-системе полипептида А3 позволяет более точно определить концентрацию ЧСА в пробах мочи. Такая тест-система успешно применена как для выявления, так и для количественного определения микроальбуминурии у больных СД и АГ.
Ключевые слова: микроальбуминурия; рекомбинантный полипептид; ЧСА-связывающая способность; микрочип.
Для цитирования: Бормотова Е.А., Гупалова Т.В. Тест-система для определения микроальбуминурии с использованием нового рекомбинантного альбумин-связывающего полипептида. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(8): 484-489. DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-8-484-489 BormotovaE.A., Gupalova T.V.
THE TEST-SYSTEM FOR DETECTION OF MICROALBUMINURIA USING THE NEW RECOMBINANT ALBUMIN-BOUNDED POLY-PEPTIDE
The institute of experimental medicine, 197376 St. Petersburg, Russia
Д л я к о р р е с п о н д е н ц и и: Гупалова Татьяна Виталиевна, д-р биологических наук, веду. сотр. отд. молекулярной микробиологии ФГБНУ «ИЭМ», е-mail: [email protected]
