CC BY
57
2004 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. .4
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 576,858 • • ■
И. Н. Гапонова, А. В. Мигунова, К. В. Квитко '
ИССЛЕДОВАНИЕ СЕКРЕЦИИ САХАРОВ СЕВЕРНЫМИ ЗООХЛОРЕЛЛАМИ - СИМБИОНТАМИ PARAMECIUM BURSARIA В УСЛОВИЯХ IN VIVO И IN VITRO*
Введение. Способность к взаимовыгодному сосуществованию определенных Chlorella sp. с гидрой (Hydra viridis) и инфузорией (Paramecium burs aria) стали изучать дос- _ таточно давно и довольно подробно [6, 8, 13, 17]. Мутуалистический характер такого сосуществования основан, прежде всего, на метаболических отношениях между партнерами. Изучение водорослей и инфузорий в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella sp. -PBCV (вирус хлореллы) продолжалось и после открытия вирусов, лизирующих определенные штаммы зоохлорелл [2, 4, 5, 7,11, 12, 15, 16]. Показано, что в присутствии симбиотических водорослей инфузория становится частично независимой от бактерий, которыми она питается. Водоросли-эндосимбионты характеризуются интенсивной фотосинтетической активностью, продолжающейся даже при слабом освещении [3].
При недостатке пищи и обилии света, а также в минеральной питательной среде зеленые P. bursaria растут значительно быстрее особей того же штамма, экспериментальным путем лишенных зоохлорелл. Водоросли передают инфузории большую часть продуктов фотосинтеза, которые оказываются важной добавкой к источникам питания. При этом до 57% всего фиксированного углерода поступает в организм хозяина в виде сахаров (мальтоза, глюкоза, глюкоза-6-фосфат) [1,6].
В условиях in vitro освобожденные от клетки-хозяина симбиотические хлореллы сек-ретируют в питательную среду относительно большое количество углеводов, в среднем от 50 до 85% [13, 17].
Для штамма NC64A в работе Л. Мускатина определено, что 95% фиксированного в процессе фотосинтеза углерода высвобождается в виде мальтозы [13]. В работе Э. Кеслера с соавторами [10] показано, что выделенные из клетки симбионты секретируют разные сахара: глюкозу (Г), мальтозу (М) и глюкозо-6-фосфат, это зависит от штамма и от величины pH среды в момент фотосинтеза [10]. Зоохлореллы, которые мы отнесли к северному экотипу, отличаются от южных форм чувствительностью к вирусу северного экотипа и имеют температурный порог: растут при температуре ниже 32°С [4, 5]. Для «северного» штамма 241-80 показано, что доля глюкозы в выделяемых сахарах пропорциональна величине pH и увеличивается от 5% при pH 4 до 60% при pH 6,0 [10].
В данной работе исследовалось качественное и количественное соотношение Г и М, выделенных «северными» штаммами Chlorella sp. в условиях in vivo и in vitro, в сравнении с соотношением глюкозы и мальтозы у «южных» зоохлорелл. Кроме того, исследуя секрецию, в условиях in vivo мы попытались проследить влияние вируса, имеющегося в симбиотической системе, на соотношение сахаров.
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 02-04-48676). О И. Н. Гапонова, А. В. Мигунова, К. В. Квитко, 2004 .
Внутри клеток инфузорий pH может колебаться в широких пределах, но имеются данные,.что в периальгальных вакуолях она находится на уровне 4-4,5. Во всяком случае при испытании зоохлорелл, способных колонизовать клетку хозяина, отмечали, что колонизуют хозяина лишь зоохлореллы, способные расти при pH 4,0 [9, 10].
Материалы и методы. Для оценки продукции сахаров зоохлореллами был осуществлен фотосинтез в атмосфере с |4С меченой углекислотой с последующей идентификацией меченых продуктов фотосинтеза радиоавтографией. В работе использовались симбиотические штаммы водорослей и культуры зеленых (имеющих симбионтов) инфузорий. Клетки водорослей для опыта выращивали на среде Болд-Бристоль (состав ВВМ, мг/л: NaNCb -250; КН2РО4 - 175; К2НРО4 - 75; CaCIi • 2НгО - 25, MgS04 ■ 7НгО - 75; NaCl - 25; микроэлементы - 1 мл) с добавкой до 5% сахарозы и 1% пептона. Клоны инфузорий поддерживали в пробирках с бактериальной суспензией Enterobacter aerogenes в отваре сухих листьев салата (0,45 r/л воды) при постоянном освещении люминесцентными лампами 0,5-2 тыс. лк, при 13-18°С. Часть' коллекции испытуемых водорослей и штаммов инфузорий описана ранее [4, 12]. Инфузории серии AZ (Астраханский заповедник) предоставлены нам М. С. Раутиан для совместной работы по определению вирусоносительства [14], культуры серии ЗК выделены нами в береговой зоне р. Кереть возле Закола.
Клетки зоохлорелл смывали минеральной средой ВВМ pH 6,0. Густую взвесь клеточной суспензии объемом 150 мкл с добавкой 20 мкл раствора КН14СОз экспонировали в атмосфере меченой углекислоты. ’
Для исследования секреции углеводов в условиях in vivo, т. е. в клетках P. bursaria, пробы готовили следующим образом: инфузории отмывали центрифугированием в режиме 1 тыс. обУмин в течение 10 мин, затем удаляли супернатант, к осадку добавляли 150 мкл среды ВВМ и все содержимое переносили в эппендорф, объемом 1,5 мл. К исследуемым пробам инфузорий также добавляли радиоактивную метку - КН|4СОз из расчета 20 цс на 20 мкл раствора и экспонировали на свету (10-20 килолюкс) в течение 60 мин в закрытой чашке Петри. После экспозиции пробы фиксировали горячим этанолом, и спиртовой экстракт культуральной среды и клеток наносили (по 20-40 мкл на пробу) на пластины Silufol (Kavalier, Chechia) с тонким слоем крупнопористого силикагеля с последующим разделением по 1,5-2 ч один или два раза в растворителе - верхняя фаза смеси бутанол : этанол : вода (4:1:5). В крайние точки хроматограммы наносили «свидетели» - смесь по 50 мкг/мл мальтозы и глюкозы. Листовая негативная пленка (130 ед. ГОСТ) экспонировалась на поверхности хроматограммы в течение 2-5 суток. Количественные оценки интенсивности включения мс.- метки в участках хроматограммы, соответствующих мальтозе и глюкозе, определяли по доле засветки на негативах радиоавтографов с помощью программы «Фотошоп». Для этого на сканированном изображении негатива радиоавтографа выделяли узкую полоску (900-950 пикселей) в 3 разных местах в пределах каждого из участков, соответствующих пятнам глюкозы, мальтозы и не идентифицированного полимера, и с помощью меню «Гистограмма» оценивали долю темных точек. Вычитали вклад фоновой засветки в том же участке хроматограммы и таким образом определяли средние значения интенсивности окраски пятна, обозначенные как Д. Соотношение количеств метки в пятне каждого из сахаров (в %) определяли от суммарного количества Д всех углеводов. Было проведено 2 эксперимента: при высокой концентрации метки (табл. 1) и уменьшенном ее количестве. .,
Таблица 1. Соотношение метки С14 (А) в сахарах, синтезированных южными . и северными штаммами зоохлорелл in vitro
Штамм Полимер Мальтоза Глюкоза Экотип зоохлорелл Место изоляции
Д % Д % Д %
NC64A* 164,3 54,4 115,5 38,2 22,4 7,4 Южный США
NC64A 26 59,8 17,5 40,2 0 0 • « «
ОЧ* 169,7 45,2 123,5 32,9 81,8 21,8 Северный Россия, Карелия, оз. Черливое
241-80 61,9 44,9 50.5 36,6 25,5 18.5 « Германия
ОС-1 67,8 33,8 71,3 35,5 61,7 30,7 « о. Средний
ОС-6 54,7 30,2 65,8 36,3 60,5 33,4 « «
CALU-157 74,8 33,1 74,4 32,9 76,9 34,0 С вободноживущий . р. Кубань
Примечание. Д - среднее число «черных точек» на радиоавтографе в районе соответствующего сахара,~характеризующее интенсивность синтеза; * — использовались повышенные дозы радиоактивной углекислоты. •
Результаты исследований и обсуждение. Проведено исследование трех штаммов Chlorella sp. из популяций инфузорий пресных водоемов на побережье Белого моря, в том числе штамма 04 из культуры P. bursaria 04-1, обитателя оз. Черливое, и изолятов из водоемов о-ва Средний: ОС-1, ОС-6. Все эти штаммы были ранее охарактеризованы как принадлежащие к симбиотической системе северного экотипа (северные зоохлореллы). В качестве контроля были взяты 2 штамма зоохлорелл (из Геттингена, 241-80 - северный штамм и штамм NC64A - южный, из американских популяций), для которых ранее было показано различие по типу выделяемых сахаров [10]. .
Была получена радиоавтограмма продуктов фотосинтеза двух штаммов зоохлорелл -южных и северных, секретирующих сахара в питательную среду. Прослеживается четкая разница между штаммами. Среди продуктов фотосинтеза встречаются глюкоза, мальтоза и ее неидентифицированный полимер, но южный штамм NC64A секретирует преимущественно мальтозу и незначительное количество глюкозы в среду, как было указано в работе JI. Мускатина с соавторами [13], а северный штамм 04 выделяет и мальтозу, и глюкозу. Количественная оценка фотосинтетических продуктов представлена в табл. 1, из которой видно, что количество мальтозы у этих штаммов одного порядка, а доля.меченой глюкозы у северного штамма 04 приблизительно в три раза больше. .
Затем мы получили радиоавтограмму продуктов фотосинтеза северных штаммов Chlorella sp. - ОС-1, ОС-6, выделяющих углеводы в условиях in vitro. Штамм CALU-157 из коллекции БиНИИ был взят для сравнения симбиотических водорослей со свободноживу-щими хлореллами. Северные штаммы зоохлорелл проявили единообразие в отношении выделяемых углеводов. На радиоавтографе обнаруживаются пятна глюкозы, мальтозы и неиз-.. вестного полимера. Активность свободноживущего штамма CALU-157, судя по интенсивности радиоактивных пятен, относительно большая, и среди продуктов фотосинтеза можно выделить пятна, соответствующие глюкозе, мальтозе и ее полимеру.
Количественное соотношение радиоактивной метки в сахарах представлено в табл. 1, из которой видно, что северные штаммы — ОС-1, ОС-6 и 241-80 выделяют приблизительно одинаковое количество мальтозы; у штаммов ОС-1 и ОС-6 количество глюкозы сходно, а штамм 241-80 секретирует сравнительно меньшее количество глюкозы (почти в 2 раза). В повторной пробе, при данных условиях эксперимента, южный штамм NC64A не выделяет глюкозы. '
Для исследования секреции углеводов in vivo в работу были включены культуры зеленых (с эндосимбионтами) инфузорий, собранные из водоемов о-ва Средний и культур из Петергофа, Волгограда, Астрахани, а также США и Японии. Клоны инфузорий отличались друг от друга по наличию или отсутствию вируса зоохлорелл северного или южного экотипа.
Принадлежность зоохлореллы к определенному экотипу в культуре инфузории ЗК-41-1 нуждается в уточнении, поскольку мы не обнаружили у нее вирус, но, вероятнее всего, это северный штамм. Все северные культуры инфузорий имеют зоохлореллы, которые выделяют глюкозу, мальтозу и ее полимер. Их соотношение - индивидуальная характеристика каждой культуры, что следует из данных табл. 2, где дана количественная оценка выделяемых сахаров. Северные зоохлореллы из беломорских культур инфузорий выделяют глюкозу и мальтозу, количество которых различается несущественно. Наличие вирусоносительства в культурах парамеций не сказалось на признаке «продукция сахаров». Все культуры, у которых отмечено вирусоносительство, проявляют однотипность в выделении сахаров. Они выделяют приблизительно одинаковое количество мальтозы и глюкозы, за исключением культуры ЗК-45-12, которая секретирует значительно больше глюкозы. Штамм УВ2-2, по результатам расчета, не выделяет глюкозы.
Принадлежность зоохлорелл в культурах В1-2, AZ17-6 и 96Кр-05 к южному или северному экотипу нуждается в уточнении, поскольку у них не был обнаружен вирус. Качественный состав выделяемых сахаров одинаков для всех зоохлорелл: обнаружена мальтоза, глюкоза и ее полимер; однако их количество варьирует. В табл. 2 дано соотношение радиоактивной метки в сахарах, синтезированных северными и южными зоохлореллами в условиях in vivo. Их соотношение - индивидуальная характеристика каждой культуры.
Таблица 2. Соотношение метки С14 (Д) в сахарах, синтезированных северными и южными зоохлореллами in vivo
Шифр клона инфузорий Полимер Мальтоза Глюкоза Место изоляции Вирусо- носительство
Д % Д % Д % .
ЗК-41-1 86,8 56,1 51,5 33,3 16,4 10,6 Карелия, р. Кереть -
ЗК-45-1 97,7 55,7 64,0 36,4 13,8 7,8 « С
ЗК-45-12 115,6 52,4 72,7 32,9 32,4 14,7 « • С
ЗК-45-4 57,2 62,9 27,56 30,2 6,3 "6,9 « С
95ПФ-59 96,0 62,2 54,0 35,0 4,4 2,9 Франция, Париж с
УВ2-2 41,6 77,3 12,2 22,6 0,0 0 . Украина, Винница с
AZ11-9 115,0 46,2 102,5 41,2 31,2 12,6 Астрахан. заповедник с
AZ17-6 132,8 58,3 ' 73,8 32,4 21,1 9,3 « -
В1-2 148,7 43,0 120,6 34,8 76,7 22,2 Волгоград -
96Кр-05 60,2 55,1 38,4 35,2 10,6 9,7 Петергоф -
АБ-6-70 126,0 53,9 85,6 36,7 22,0 9,4 США, Бостон ' ю
. KZ1-11I 79,8 36,0 94,6 42,7 47,3 21,3 • Япония . ю
Водоросли из Р. bursaria южного экотипа в условиях in vivo секретируют большое-количество мальтозы, так же как и в условиях in vitro, где преобладающим сахаром является мальтоза. Вместе с тем варьирование доли глюкозы в сопоставлении с опытами in vitro можно объяснить варьированием pH в клетках инфузорий.
Заключение. Исследовано выделение углеводов северными зеюхлореллами, находящихся вне клеток хозяина и внутри него. Северные зоохлореллы секретируют в среду много мальтозы, немного меньше глюкозы. Показано их сходство по спектру и количеству выделяемых сахаров.
Итак, среди продуктов фотосинтеза зоохлорелл в культурах инфузорий обнаруживаются глюкоза, мальтоза и ее полимер. Зоохлореллы из беломорских культур в основном отличаются по интенсивности метки в глюкозе (см. табл. 2). В отличие от них водоросли-обитатели южного экотипа P. bursaria, в условиях in vivo, секретируют большое количество мальтозы, так же как и в условиях in vitro, где преобладающим сахаром является мальтоза. Предложенная нами методика позволяет определить лишь качественный состав продуктов фотосинтеза и оценить приблизительно интенсивность метки. Для более точного количественного определения выделенных сахаров нужно учитывать трудно различимые визуально следовые их количества, принимать во внимание наложение двух радиоактивных пятен и т. д. .
Кроме того, мы исследовали культуральную жидкость с находящимися в ней клетками зоохлорелл (условия in vitro), в то время как Л. Мускатин [13] анализировал культуральную .жидкость, свободную от клеток. В связи с этим мы получили большой набор продуктов, мешающих точному количественному определению углеводов. Необходимо отметить, что фотосинтез in- vitro при pH 6,0 ярче выявляет характеристики двух групп зоохлорелл, процесс фотосинтеза в периальгальных вакуолях (pH около 4,0) менее контролируем; при такой кислотности и in vitro процессы секреции сахаров у северных и южных зоохлорелл различаются не так контрастно. Поэтому выявленная нами индивидуальная изменчивость фотосинтеза в инфузориях укладывается в принятую нами парадигму.
Авторы благодарят профессора, докт. биол. наук И. М. Магомедова за содействие в проведении экспериментов с меченой углекислотой, мы признательны канд. биол. наук А. С.'Чунаеву зй консультации в освоении программы «Фотошоп». .
Summary
Gaponova I. N„ Migunova A. V., Kvitko К. V. The investigation of carbohydrates secretion by the northern zoochlorellas - Paramecium bursaria symbionts under in vivo and in vitro conditions. ..
Carbohydrates secretion by different zoochlorella strains (northern and southern ecotypes) was investigated. Determined as products of photosynthesis in the media with КН|4СОз were: glucose, maltose and an unidentified polymer. In vitro strains of the two groups were different: the southern strains were secreters of maltose more than glucose, northern zoochlorells, on the contrary, gave more glucose than maltose. In vivo, in Paramecium bursaria, the sugar release type was an individual feature of the symbiont, among algae of both zoochlorella ecotypes there were all types of the sugar producers.
Литература
1. Бархатов Ю. В., Хромечек Е. Б., Губанов В. Г., Оценка бактериальной составляющей на жизнеспособность симбиотического комплекса Paramecium bursaria (инфузория-зоохлорелла) // Экология. 2001. Июль - Август.-№ 4. С. 286-290. 2. Квитко К. В., Громов Б. В. Новые находки титруемого инфекционного вируса хлореллы // Докл. АН СССР. 1984. Т. 279, № 4. С. 998-999. 3. Кокова В. Печуркин В. Н.. Броднев П. В.. Темерова Т. А.. Пе-чуркин Н. С. Эндосимбиоз (зоохлорелла-инфузория) как простейшая модель симбиотического цикла // Красноярск, 1992. С. 3-31. 4. Мигунова А. В., Квитко К. В., Прокошева М. Ю., Литвинов Д. Б. Влияние температуры на размножение Paramecium bursaria, Chlorella, PBCV-1 вирусов в системе тройного симбиоза // Вестн. С.-Г1етерб. ун-та. 2000. Сер. 3- Вып. 1 (№3). С. 63—73. 5. Мигунова А. В., Квитко К. В., Скобло И. И., Прокошева М. Ю. Экология симбиотической системы: Paramecium bursaria - Chlorella - Virus // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 1999. Сер: 3. Вып. 3 (№ 17). С. 80-84. 6. Cernichiari E.,Muskatine L. Smith D. С. Maltose excretion by the symbiotic of Hydra viridis II Proc. Roy. Soc. B. 1969. Vol. 173. P. 557-576. 7. Gaponova 1. N.. Migunova A. V.. Andronov E. E., Kvitko К. V. Genomic dactiloskopy of «nothern» Chlorella strains - symbionts of Paramecium bursaria // Abstracts of 4 th International Symbiosis Society Congress Halifax. Nova Scotia. Canada. August 17-J23. 2003. P. 143-144. 8. Karakashian S. J. Growth of Paramecium bursaria as influenced by the presence of algal symbionts // Physiol. Zool. 1963. Vol. 36. P. 52-68. 9. Kessler E., Huss V A. R., Rahat A4. Species-specific ability of Chlorella strains (Chlorophyceae) to form stable symbioses with Hydra viridis // PI. Syst. Evol..l 988. Vol. 160. P. 241-246. 10. Kessler E., KauerG., Rahat M. Excretion of sugars by Chlorella species capable and Incapable of symbiosis with Hydra viridis II Bot. Acta.1991. Vol. 104. P. 58-63. 11. Kvitko К. V., Migunova A. V., Gaponova 1. N., Zelennicova O. A., Rautian M. S. Symbiotic system: Paramecium bursaria, Chlorella PBCViruses in southern and nothern populations // Schedule and Abstracts of 4th International Symbiosis Society Congress Halifax. Nova Scotia. Canada, August 17-23. 2003. P. 139.- 12. Linz B., Linz A., Migunova A. V., Kvitko К. V. Correlation between virus-sensitivity and isoenzyme spectrum in symbiotic Chlorella-like algae // Protistology. 1999. Vol. 1. P. 76-81. 13. Muscatine L., Karakashian S. J., Karakashian M. W. Soluble extracellular products of algae symbiotic-with a ciliate, a sponge and a mutant Hydra // Comp. Biochem. Physiol. 1967. Vol. 20. P. 112. 14. Rautian M. S., YaschenkoW., PotekchinA., Migunova A., Kvitko K. Triple symbiotic system of Paramecium bursaria - Chlorella - Chlorella viruses: study by means of pulsed field gel electrophoresis II Program and Abstracts of 4th European Congress of Protistology and 10 th European Conference on Ciliat Biology, San Benedetto del Tronto (AP) Italy. August 31 - September 5. 2003. P. 52. 15. Van Etten J. L. Unusual life style of giant Chlorella viruses // Annu. Rev. Genet. 2003. Vol. 37. P. 153—195. 16. Van Etten J. L.. MeintsR. H., Kuczmarski D.. Burbank D. E., Lee K. Viruses of symbiotic chlorella-like algae isolated from Paramecium bursaria and Hydra viridis II Proc'. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. Vol. 79. P. 3867-3871. 17. Ziesenisz £., Reisser W., WeisserW. Evidence of de novo synthesis of maltose excreted by the endosymbiotic Chlorella from Paramecium bursaria II Planta. 1981. Vol. 153. P. 481-485.
Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г.
