Исследование роли окислительного стресса и уровня IL-6 в перитонеальной жидкости в развитии эндометриоза

Волгина Н.Е.; Щипицына В.С.; Хилькевич Е.Г.; Чупрынин В.Д.; Адамян Л.В.; Красный Алексей Михайлович

ORIGINAL ARTICLE

Волгина Н.Е.1, Щипицына В.С.1, Хилькевич Е.Г.1, Чупрынин В.Д.1, Адамян Л.В.1, Красный А.М.1'2

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И УРОВНЯ IL-6 В ПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В РАЗВИТИИ ЭНДОМЕТРИОЗА

1ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г Москва, Россия; 2«Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН», 119991, г Москва, Россия

Эндометриоз - заболевание неясной этиологии, и окислительный стресс (ОС) в перитонеальной жидкости (ПЖ) рассматривается как возможная причина развития заболевания. В ПЖ активные формы кислорода (АФК) в основном генерируются макрофагами как провоспалительного М1, так и противовоспалительного М2 фенотипа. Свободное железо, связываясь в ПЖ с перекисью водорода с образованием гидроксильных радикалов, является компонентом ОС.

В данной работе выявлена связь между уровнем АФК, уровнем антиоксидантов, концентрацией ионов железа и провоспалительного цитокина интерлейкина-6 (IL-6), продуцируемого макрофагами М1 в ПЖ, и развитием эндо-метриоза.

Исследована ПЖ, полученная от двух групп женщин. В основную группу включены 25 женщин с инфильтративным эндометриозом, в группу сравнения - 20 женщин с миомой матки.

Уровень АФК и уровень антиоксидантов был оценен с помощью прибора FORM 3000 («Каллегари», Италия) с использованием тестов FORT, FORD соответственно. Измерена концентрация ионов железа колориметрическим методом и IL-6 - методом ИФА в ПЖ.

Установлено, что уровни АФК и антиоксидантов в ПЖ исследованных групп не различаются. Обнаружена повышенная концентрация ионов железа в ПЖ в основной группе. Установлено, что концентрация IL-6 повышена в основной группе. Выявлена корреляция между концентрацией IL-6 и уровнем АФК у женщин с эндометриозом. В группе сравнения корреляции между уровнем IL-6 и уровнем АФК не обнаружено.

Данное исследование позволяет предположить, что ОС не влияет на развитие эндометриоза. Повышение уровня ионов железа, возможно, связано с повреждениями сосудов перитонеальной брюшины очагами эндометриоза. Развитие эндометриоза приводит к активации макрофагов М1, образующих одновременно IL-6 и АФК, а также способных к элиминации эндометриоидных клеток. Уровень IL-6, таким образом, может характеризовать способность организма к сопротивлению эндометриозу.

Ключевые слова: эндометриоз; миома; перитонеальная жидкость; окислительный стресс; железо; интерлейкин-6 (IL-6).

Для цитирования: Волгина Н.Е., Щипицына В.С., Хилькевич Е.Г., Чупрынин В.Д., Адамян Л.В., Красный А.М. Исследование роли окислительного стресса и уровня IL-6 в перитонеальной жидкости в развитии эндометриоза. Иммунология. 2016; 37 (3): 181-184. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-3-181-184

Volgina N.E.1, Shchipitsyna V.S.1, Khilkevich E.G.1, Chuprynin V.D.1, Adamyan L.V.1, Krasnyy AM.1, 2

THE ROLE OF OXIDATIVE STRESS AND IL-6 LEVEL IN PERITONEAL FLUID IN THE DEVELOPMENT OF

ENDOMETRIOSIS

'VI. Kulakov Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russian Federation, 117997, Moscow, Russia; 2N.I. Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences, 119991, Moscow, Russia

Endometriosis is a disease of unknown etiology, and oxidative stress (OS) in peritoneal fluid жидкости (PF) is considered as a possible cause of the disease development. In PF the reactive oxygen species (ROS) are mainly generated by the macrophages of both pro-inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 phenotypes. Free iron which bounds in PF with hydrogen peroxide and forms hydroxyl radicals is OS component. We revealed a correlation between ROS level, antioxidant level, iron ions concentration, the level of pro-inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6) being produced by M1 macrophages in PF and endometriosis development.

We studied PF obtained from the women of 2 groups. The main group included 25 women with infiltrative endometriosis, the comparison group consisted of 20 women with uterine myoma. ROS and antioxidant levels were detected using FORM 3000 analyzer (Callegari, Italy) and FORT and FORD tests respectively. Iron ions concentration in PF was measured by colorimetric method and IL-6 level by EIA. ROS and antioxidant levels in PF in both groups were the same. Iron ions concentration and IL-6 level were increased in the main group. We revealed a correlation between IL-6 and ROS levels in endometriosis patients and no correlation in the comparison group.

The results suggest that OS does not influence on endometriosis development. Iron ions concentration increase is probably due to the damage of blood vessels of peritoneal peritoneum in endometriosis foci. Endometriosis development leads to activation of M1 macrophages, producing simultaneously IL-6 and ROS and also being able to eliminate endometrial cells. Thus IL-6 level may characterize the ability of an organism to resist endometriosis.

Keywords: endometriosis; myoma; peritoneal fluid; oxidative stress; iron; interleukin-6 (IL-6).

Для корреспонденции: Красный Алексей Михайлович, канд. биол. наук, зав. лабораторией цитологии, НЦАГиП им. Кулакова, E-mail: [email protected]

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

For citation: Volgina N.E., Shchipitsyna V.S., Khilkevich E.G., Chuprynin V.D., Adamyan L.V., Krasnyi A.M. The role of oxidative stress and il-6 level in peritoneal fluid in the development of endometriosis. Immunologiya. 2016; 37 (3): 181-184. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-3-181-184

For correspondence: KrasnyiAlexeiMikhailovich, PhD, Head of the Laboratory of Cytology, "The V.I. Kulakov Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology" Ministry of Health of Russian Federation, E-mail: [email protected]

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Funding. This study was carried out with support of grant of President of Russian Federation № 14.W01.15.7521-MK.

Received 21.12.15 Accepted 18.02.16

Эндометриоз - распространенное гинекологическое заболевание у женщин репродуктивного возраста, вызывающее развитие дисменореи, бесплодия, в некоторых случаях приводящее к злокачественным трансформациям ткани. Значительное влияние на развитие эндометриоза оказывает перитонеальная жидкость (ПЖ), которая непосредственно соприкасается с очагами эндометриоза. В настоящее время эндометриоз рассматривается как локальный воспалительный процесс органов малого таза с измененными функциями клеток иммунной системы в перитонеальном пространстве. Данная концепция опирается на последние исследования, показавшие, что в ПЖ женщин с эндометриозом содержится повышенное количество активированных макрофагов, которые секретируют различные продукты, такие как факторы роста, цитокины и свободные радикалы кислорода. Одной из причин развития эндометриоза называют повышенный окислительный стресс (ОС) в ПЖ [1]. В ПЖ присутствует более 6 млн лейкоцитов/мл, из которых 85% - макрофаги, активно продуцирующие цитокины [2]. Проведенные исследования показали, что цитокиновый статус женщин с эндометриозом характеризуется более высоким уровнем провоспалитель-ных цитокинов ГЬ-ф и ТОТа [3]. Наиболее активно изучаемым интерлейкином в ПЖ при эндометриозе является ГЬ-6. Некоторые авторы предлагают считать его единственным диагностическим признаком эндометриоза [4]. Однако у исследователей нет единого мнения относительно уровня ГЬ-6 в перитонеальной жидкости при эндометриозе [5, 6]. ГЬ-6 продуцируется провоспалительными макрофагами М1, способными элиминировать очаги эндометриоза [7]. При эндо-метриозе в ПЖ присутствуют также противовоспалительные макрофаги М2, способствующие регенерации поврежденной ткани, а также неактивированные (наивные) макрофаги. Макрофаги М1- и М2-фенотипа в зависимости от факторов микроокружения способны изменять свой фенотип [8]. Причиной активации макрофагов в состояние М2 может быть инфекция. Например, гонококки приводят к смене фенотипа М1 на М2. [9]. Все макрофаги вырабатывают АФК. Существуют данные, что при эндометриозе в перитонеальной жидкости повышены маркеры ОС [10]. Ионы железа являются важным компонентом развития ОС: они вступают в реакцию Фентона с перекисью водорода с последующим образованием гидрок-сильных радикалов. Известно, что при эндометриозе уровень свободных ионов железа выше нормы [11].

Целью данной работы было оценить роли ОС и уровня провоспалительного цитокина ГЬ-6 в перитонеальной жидкости у женщин в развитии эндометриоза.

Материал и методы

Биологический материал собирали у женщин, проходивших плановое лечение по поводу инфильтративного эн-дометриоза и миомы матки на территории Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Все пациентки были прооперированы в пролиферативную фазу менструального цикла. В основную группу были включены 25 женщин с инфильтративным эндометриозом Ш-ГУ стадии

по классификации Л.В. Адамян [12]. Группу сравнения составили 20 женщин с интерстициальным и интерстициально-субсерозным расположением миоматозных узлов. Средний возраст пациенток в обеих группах - 27,4±3,2 и 28,6±2,4 года соответственно. Критериями исключения стали острые воспалительные заболевания, тяжелая экстрагенитальная патология, аутоиммунные и онкологические заболевания. После одобрения этическим комитетом протокола исследования и подписания пациентами информированного согласия на сбор материала производили лапароскопическую аспирацию ПЖ из дугласова пространства.

Уровень АФК и антиоксидантной защиты определяли с помощью прибора FORM 3000 («Каллегари», Италия) с использованием тестов FORT, FORD соответственно. Тест FORT основан на способности ионов железа катализировать в присутствии гидроперекисей (ROOH) образование свободных радикалов кислорода, при связывании которых производное амина CrNH2 образует устойчивое окрашенное соединение. Интенсивность окраски прямо коррелирует с уровнем АФК в исследуемом образце. Тест FORD основан на взаимодействии предварительно образованных окрашенных радикалов с антиоксидантами исследуемого образца. Интенсивность окраски обратно коррелирует с уровнем антиоксидантов в исследуемом образце. Уровень АФК представлен в виде эквивалентного количества перекиси водорода (ммоль/л; Н2О2), уровень антиоксидантов - антиоксиданта тролокса (ммоль/л; тролокс). В качестве исследуемого материала использован образец ПЖ. Перед исследованием образец был центрифугирован при 800 g в течение 12 мин при 40С для освобождения от клеточной фракции. От момента забора ПЖ до проведения тестов проходило не более 30 мин. Тесты проводили согласно инструкции изготовителя.

Уровень ионов железа измеряли, основываясь на принципе колориметрической детекции устойчивого железо-феррозинового комплекса, образующегося в ходе реакции восстановления свободного железа ПЖ. Был использован коммерческий набор («Железо Агат», Россия). Измерения проводили согласно протоколу изготовителя.

Для определения уровня IL-6 в перитонеальной жидкости применяли набор для иммуноферментного анализа производителя «Вектор-Бест» (Россия) согласно протоколу производителя.

Значимость различий между выборками оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) со значением p < 0,05.

Достоверность корреляционных зависимостей определяли при помощи теста ранговой корреляции Спирмена. Достоверными считались корреляции при р < 0,05. Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение.

результаты

Проведенное измерение концентрации АФК и антиокси-дантов в группах женщин с инфильтративным эндометрио-зом и миомой матки не показало статистически значимых отличий (табл. 1). Концентрация ионов железа в ПЖ у женщин

ORIGINAL ARTICLE

Таблица 1

статистические данные распределения антиоксидантов, АФК, железа и цитокина IL-6 в перитонеальной жидкости пациенток с миомой матки и эндометриозом

Показатель

Эндометриоз

Миома

Уровень антиоксидантов (ммоль; тролокс)

Уровень АФК (ммоль; Н2О2)

Уровень железа (мкмоль)

Уровень IL-6 (нг/мл)

1,40±0,0б

1,55±0,07

2,57±0,20 2,б4±0,20

17,00±2,12* 11,51±1,2б*+ 171,39±50,45** б7,90±19,43**+

Примечание. * - p = 0,03 но сравнению с *+; ** - р = 0,027 но сравнению с **+.

с инфильтративным эндометриозом была в 1,5 раза выше (см. табл. 1), р = 0,03.

Исследование концентрации провоспалительного цитокина IL-6 в ПЖ показало, что уровень IL-6 в основной группе был выше в 2,5 раза (см. табл. 1), р = 0,027. Проведенный корреляционный анализ показал прямую зависимость между концентрациями IL-6 и АФК у женщин с эндометриозом (табл. 2), р = 0,00043. В группе сравнения корреляции между IL-6 и АФК не наблюдалось, р = 0,487.

Обсуждение

Неясный патогенез эндометриоза затрудняет подбор оптимального терапевтического лечения. Активно обсуждается использование в терапии наряду с традиционными гормональными препаратами различных антиоксидантов [13, 14]. Представлены данные, что антиоксиданты могут снижать у пациентов уровень боли в малом тазу [14]. В наших исследованиях мы не обнаружили различий между уровнями АФК и антиоксидантов в основной группе и группе сравнения, что позволяет предположить, что ОС не влияет на развитие эндометриоза. Из литературных данных известно, что в перитонеальной жидкости у больных с эндометриозом повышен уровень продуктов ОС [10]. Вероятно, это происходит вследствие обнаруженного нами в исследованиях повышения уровня ионов железа в ПЖ (см. табл. 1). Возможно, данное повышение уровня ионов железа связано с повреждениями сосудов перитонеальной брюшины очагами эндометриоза, и, таким образом, появление повышенного уровня продуктов ОС оказывается следствием эндометриоза, а не его причиной.

Мы установили, что уровень цитокина IL-6 в ПЖ в основной группе был выше в 2,5 раза по сравнению с группой пациенток с инфильтративным эндометриозом и миомой матки. Полученные данные показывают, что повреждение брюшины при эндометриозе приводит к активации макрофагов М1, которой не происходит в группе сравнения. Чтобы изучить источник АФК в ПЖ при эндометриозе, мы исследовали корреляцию между уровнем АФК и IL-6. Макрофаги М1, способные к элиминации эндометриоидных клеток, продуцируют цитокин IL-6. Обнаруженная нами корреляция между IL-6 и уровнем АФК позволяет предположить, что

Таблица 2

Корреляция спирмена между АФК и IL-6 в перитонеальной жидкости пациенток с миомой матки и эндометриозом

Диагноз Показатель 1 Показатель 2 rho p

Миома Уровень АФК, ммоль; Н2О2 IL-6, нг/мл 0,001 0,49

Эндометриоз Уровень АФК, ммоль; Н2О2 IL-6, нг/мл 0,93 0,0004

основным источником АФК при эндометриозе становятся макрофаги М1, которые вырабатывают АФК в процессе разрушения эндометриоидных очагов. Таким образом, уровень цитокина IL-6 может характеризовать способность организма к сопротивлению эндометриозу. Использование антиок-сидантов в данном случае может способствовать снижению активности макрофагов М1 и развитию эндометриоза. В группе сравнения в ПЖ, возможно, присутствуют макрофаги М2 или неактивированные макрофаги, образующие АФК и не синтезирующие IL-6.

Заключение

В данной работе продемонстрировано отсутствие связи между ОС и развитием эндометриоза. Также обнаружено, что АФК вырабатываются при эндометриозе макрофагами М1 и способствуют сопротивлению организма заболеванию. Концентрация цитокина IL-6 в ПЖ при эндометриозе может характеризовать количество макрофагов М1 и, соответственно, определять способность организма к сопротивлению эн-дометриозу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Данное исследование выполнялось при поддержке гранта Президента Российской Федерации № 14.W01.15.7521-MK.

литература

1. Gupta S., Agarwal A., Krajcir N., Alvarez J.G. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod. Biomed. Online. 2006; 13 (1): 126-34.

2. Bedaiwy M.A., Falcone T. Peritoneal fluid environment in endometriosis. Clinicopathological implications. Minerva Ginecol. 2003; 55 (4): 333-45.

3. Сухих Г.Т., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Верясов В.Н., Ванько Л.В. Особенности продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом. Бюл. экспер. биол. 2004; 137 (6): 646.

4. Wickiewicz D., Chrobak A., Gmyrek G.B., Halbersztadt A., Gabrys M.S., Goluda M., Chelmonska-Soyta A. Diagnostic accuracy of in-terleukin-6 levels in peritoneal fluid for detection of endometriosis. Arch. Gynecol. Obstet. 2013; 288 (4): 805-14.

5. Harada T., Yoshioka H., Yoshida S., Wabe T., Onohara Y., Tanikawa M. et al. Increased interleukin-6 levels in peritoneal fluid of infertile patients with active endometriosis. Am. J. Obstet. Gynecol. 1997; 176: 593-7.

6. Kyama C.M., Debrock S., Mwenda J.M., D'Hooghe T.M. Potential involvement of the immune system in the development of endometriosis. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003; 1: 123.

7. Capobianco A., Rovere-Querini P. Endometriosis, a disease of the macrophage. Front. Immunol. 2013; 28 (4): 9.

8. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 2008; 13: 453-61.

9. Ortiz M.C., Lefimil C., Rodas P.I., Vernal R., Lopez M., Acuña-Castillo C. et al. Neisseria gonorrhoeae modulates immunity by polarizing human macrophages to a M2 profile. PLoS One. 2015; 10 (6).

10. Polak G., Wertel I., Barczynski B., Kwasniewski W., Bednarek W., Kotarski J. Increased levels of oxidative stress markers in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2013; 168 (2): 187-90.

11. Yamaguchi K., Mandai M., Toyokuni S., Hamanishi J., Higuchi T., Takakura K., Fujii S. Contents of endometriotic cysts, especially the high concentration of free iron, are a possible cause of carcinogenesis in the cysts through the iron-induced persistent oxidative stress. Clin. Cancer Res. Offic. J. Am. Assoc. Cancer Res. 2008; 14 (1): 32-40.

12. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: Руководство для врачей. 2-е изд. М.: Медицина; 2006.

13. Santanam N., Kavtaradze N., Murphy A., Dominguez C., Parthasarathy S. Antioxidant supplementation reduces endometri-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

osis-related pelvic pain in humans. Transl. Res. 2013; 161 (3): 189-95.

14. Адамян Л.В., Бургова Е.Н., Сонова М.М., Арсланян К.Н. Значение системы антиоксидантной защиты в патогенезе и лечении больных с генитальным эндометриозом. Российский вестник акушера-гинеколога. 2008; (6): 20-3.

references

1. Gupta S., Agarwal A., Krajcir N., Alvarez J.G. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod. Biomed Online. 2006; 13 (1): 126-34.

2. Bedaiwy M.A., Falcone T. Peritoneal fluid environment in endometriosis. Clinicopathological implications. Minerva Ginecol. 2003; 55 (4): 333-45.

3. Sukhikh G.T., Sotnikova N.Yu., Antsiferova Yu.S., Posiseeva L.V., Veryasov V.N., Van'ko L.V. Features of the production of cytokines by immunocompetent cells of peritoneal fluid in women with external genital endometriosis. Byul. eksper. biol. 2004; 137 (6): 646. (in Russian)