CC BY
73
664.951:57.084.1
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИИ ИНФУЗОРИИ БТУБОШСША МУТИШ НА ФАКТОРЫ БЕЗОПАСНОСТИ СТЕРИЛИЗОВАННЫХ РЫБНЫХ КОНСЕРВОВ ПО СОДЕРЖАНИЮ БЕНЗ(А)ПИРЕНА
П.П. ПОТАПОВ \ Т.Н. РУЛЕВА2, О.Я. МЕЗЕНОВА1
1Калининградский государственный технический университет,
236000, г. Калининград, Советский пр-т, 1; тел.: (4012) 46-35-69, электронная почта: mezenova@klgtu.ru 2 Атлантический научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (АтлантНИРО), 236022, г. Калининград, ул. Дмитрия Донского, 5; тел.: (4012) 92-54-12, электронная почта: atlant@baltnet.ru
Проведен анализ физиологии питания и специфики биологического развития инфузорий Бґуїопускіа туґіїш. Обоснованы особенности выявления уровня безопасности стерилизованных рыбных консервов, потенциально содержащих в себе количество бенз(а)пирена, превышающее нормативный уровень, методом биотестирования на инфузориях Бґуїопускіа туґіїш с учетом влияния сопутствующих веществ. Сделаны выводы о невозможности контроля уровня бенз(а)пирена в пределах, установленных нормативными документами, с использованием Бґуїопускіа туґіїш при суточной экспозиции.
Ключевые слова: контроль безопасности пищевых продуктов, бенз(а)пирен, биотестирование, инфузории, Бґуїопу-скіа туґіїш.
Экспресс-контроль безопасности пищевых продуктов, многие из которых являются скоропортящимися, приобретает все более важное значение при оценке их качества. При анализе биологической безопасности кормов и сырья для их производства нормативно используются инфузории 31у1опуеЫа шуШт, что позволяет в относительно короткие сроки давать заключение о качестве продукции.
Нами проведены исследования по оценке возможности использования данных инфузорий для анализа безопасности рыбных стерилизованных консервов, потенциально содержащих химические токсиканты, поступающие по технологической цепочке из сырья, пищевых ингредиентов, тары. Цель работы - изучение ответных реакций стилонихий по отношению к бенз(а)пирену, содержащемуся в некоторых видах рыбных консервов из копченой рыбы. Для этого анализировали особенности физиологии пищеварения инфузорий стилонихий, устанавливали чувствительность тест-организмов к бенз(а)пирену, обосновали параметры пробоподготовки с учетом влияния шумовых (сопутствующих) факторов технологии рыбных консервов.
С учетом свойства бенз(а)пирена растворяться в органических растворителях при приготовлении модельной пробы к тестированию использовали водный раствор ацетонового экстракта.
В качестве тест-реакции была выбрана реакция ингибирования размножения при суточной экспозиции инфузорий. Этот выбор основан на следующих трех факторах. Тест-система представляет собой совокупность клеток, физиологическое состояние которых в каждый момент времени в общем случае неодинаково, их ответная реакция происходит не одновременно, а с некоторым временным разбросом. Второй фактор обусловлен длительностью процесса пищеварения (1218 ч), предполагающей, что для переваривания водного раствора смеси бенз(а)пирен-ацетон требуется относительно длительный период времени. Третий фактор связан со свойством бенз(а)пирена, называемым био-
аккумуляцией, т. е. проявлением своего воздействия лишь спустя длительное время.
Методическая основа проведения суточного эксперимента и методика приготовления водного раствора ацетонового экстракта в модифицированном виде взяты из нормативной документации [1, 2]. Источником бенз(а)пирена выбран государственный стандартный образец «Бенз(а)пирен в гексане» (ГСО 7515-98) с концентрацией 100 мг/кг. Гексан выпаривали при его температуре кипения (69°С), сухой остаток растворяли в ацетоне в том же объеме (2 мл). В качестве модельной навески применяли сухие пекарские дрожжи (2,5 г), разведенные в 7,5 г 2,7%-м раствором уксусной кислоты. Концентрация кислоты выбрана, исходя из ее минимально нормируемого содержания в консервах, потенциально содержащих бенз(а)пирен. Из основного раствора бенз(а)пирена готовили серию разведений (25; 10 мг/кг). Таким же образом тестировали основной раствор (100 мг/кг). После растворения дрожжей модельную навеску заливали 10 мл ацетона (контроль) или 9,5 мл ацетона и 0,5 мл бенз(а)пирена, растворенного в ацетоне (опыт). Навеску встряхивали в течение 10 мин, затем отстаивали в течение такого же времени. Дозатором осторожно отбирали надосадочный слой в объеме 0,5 мл и растворяли в 30 мл раствора Лози-на-Лозинского (минеральный раствор для культивирования стилонихий). Полученный водный раствор ацетонового экстракта тестировали на стилонихиях. Время экспозиции составляло 24 ч. Из суточной культуры инфузорий отбирали по 20 мкл среды с клетками в количестве 2-5 штук. Учет производили при помощи микроскопа МБС-10 производства «ЛЗОС» (Россия). После подсчета в лунки добавляли водный раствор ацетонового экстракта в количестве 200 мкл. Блок луночных микроаквариумов накрывали стеклом для предотвращения испарения. Через 24 ч подсчитывали количество стилонихий в контроле и в опыте. Критерием токсичности служило снижение прироста численности инфузорий в опыте относительно прироста численно-
сти в контроле в процентах. Прирост численности клеток АЖ определяли по формулам (1) и (2):
№ = N,-N0, (1)
где Ж,, N0 - средняя арифметическая численность клеток в конце и в начале анализа, шт.
Критерий токсичности Тв процентах рассчитывали по формуле
Т= ДЖоп/ДЖк • 100, (2)
где ДЖоп, ДЖк - прирост численности инфузорий в опыте и в контроле в конце анализа, шт.
Проведены исследования по определению порога выживаемости стилонихий по отношению к поваренной соли на серии растворов различной концентрации. При этом из суточной культуры отбирали по 20 мкл среды с инфузориями и помещали их в ячейки блока луночных аквариумов в количестве 5-15 шт. В лунки вносили исследуемый раствор в количестве 200 мкл. Продолжительность исследования составила 3 ч.
При выявлении уровня влияния на выживаемость инфузорий шумовых (технологических) факторов изучали реакции тест-организмов в зависимости от содержания уксусной кислоты. Была подготовлена серия растворов с различной концентрацией уксусной кислоты. Из суточной культуры отбирали по 20 мкл среды с инфузориями и помещали их в ячейки блока луночных аквариумов в количестве 5-15 шт. На анализы использовали исследуемый раствор в количестве 200 мкл.
По описанному выше механизму проводили исследования по установлению влияния на выживаемость инфузорий водного раствора ацетона различной концентрации.
При изучении биологических особенностей выбранных тест-объектов было установлено, что инфузории Б1у1опусЫа шуШш питаются преимущественно бактериями и прочими микроорганизмами, клетки которых они в состоянии заглотить. Крупные виды могут заглатывать клетки микроводорослей и различных простейших, в том числе и более мелких инфузорий. В процессе фагоцитоза поглощаются как пищевые, так и непищевые частицы. Инфузории не способны их различать. Адоральные (околоротовые) реснички создают ток воды, который направляет пищу к цитостому (клеточному рту). При поступлении пищи в эту зону плазматическая мембрана впячивается внутрь клетки и замыкается вокруг скопления пищи, образуя пищеварительную вакуоль, которая отшнуровывается от внешней мембраны и поступает в эндоплазму. После отшну-ровки в пищеварительной вакуоли начинается процесс биодеструкции, рН в ней резко снижается, и внутрь поступают пищеварительные ферменты. Через некоторое время рН среды в вакуоли повышается, и пищеварение продолжается в слабощелочной среде. Двигаясь в эндоплазме по четко определенному пути, пищеварительная вакуоль выделяет переваренные питательные вещества в эндоплазму [3].
Таким образом, пищеварение инфузории по своему механизму можно характеризовать как приближенное
к млекопитающим и использовать в качестве модельного по отношению к человеку.
Наряду с общими с другими инфузориями-седе-ментаторами чертами пищеварительного процесса, Б1у1опусЫа шуШш имеет ряд отличительных особенностей. Внутри клетки существуют взаимосвязанные пищеварительные структуры, позволяющие ей переварить большие объемы пищи. При этом скорость поглощения пищи и вместительная способность у стилонихий весьма высоки - до 70-80% объема клетки. Поглощенные пищевые частицы распределяются в три условно выделенные области - зоны А, В и С. При попадании пищи внутрь клетки зона А всегда остается пустой, а пища при этом скапливается в зоне В. Зона С заполняется лишь после того, как заполнена зона В. Ультраструктурные исследования 31у1опусЫа шуШш показали, что ее цитоплазма разделена на два структурно и функционально различных отдела. В первом находится цитоплазма с присутствующими в ней органоидами, во втором - организованная взаимосвязанная система пищеварительных каналов с многочисленными трубчатыми телами около 50 нм в диаметре. Каналы отсутствуют в зоне А, в то время как максимальная концентрация их располагается в зоне В. В процессе пищеварения пищевая частица всегда следует по пути из каналов и всегда окружена трубчатыми телами. Внутри каналов она лишена мембраны, образующей пищеварительную вакуоль. При этом захваченные инфузорией клетки, изначально имеющие мембрану, теряют ее при входе в систему каналов [4].
Исследования ученых Харбинского университета показали наличие кислой фосфатазы в трубчатых телах пищеварительных каналов, что свидетельствует о ее роли в процессе пищеварения. Установлено, что выделение кислой фосфатазы в клетках 8,у!опускШа шуШш из молодой (примерно 100 делений) и стареющей (примерно 2000 бесполых делений) культуры различается по времени выделения фермента после поглощения пищевой частицы клеткой. Пик действия фермента наступает на 1,5 ч раньше в клетках из молодой культуры. Весь пищеварительный процесс в клетках из молодой культуры занимает около 12 ч по сравнению с 18 ч в клетках из стареющей культуры. Исследователи также делают предположение, что в стареющих клетках 8,у!опускШа шуШш активность кислой фосфатазы понижена [5].
Важной характеристикой инфузорий как тест-объектов является стадия жизненного цикла. Установлено, что наибольшую чувствительность к токсичным веществам имеют только что разделившиеся клетки, в процессе дальнейшего развития клетки ее резистентность к токсичным веществам возрастает до следующего деления [3].
При использовании в качестве тест-объектов сво-бодноживущих инфузорий-седиментаторов токсичные вещества попадают в клетку как через поверхность клетки, так и в результате фагоцитоза. Таким образом, осуществляется комбинация обоих способов нанесения возмущающего воздействия на тест-систему. Это является большим преимуществом инфузорий как тест-объектов. Во-первых, за счет фагоцитоза сущест-
§
100
80
60
40
20
0
100
25
10
Концентрация бенз(а)пирена, мг/кг, вносимого в ацетоновый экстракт
Рис. 1
венно увеличивается скорость проникновения токсичных веществ в клетку, и без того довольно большая за счет большой удельной поверхности клетки. Во-вторых, некоторые вещества, сами по себе малотоксичные, в желудочно-кишечном тракте животного могут претерпевать химические изменения, в результате чего их токсичность возрастает многократно. В методиках, которые используют наружный способ нанесения воздействия на тест-систему, такие вещества могут оказаться невыявленными. В то же время, как в опытах на инфузориях, которые имеют пищеварительную систему, в некотором отношении подобную высшим организмам, эти вещества проявят свое действие. При этом нерастворимые в воде токсичные вещества, образующие в воде эмульсии, могут заглатываться инфузориями подобно пищевым частицам [3].
Изложенное обусловливает рациональность применения выбранных тест-организмов для анализа потенциальных факторов безопасности в технологии стерилизованных рыбных консервов.
Результаты экспериментов по определению зависимости выживаемости стилонихий (критерия токсичности) от концентрации бенз(а)пирена в модельных образцах на основе сухих пекарских дрожжей, выбранных в качестве модельного продукта, представлены на рис. 1. Видно, что при добавлении бенз(а)пирена с пошаговым увеличением концентрации критерий токсичности начинает падать, а прирост клеток соответственно увеличивается. При этом необходимо учитывать, что минимальная концентрация (10 мг/кг) превышает в 2000 раз допустимую норму, установленную действующим СанПиН на пищевую продукцию. Это позволяет предположить, что задолго до достижения концентрации бенз(а)пирена, соответствующей
0,005 мг/кг (норма безопасности), прирост клеток в опыте и контроле окажется схожим. Из этого можно сделать вывод, что использование 8,у!опускШа шуШш в качестве тест-организма при контроле ПДК бенз(а)пи-рена в рыбных консервах нерационально.
Исследование по выявлению влияния на реакции клеток концентрации поваренной соли, применяемой в консервах в качестве вкусового ингредиента, проведенные при 3-часовой экспозиции, показали, что при тестировании 3%-го раствора №С1 выживаемость инфузорий составила 100%, а при тестировании 4%-го раствора и выше выживаемость начала резко снижаться (рис. 2). При этом под выживаемостью понимается количество инфузорий в конце экспозиции по отношению к изначальному, выраженное в процентах.
Из полученных данных следует, что содержание поваренной соли, которое нормируется в консервах типа «Шпроты в масле» на уровне 1,0-2,0%, в приготовленных экстрактах влияет на выживаемость инфузорий незначительно. При этом следует принять во внимание, что в процессе приготовления экстракта происходит снижение в нем содержания поваренной соли в результате разбавления.
При тестировании растворов уксусной кислоты различной концентрации с целью установления ее влияния на выживаемость тест-организмов было показано, что ответная реакция клеток наблюдалась уже в течение 0,5 ч после постановки опыта. Установлено, что уксусная кислота даже в малых количествах резко угнетает жизнедеятельность инфузорий (рис. 3).
При подсчете выживаемости (по количеству оставшихся в живых клеток через 1 и 3 ч) разницы в значениях данного показателя не наблюдалось, что свидетельствует об отрицательном влиянии даже низких концентраций уксусной кислоты на жизнедеятельность клеток. Однако при тестировании водного раствора ацетонового экстракта, приготовленного на основе модельных рыбных стерилизованных консервов с содержанием уксусной кислоты 0,5%, выживаемость стилонихий составила практически 100%, несмотря на то, что в тестируемом растворе содержание уксусной кислоты оставалось летальным и составляло 0,0062%. Таким образом, можно предположить, что отрицательное воздействие кислоты на выживаемость стилонихий, установленное в чистом эксперименте, нивелируется в рыбных консервах. Это можно объяснить буферным воздействием полифункциональных белков, входящих в состав рыбных пищевых систем.
№01, %
Уксусная кислота, %
Рис. 2
Рис. 3
В эксперименте по определению порога выживаемости инфузорий по отношению к ацетону нами было установлено, что при концентрации ацетона 3,3% (соотношение ацетон : раствор Лозина-Лозинского 1:30) при 3-часовой экспозиции выживаемость стилонихий составила 100%. При повышении концентрации ацетона до 5% (соотношение 1,5 : 30) выживаемость падала до 0%. С учетом того, что максимально нормируемое соотношение ацетоновый экстракт : раствор Лози-на-Лозинского составляет 1 : 80 (при концентрации ацетона в растворе 1,25%) [5], оценку тест-реакции стилонихий на бенз(а)пирен осуществляли при обоснованном соотношении ацетоновый экстракт : раствор Лозина-Лозинского как 1 : 30.
ВЫВОДЫ
1. Инфузории 81у1опусЫа шуШш имеют уникальную систему пищеварения, схожую с функционированием пищеварительной системы человека, что позволяет их использовать в качестве тест-организмов для контроля безопасности пищевых продуктов, включая рыбные консервы.
2. Результаты исследования по определению порога выживаемости стилонихий относительно уксусной кислоты показали ее негативное воздействие на организмы тест-систем даже в малых дозах при модельном внесении в систему; однако в реальных условиях пищевой среды рыбных консервов эта закономерность не подтвердилась, что свидетельствует о возможности использования стилонихий в качестве тест-систем на токсичность по другим факторам в консервах, имеющих кислую среду.
3. Выживаемость стилонихий по отношению к поваренной соли и ацетону начинает снижаться при повышении концентрации данных веществ соответствен-
но более 4 и 3,3%, что позволяет использовать стило-нихии для контроля безопасности продуктов по другим нормируемым токсикантам с учетом данного уровня шумовых факторов.
4. Реакции на выживаемость стилонихий в зависимости от содержания бенз(а)пирена в рыбных консервах, полученные методом суточного биотестирования, свидетельствуют, что даже при концентрировании ацетонового экстракта и последующего уменьшения его разведения с целью повышения токсичного воздействия на клетки достоверных зависимостей в их поведении нет. Это объясняется как биологическими особенностями размножения стилонихий, так и биоаккумуляцией бенз(а)пирена, проявляющейся в специфике его воздействия на живые организмы. Таким образом, нерационально использовать Stylonychia mytilus для объективного тест-контроля на безопасность рыбных консервов по содержанию бенз(а)пирена.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГОСТ 29136-91. Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных. Метод определения общей токсичности. - М.: Изд-во стандартов, 1992. - 10 с.
2. ГОСТ Р 52337-2005. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - М.: Изд-во стандартов, 2005. - 19 с.
3. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: Дис. ... д-ра биол. наук. - СПб., 2007. -263 с.
4. Kaul N., Sapra G.R., Dass C.M.S. Intracellular digestive channel system in the ciliate Stylonychia mytilus Ehrenberg // Arch. Protistenk. - 1982. - № 126. - P. 455-474.
5. Chen Ying, Guang Ping, Qiu Zi-Jian. Intracellular digestive process of food in a fresh water ciliate Stylonychia mytilus (Protozoa, Ciliophora, Hypotrichida) // Acta Zoologica Sinica. - 2008. -№ 54 (3). - P. 510-516.
Поступила 30.06.10 г.
RESEARCH OF REACTIONS OF INFUSORIAN STYLONYCHIA MYTILUS ON FACTORS OF SAFETY OF THE STERILIZED FISH CANNED FOOD UNDER THE CONTENTS BENZ(A)PYREN
P.P. POTAPOV1, T.N. RULYOVA2, O.YA. MEZENOVA1
1 Kaliningrad State Technical University,
1, Sovietpr., Kaliningrad, 236000;ph.: (4012) 46-35-69, e-mail: mezenova@klgtu.ru 2 Atlantic Research Institute of Marine Fisheries and Oceanography (AtlantNIRO),
5, Dm. Donskoy st., Kaliningrad, 236022; ph.: (4012) 92-54-12, e-mail: atlant@baltnet.ru
The analysis of physiology of a feed and specificity of biological development of infusorians Stylonychia mytilus is lead. Features of revealing of a level of safety of the sterilized fish canned food potentially containing in quantity benz(a)pyren, exceeding a normative level, by a method of biotesting on infusorians Stylonychia mytilus are proved in view of influence of accompanying substances. Conclusions about impossibility of the control of a level benz(a)pyren in the limits established by normative documents, with use Stylonychia mytilus are made at a daily exposition.
Key words: control of food products safety, benz(a)pyren, biotesting, infusorians, Stylonychia mytilus.
