CC BY
79
УДК 536.74:62.522.7
А. В. Чернышев, С. Ф. М е д и н ц е в, Д. Г. Сочивко, Н. В. Атамасов
ИССЛЕДОВАНИЕ РАБОЧИХ ПРОЦЕССОВ В АМПЛИФИКАТОРЕ ДНК В ЦЕЛЯХ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА количества ПРОДУКТА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Приведены результаты исследований, целью которых являлось повышение производительности амплификаторов ДНК в процессе проведения полимеразной цепной реакции. Работа проводилась в двух направлениях: исследование тепловых процессов в тепловом блоке амплификатора ДНК, включая исследование тепловых процессов в микрообъеме реакционной смеси, и численное моделирование работы оптической системы. Исследования тепловых процессов направлены собственно на повышение выхода продукта по-лимеразной цепной реакции, а исследование оптической системы имеют своей целью повышение чувствительности оптической системы детектирования результатов.
E-mail: av-chernyshev@yndex.ru
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, термостатирующее устройство, амплификатор ДНК, тепловой блок, оптическая схема, методика расчета, эффект Зеебека, эффект Пельтье, эффект Томсона, закон Джоуля-Ленца, расчетная схема, оптический световод.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является одним из наиболее достоверных методов обнаружения и оценки количества дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в пробе. Для реакции необходим многократно повторяющийся цикл нагрева и охлаждения. Полимеразная цепная реакция проводится в специальных термостатирующих устройствах, которые называются амплификатора-ми ДНК. В настоящее время создана теория расчета рабочих процессов, протекающих в тепловых блоках этих устройств [1-6]. Наибольшее распространение получили твердотельные амплификаторы ДНК, основным направлением совершенствования которых является сокращение времени проведения ПЦР при одновременном увеличении выхода продукта. Достичь этого можно увеличением скорости нагрева и охлаждения держателя пробирок; снижением объема реакционной смеси; повышением чувствительности оптической системы детектирования результатов реакции.
Рассмотрим каждый их этих способов более подробно. Технически добиться высокой скорости нагрева/охлаждения держателя пробирок (до 10 °С/с) можно, но при этом необходимо обеспечить точность регулирования температуры, не допуская забросов
более чем 0,15 °С, и равномерность теплового поля по держателю микропробирок не хуже ±0,1 °С [1,2]. Кроме того, при реализации циклически повторяемого температурного протокола [1], требуемого для проведения ПЦР, необходимо время для установления равномерной температуры внутри реакционной смеси, что не только увеличивает общее время реакции, но и накладывает ограничение на максимально возможную скорость нагрева/охлаждения для каждой конкретной схемы теплового блока. Одной из основных причин такой временной задержки установления равномерной температуры является низкий коэффициент теплопередачи у полипропилена, из которого изготовлены микропробирки. Часто для увеличения выхода продукта ПЦР стремятся увеличить объем исходной реакционной смеси, однако в реальности наблюдается обратное явление. Поскольку в большем объеме реакционной смеси разброс температуры теплового поля при одном и том же времени увеличивается, то выход продукта ПЦР снижается [2, 3]. При значительном уменьшении объема реакционной смеси, составляющей 10... 25 мкл, необходимо изменение многих блоков амплификатора ДНК, что, по сути, является разработкой нового прибора и приводит к необходимости использования новых типов микропробирок.
Число температурных циклов можно уменьшить, увеличив чувствительность оптической системы приборы, что позволит обнаруживать продукт реакции после меньшего числа температурных циклов.
Твердотельная схема устройства. В качестве базового варианта для создания тепловой модели анализатора нуклеиновых кислот выбрана твердотельная схема устройства [3-6] нагрева и охлаждения (рис. 1).
Принцип действия данного устройства заключается в следующем: теплота от термоэлектрического элемента Пельтье к объекту теплового воздействия передается или отводится от него через твердое тело вследствие теплопроводности. Элемент Пельтье используется как источник, а также как сток теплоты. Для охлаждения элементов Пельтье применяют воздушный радиатор, обдуваемый потоком воздуха с температурой, равной температуре окружающей среды.
Рис. 1. Схема твердотельного амплификатора ДНК:
1 — крышка; 2 — пластиковые микропробирки; 3 — твердотельный держатель; 4 — термоэлектрический элемент Пельтье; 5 — воздушный радиатор
Математическая модель тепловых процессов в объекте исследования базируется на следующих допущениях.
1. Жидкая среда вязкая, несжимаемая — такое допущение справедливо, так как сжимаемость жидкой среды в условиях данной задачи несущественна.
2. Движение жидкой среды ламинарное, поскольку скорости конвективных потоков в жидкой среде достаточно малы и стенки пробирки гладкие.
3. Все рассматриваемые материалы однородны по составу и изотропны по теплофизическим свойствам.
4. Массообмен между жидкостью и воздухом в пробирке не учитывается.
5. Конвекция учитывается только в жидкости, находящейся в микропробирке.
6. Тепловое излучение отсутствует — им можно пренебречь по сравнению с характерными потоками теплоты в данной задаче.
Неравномерное распределение температур по объему жидкой среды в процессе нагрева приводит к появлению различия плотности и, как следствие, к разности гравитационных сил. Возникает свободное движение жидкой среды, являющееся причиной конвективного теплообмена (рис. 2). В настоящей работе использовались следующие математические зависимости.
Общее уравнение теплопроводности
дТ ~6Ь
где слагаемое рСрйУТ учитывает конвекцию; р — плотность вещества; Ср — теплоемкость, Дж/(кг-К); Т — температура, К; £ — время, с;
pCp— + V(-kVT) = Q + pCpuVT
Рис. 2. Конвективные потоки в реакционной смеси во время нагрева
к — коэффициент теплопроводности, Вт/(м-К); Ц — источник теплоты, Вт/м3; и — скорость, м/с. Уравнение Навье-Стокса [7]
дй — р— + р(и • V)« = У[п(Уи + (Уи)Т)] + Ур + Р,
где п — динамическая вязкость, Па-с; Р — объемная сила, Н/м3. Закон сохранения массы
др+у(ри)=о,
где р = р(р, Т) — зависимость плотности от температуры. Закон сохранения заряда
-V- (аVV - Iе) = о,
где а — удельная проводимость, 1/(Ом-м); Je — плотность тока, А/м2.
Также необходимо учесть термоэлектрические эффекты, возникающие в элементах Пельтье. Термоэлектрическими эффектами принято называть эффекты возникновения в проводящих средах под воздействием тепловых потоков электродвижущих сил и электрических токов, а также эффекты возникновения теплоты при протекании электрического тока. В математической модели учитываются такие эффекты, как эффекты Зеебека, Пельтье, Томпсона, а также закон Джоуля-Ленца.
В начальный момент времени £ = 0 жидкая и воздушная среды в микропробирке считаются неподвижными, т.е. и = 0. Также в начальный момент времени задано равномерное распределение по всему устройству температуры, равной температуре окружающей среды, Т = Т
-1- -1- окр •
Граничное условие на контактах элементов Пельтье задается значениями напряжения:
V = V; V = 0.
Таким образом, на контактах элементов Пельтье создается разность потенциалов
Д V = V - ¥2 = V.
Остальные границы элементов Пельтье являются электроизолированными:
п • (-аVV) = 0.
Расчетная схема, результаты расчета и эксперимента. В качестве расчетной области выбрана часть теплового блока системы стабилизации температуры (рис. 3), которая содержит объект исследования и наиболее полно и точно отражает происходящие в нем тепловые процессы. Как объект исследования в настоящей работе выступает жидкость, находящаяся в пробирке.
В результате расчета получены распределения скоростей по объему реакционной смеси в микропробирке, а также температур по объему всех элементов расчетной области в каждый момент времени.
В ходе выполнения работы была проведена серия экспериментов на приборе АНК-32 для сопоставления реальных данных с данными, полученными с помощью модели. Связь температуры реакционной смеси с интенсивностью флуоресценции зонда может быть описана следующим эмпирическим уравнением:
I = An +
(1 - fT)A
1 + exp
T Tn
w i
В ходе эксперимента пробирки нагрева-
Рис. 3. Твердотельное тер-мостатирующее устройство:
1 — полипропиленовая пробирка; 2 — воздух в пробирке; лись согласно температурному протоколу,
3 — алюминиевый держатель; показанному на рис. 4.
4 — реакционная смесь; 5 — в результате эксперимента был полуподложки; 6 — медные спаи; г ^ г
7 — воздушный радиатор; 8 — чен массив данных, представляющий собой полупроводники значения интенсивности излучения в раз-
ные моменты времени (кривая 1 на рис. 5). Аналогичный массив данных (кривая 2, см. рис. 5) был получен и с помощью математической модели. При выборке п = 2 получены следующие статистические характеристики: коэффициент Стьюдента для вероятности Р = 0,95 £ = 1,998; среднеквадратическое отклоне-
ние а =
'n ¿«
7мод )2 = 0,016;
среднеквадратическая ошибка
а
аср =
n
= 0,002; доверительный интервал Д1дов = ±tacp = ±0,004.
Анализ оптического блока. Схематично амплификатор ДНК приведен на рис. 6.
Рис. 4. Температурный протокол
2
w
Рис. 5. Сопоставление данных, полученных экспериментально и с помощью математической модели
Рис. 6. Схема твердотельного амплификатора ДНК
Оптический блок состоит из источника и регистратора излучения, набора фильтров и оптических волокон. Источник излучения — галогенная лампа, а регистратор излучения — фотоэлектронный умножитель. Пробирки содержат олигонуклеотидный зонд с флуоресцентной меткой, флуоресценция которого увеличивается при гибридизации зонда с комплементарной последовательностью ДНК, что позволяет оценивать ход реакции.
У данной конструкции оптического блока есть существенный недостаток — дороговизна оптических волокон по сравнению с общей стоимостью прибора. Для решения этой проблемы, а также для попытки увеличения чувствительности оптического блока предложено
создать некую конструкцию над пробирками, внутрь которой заводился бы световой поток, далее он равномерно распределялся бы и выходил через отверстия в нижней части, равномерно освещая пробирки. Вторичное излучение из реакционной смеси должно было бы выходить наружу, проходя этот блок насквозь, и выходить из него, через небольшие отверстия в верхней части блока.
Для моделирования такого блока была создана трехмерная модель (рис. 7). Внутренние стенки верхней части блока (до перегородки) этой модели были заданы как зеркальные с 90 %-ным коэффициентом отражения. Внутренние стенки нижней части были идеально поглощающими поверхностями. Таким образом, задача моделирования заключалась в получении равномерного освещения нижней плоскости блока (см. рис. 7, поверхность $).
Как показало моделирование (рис. 8), такая схема блока имеет конструктивные недостатки, связанные как с обеспечением
Рис. 7. Трехмерная модель осветительного блока (£ — контрольная поверхность модели)
Рис. 8. Результат моделирования распространения света в осветительном блоке
6 4 2 0-2-4-6 Рис. 9. Распределение интенсивности света по нижней грани исследуемой конструкции
равномерности светового пото- - - " - ?
ка на нижней плоскости (рис. 9), так и со значительными потерями энергии светового потока внутри верхней части блока, обусловленными неполным отражением светового потока от зеркальных поверхностей. В связи с этим было решено отказаться от такой конструкции оптического блока и предложено использовать оптический световод, размещенный внутри теплового блока. В такой схеме верхнее сечение пробирки может быть использовано только для регистрации светового потока, что, предположительно, позволит увеличить чувствительность прибора.
На рис. 10 приведены результаты моделирования освещения световода с прямоугольным сечением (2x4 мм). На торец такого световода подавался световой поток круглого сечения с расхождением 30°. Как следует из результатов моделирования, уже на расстоянии 15 мм от входа световой поток имеет достаточно равномерное распределение в световоде.
Для выбора варианта подвода света к реакционной смеси была создана модель (рис.11), геометрическая форма которой совпадала с геометрией миропробирки, используемой в амплификаторе ДНК. Внутренние стенки микропробирки были представлены зеркальной поверхностью с коэффициентом отражения 90%.
В результате моделирования выявлено следующее: при размещении световода непосредственно под пробирками до верхней плоскости модели (см. рис. 11, поверхность $) доходит около 56,7% мощности светового потока источника; при размещении световода сбоку от
Рис. 10. Распределение проходящего светового потока в световоде:
а — на входе, б и в — на расстоянии 5 мм и 15 мм от входа
пробирки до верхней плоскости модели доходит около 60,1 % мощности светового потока источника.
При размещении световода сбоку от пробирки получаемый выигрыш, вероятно, связан с тем, что лучи, поглощаемые световодом, вряд ли вносят значительный вклад в освещение верхней грани, поскольку они должны были бы много раз отразиться от стенок, прежде чем дошли бы верхней грани. В свою очередь, световод, размещенный снизу, поглощает лучи, которые с большой долей вероятности могли бы отразиться один раз и сразу отправиться к верхней грани.
Исследование изменения теплового поля в держателе пробирок с учетом размещения в нем световодов.
Для исследования тепловых полей была построена трехмерная модель четверти держателя микропробирок (рис. 12). Цифрой 2 обозначены пластиковые вставки-световоды.
Для изучения влияния теплофизических свойств и зоны размещения световодов на работу теплового блока численно исследована температура поверхности, по которой происходит контакт между пробиркой и держателем. При описании модели использованы следующие уравнения.
Рис. 11. Модель для исследования способа подведения света к пробирке (£ — контрольная поверхность модели)
Рис. 12. Держатель микропробирок с размещенными в нем пластиковыми световодами:
1 — алюминиевый держатель пробирок; 2 — пластиковые вставки-световоды
Уравнение теплопроводности для среды
дТ
рСр — + У(-кУТ) = Я + рСрйУТ.
В данном случае правая часть равна нулю, так как в держателе пробирок не имеется внутренних источников теплоты и отсутствует конвекция, и уравнение теплопроводности записывается как
дТ
рС— + div(-k grad Т) = 0. Граничные условия:
^держатель grad Тдержатель ксветовод grad Тсветовод
— граница держатель-световод;
к grad Т = 0
— внешние границы - адиабатические;
Т = Т (г),
— нижняя граница модели, где Т (г) — функция изменения температуры во времени (рис. 13, кривая 1).
Начальным условием модели принято равенство температуры по всему объему 50 °С. Физические свойства материалов, применяемых в математической модели, приведены в таблице [8].
Физические свойства материалов, применяемых в модели
Физическое свойство Элемент модели
Пластиковый световод Алюминиевый держатель пробирок
Коэффициент теплопроводности к, Вт/(м-К) 0,15 200
Плотность р, кг/м3 900 2750
Теплоемкость Ср, Дж/(кг-К) 1700 953
На рис. 13 приведены графики зависимости температуры от времени в расчетных точках. Как следует из графиков, средние температуры разные — держатель с пластиковыми вставками чуть медленнее нагревается и чуть медленнее остывает. Максимальная разность температур составляет 0,8 °С в моменты нагрева и охлаждения. Отметим, что время установления заданной температуры на контрольной поверхности для обоих держателей практически одинаково.
Выводы. В ходе проведенного исследования отработаны принципы математического моделирования, разработана математическая модель нестационарных процессов нагрева и охлаждения в прецизионном термоэлектрическом амплификаторе ДНК, а также изучена техно-
т,° с
75
70
65
1
60
55
2
3
50
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 t, с
Рис. 13. Графики температур держателя:
1 — температура нижней грани держателя; 2 и 3 — средняя температура контрольной поверхности в исходном держателе без световодов и в держателе с пластиковыми вставками (со световодами) соответственно
логия проведения ПЦР. Рассмотрен принцип действия амплификатора ДНК. Проведен расчет теплового поля с применением численной модели с распределенными параметрами.
В результате проведенных экспериментов выявили, что с помощью созданной математической модели можно с достаточной точностью описывать исследуемый процесс, так как среднеквадратическая ошибка при этом составляет ~ 10-3. Максимальные различия между данными эксперимента и данными, полученными из математической модели, наблюдаются в моменты нагрева/охлаждения. Это может быть связано с отличием созданной модели от реальных процессов из-за принятых допущений.
По результатам проделанной работы можно заключить следующее.
1. Световод, имеющий некруглое сечение, можно освещать световым потоком, имеющим круг в сечении, потому что через незначительное расстояние световой поток в световоде становится равномерным.
2. Свет к пробирке с реакционной смесью необходимо подводить сбоку, что уменьшит потери вторичного излучения.
3. При размещении пластиковых световодов в нижней части держателя происходит изменение теплового поля, но это изменение незначительное и не оказывает существенного влияния на прогрев реакционной смеси внутри пробирки.
1. Чернышев А. В. Основы теории расчета электропневмомеханического оборудования для анализа ДНК // Научное приборостроение. - 2002. - Т. 12, № 1.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- 13 с.
2. Ч е р н ы ш е в А. В., Д р у ц а В. Л. Проблемы создания оборудования для медицинской ПЦР-диагностики // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2004. - № 12. -9 с.
3. МединцевС. Ф., ПугачукА. С. Исследование тепловых полей в микрообъеме жидкости в целях увеличения количества продукта ПЦР // Студенческий научный вестник: Сб. статей Междунар. молодеж. науч. форума-олимпиады по приоритетным направлениям развития РФ, МГТУ им. Н.Э. Баумана / Под ред. С.С. Гаврюшина. - М.: НТА "АПФН". - С. 290-296.
4. Чернышев А. В., Б а к а й Д. А. К вопросу исследования однородности теплового поля пластины-держателя твердотельного амплификатора ДНК / Научное приборостроение. - 2004. - Т. 14, № 4. - С. 10-19.
5. Белова О. В.,Чернышев А. В. Методика расчета твердотельного термотрансформатора // V Науч.-техн. конф. Медико-техн. технологии на страже здоровья: Сб. науч. трудов (Египет, Шарм-Эль-Шейх, 04-11 октября 2003 г.). -М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2003. - С. 54.
6. Ч е р н ы ш е в А. В., Б е л о в а О. В. Повышение эффективности амплифика-торов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье // IV Науч.-техн. конф. Медико-техн. технологии на страже здоровья: Сб. трудов (Турция, Ан-талия, 11-18 октября 2002 г.). - М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2002. -С. 67.
7. Полежаев В. И. Математическое моделирование конвективного тепломас-собмена на основе уравнений Навье-Стокса. - М.: Наука, 1987. - 271 с.
8. К и к о и н И. К. Таблицы физических величин: Справочник. - М.: Атомиздат, 1976.
Статья поступила в редакцию 15.06.2011
