CC BY
84
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.12:581.1.03; 633.15:632.111.6
Т.П. Астафурова, С.А. Войцековская, Г.С. Верхотурова
ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ К ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
В ассимилирующих тканях при гипобарической гипоксии у растений амаранта сорта Валентина активируется окислительный пентозофосфатный путь и уменьшается содержание амарантина, обладающего антиоксидантными свойствами. Одновременно у амаранта сорта Кизлярец резко повышается активность алкогольдегидрогеназы, перерабатывающей этанол. Обсуждаются различные пути биохимической адаптации к недостатку кислорода у растений р. АтагапАиз.
Закономерности реагирования живых систем на внешние воздействия связаны с формированием неспецифических адаптационных перестроек, индуцирующих устойчивость организма. Среди таких неспецифических ответов известно множество реакций, характерных только для отдельных видов, но интересных для познания механизмов адаптации в целом [1—5]. Более полно в настоящее время исследовано действие дефицита кислорода на корневую систему растений. Остаются недостаточно изученными вопросы структуры и функции фотосинтетического аппарата в условиях корневой гипоксии и метаболические приспособления зеленых растений, попадающих в условия кислородного голодания. Моделировать состояние гипоксии для целого растения можно в барокамерах, устройство которых позволяет создавать необходимые условия - недостаток кислорода, углекислоты и изменение атмосферного давления, т.е. формировать модель гипобарической гипоксии. Изменения в ассимилирующих органах показывают, что при корневой гипоксии и аноксии у устойчивых и неустойчивых растений сначала уменьшается только число активных реакционных центров фотосистем. Более длительная аноксия в области корней приводит к тому, что в хлоропластах листьев увеличивается число осмиофильных глобул, т. е. имеет место частичная деструкция мембранной системы тилакоидов [6]. Исследования действия гипобарической гипоксии на целое растение выявили, что в зеленых листьях развиваются компенсаторные взаимоотношения фотосинтеза и дыхания, активируются анаплеротические механизмы накопления низкомолекулярных метаболитов и образования энергетических эквивалентов [7].
В стресс-физиологии растений придается большое значение ядерноцитоплазматическим отношениям, когда нормальный онтогенез пластид является необходимым условием для правильной экспрессии ядерных стрес-сорных генов. Показано, что в трансдукции стрессорного сигнала принимают участие такие эндогенные компоненты, как этилен, жасмоновая кислота, углеводы, полиамины и различные антиоксиданты, к числу которых относится и амарантин. Согласно современным представлениям, он играет важную роль
в фотосинтетических, метаболических и защитных реакциях растений [8]. Повышенным содержанием амарантина обладают растения рода Amaranthus, особенно высокое количество его отмечается в листьях амаранта трехцветного сорта Валентина. В литературе есть данные об отношении видов рода Amaranthus к стрессу, в частности к гипоксии [9-10], действию водного стресса [11]. В связи с этим поиск эндогенных метаболитов, обеспечивающих устойчивость растений даже в пределах одного рода или вида, является новым и перспективным направлением стресс-физиологии.
Цель работы - изучение направленности метаболизма в ассимилирующих тканях двух видов амаранта, различающихся содержанием бетацианина ама-рантина, в условиях гипобарической гипоксии.
Объектами исследования являлись 24-суточные проростки двух видов амаранта: амарант тёмный (Amaranthus hypochondriacus L.) сорта Кизлярец и амарант трёхцветный (Amaranthus tricolor L.) сорта Валентина, который отличается высоким содержанием амарантина [8]. Амарант характеризуется высокой урожайностью, а благодаря его высокому адаптационному потенциалу обладает уникальной способностью приспосабливаться к различным условиям внешней среды. Зерно и зеленая масса амаранта могут широко использоваться в пищевых, кормовых и технических целях. По качественным показателям - содержанию белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов, биологически активных веществ, масла - он превосходит основные традиционные кормовые и пищевые культуры [8-10].
Растения выращивали на дерново-луговой почве под люминесцентными лампами (интенсивность 40 Вт/м2, фотопериод 12 ч) при температуре 25°С. Для создания анаэробных условий образцы помещали в барокамеры с пониженным парциальным давлением кислорода (Р = 8 кПа, РО2 = 2 кПа) на 16 ч в темноту (для исключения фотосинтеза). Контрольные растения находились в это время в условиях нормальной аэрации (Р = 101 кПа, РО2 = 21 кПа) и при нормальном атмосферном давлении в темноте. Особенности гипобарической среды характеризуются одновременным снижением парциального давления газов, среди которых наибольшее значение для растений имеют О2 и СО2 . В отличие от других типов гипо- и аноксии (затопление, вытеснение воздуха инертными газами и т. д.) действие гипобарической гипоксии можно изучать на автотрофных тканях, которые в условиях разреженной атмосферы непосредственно взаимодействуют с воздухом, обедненным кислородом.
Эксперименты проводились в 4 биологических повторностях, были продублированы 4 раза. Для опытов использовали взрослые листья предпоследнего яруса 24-дневных растений амаранта. Гомогенизацию производили при пониженной температуре на льду в 8 мл охлажденной среды выделения следующего состава: трис-HCl буфер (pH 7,8) - 0,05 М, аскорбат натрия - 5 мМ, цистеин - 3 мМ, MgCl2 - 1 мМ и дитиотрейтол - 5 мМ [12]. Гомогенат отжимали через 4 слоя капрона и центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 20 мин на холоде (центрифуга К-24, Германия). Состав среды выделения и реакционных сред для определения активности ферментов подбирали согласно специфике объекта. В работе использовали реактивы фирм «Sigma» (США) и «Реахим» (Россия).
Ферментативную активность алкогольдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.1, НАД-АДГ и НАДН-АДГ) определяли в окислительно -восстановительных превращениях НАД+ или НАДН+ в реакционных средах: трис-НС1 буфер (рН 7,5) -
0,2 М; НАДН - 2 мкМ; ацетальдегид - 50 мкМ или НАД - 15 мМ и этанол -50 мМ [13]. Активность НАД-малатдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.37, НАД-МДГ) определяли по восстановлению НАД в присутствии малата. Реакционная среда для НАД-МДГ содержала трис-НС1 (рН 9,1) - 0,1 М; малат Ка - 1,93 М и НАД - 11 мМ [12]. Реакционная смесь для НАДФ-глюкозо-6-фофатдегид-рогеназы (К.Ф. 1.1.1.49; НАДФ-ГФДГ) содержала трис-НС1 (рН 7,4) - 0,03 М; глюкозо-6-фосфат Ка соль - 0,12 мМ; М§С12-6 Н20 - 0,25 М и НАДФ -11 мМ [14]. Активность ферментов определяли спектрофотометрически (Shimadzu ЦУ-2100, Shimadzu Согр., Япония) по изменению оптической плотности при 340 нм и рассчитывали в мкМ НАДН/мин на 1 мг белка и на 1 г сырой массы. Содержание растворимого белка определяли по Бредфорду [15], количество амарантина - по поглощению при 537 нм [16, 17], содержание пигментов в спиртовой вытяжке - спектрофотометрически [19]. Результаты обрабатывали статистически, различия между сравниваемыми средними считали при р < 0,05 [18].
Амарант, подобно кукурузе, просо и сорго, обладает С4-путём фотосинтеза и относится к аспартатным С4-растениям, отличающимся высоким содержанием лизина. Он также характеризуется большой скоростью фиксации углекислоты в расчёте на единицу поверхности листа, обладает мощной продуктивностью в условиях высокой инсоляции и температуры. В условиях 16-часовой гипобарической гипоксии повышается содержание белка в листьях 24-суточных проростков обоих видов рода амарант (табл. 1). Обычно при анаэробиозе содержание белка в растениях понижается вследствие усиления его распада и торможения синтеза. В литературе имеются указания и на увеличение содержания белка при ограничении аэрации [1, 3]. Это может объясняться, с одной стороны, медленной утилизацией белка в обмене веществ в данных условиях, с другой - синтезом анаэробных белков, многие из которых идентифицированы как ферменты анаэробного обмена. Они участвуют в трансформации дыхательных путей при адаптации растений к недостатку кислорода.
Т а б л и ц а 1
Содержание белка в проростках амаранта при нормальной аэрации (контроль) и в условиях гипобарической гипоксии (опыт) (Р = 8 кПа, РО2 = 2 кПа, время экспозиции 16 ч)
Объект Варианты Содержание белка, мг/г сырой массы
Амарант тёмный, сорт Кизлярец Контроль 6,23±0,16
Опыт 7,63±0,16
Амарант трёхцветный, сорт Валентина Контроль 6,45±0,29
Опыт 8,29±0,20
Примечание. Все различия между контролем и опытом достоверны при р < 0,05.
В листьях амаранта после 16-часового воздействия гипобарической гипоксии наблюдаются изменения содержания фотосинтетических пигментов (табл. 2). При этом у опытных растений сорта Валентина количество зеленых пигментов выше, чем в контроле, а содержание каротиноидов не изменяется.
Т а б л и ц а 2
Содержание пигментов в листьях амаранта при действии гипобарической гипоксии (Р= 8 кПа, РО2 = 2 кПа, 16 ч), мкг/г сырой массы
Вари- анты опыта Хлоро- филл а Хлоро- филл Ь Сумма хл а + хл Ь хл а/ хл Ь Кароти- ноиды хл а + хл Ь каротиноиды
Сорт Валентина
Контроль 1701,3 ± 89,7 640,0 ± 20,9 2 4 7 4 2,9 1394,2 ± 38,04 1,91
Опыт 2361,3 ± 92,3* 711,9 ± 17,9* 3141,5 ± 161,5* 3,0 1363,1 ± 36,7 1,87
Сорт Кизлярец
Контроль 1868,3 ± 116,9 584,8 ± 30,8 2589,0 ± 80,4 3,1 944,3 ± 83,0 2,13
Опыт 1992,2 ± 75,8 689,3 ± 34,6 1946 ± 75,5 3,0 1465,6 ± 131,4* 1,6
* Различия между контролем и опытом достоверны при р < 0,01.
В то же время у амаранта сорта Кизлярец уровень зеленых пигментов при гипоксии не изменяется, но увеличивается количество каротиноидов. Подобное увеличение зеленых пигментов известно [20] и укладывается в представление о том, что при недостатке кислорода замедляется окисление хлорофилла. Обнаруженные особенности в содержании фотосинтетических пигментов являются, вероятно, результатом определенных метаболических изменений.
Определение содержания бетацианина амарантина в листьях 24-дневных растений амаранта совпадает с данными о более высоком его количестве в растениях сорта Валентина [8]. Под действием 16-часовой гипоксии содержание амарантина в листьях амаранта темного сорта Кизлярец не изменяется и достоверно уменьшается в листьях амаранта трехцветного сорта Валентина (табл. 3). Такие количественные изменения амарантина с учетом его защитной функции дают основание для дальнейшего рассмотрения путей метаболизма у этих растений при действии кислородной недостаточности.
В листьях растений на свету при недостатке кислорода тормозится работа цикла Кребса [7], что подтверждают и данные исследования. Активность НАД-МДГ уменьшается в листьях обоих видов амаранта (табл. 3). Заключительный этап обмена ди- и трикарбоновых кислот в листьях амаранта темного ингибируется на 22%, а в листьях амаранта трехцветного - на 41% в пересчете на 1 г сырой массы. Одновременное изучение преобразования глюкозы по окислительному пентозофосфатному пути показало, что активность
НАДФ-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в листьях амаранта трехцветного сорта Валентина возрастает на 33% по сравнению с контролем (табл. 4).
В листьях амаранта темного сорта Кизлярец после гипоксической экспозиции активность фермента достоверно не изменяется как в пересчете на 1 г сырой массы, так и на 1 мг белка.
Т а б л и ц а 3
Влияние гипобарической гипоксии (Р = 8 кПа, Р О2 = 2 кПа, 16 ч) на содержание бетацианина амарантина в 24-дневных растениях двух видов амаранта
Объект Условия опыта Содержание амарантина
мкг/г сырой массы %
Амарант темный, сорт Кизлярец Аэрация 115,6 ± 9,3 100
Гипоксия 99,7 ± 9,8 87
Амарант трехцветный, сорт Валентина Аэрация 375,02 ± 6,43 100
Гипоксия 288,16 ± 27,2* 76
* Различия между контролем и опытом достоверны при р < 0,01.
Т а б л и ц а 4
Изменение активности НАД-малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в листьях 24-суточного амаранта под влиянием гипобарической гипоксии (Р=8 кПа, РО2=2 кПа, при 16 ч)
Объект Условия опыта Активность ферментов
НАД-малатдегидрогеназы Глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы
Е/г сырой массы мЕ/мг белка мЕ/г сырой массы мЕ/мг белка
Амарант тёмный, сорт Кизлярец Аэрация 2,93 ± 0,27 501,8 ± 35,48 34,17 ± 1,43 5,85 ± 0,26
Гипоксия 2,87 ± 0,28 390,0 ± 39,83* 29,53 ± 1,51* 5,78 ± 0,18
Амарант трёхцветный, сорт Валентина Аэрация 3,28 ± 0,25 503,3 ± 27,25 51,74 ± 2,34 7,66 ± 0,24
Гипоксия 2,34 ± 0,16* 296,8 ± 18,30* 92,21 ± 3,75* 10,19 ± 0,43*
* Различия между контролем и опытом достоверны при р < 0,05.
Определение активности НАДН-зависимой алкогольдегидрогеназы, функционирующей в сторону восстановления ацетальдегида, выявило различный характер работы фермента у изучаемых сортов (табл. 5). В листьях сорта Кизлярец активность НАДН-АДГ уменьшается под действием 16-часовой гипоксии, а в листьях сорта Валентина в этих же условиях наблюдается резкая активация фермента, что косвенно может свидетельствовать о накоплении этанола. В то же время изменение активности НАД-АДГ имеет противоположный характер: возрастает при гипоксии в листьях сорта Кизлярец и уменьшается в ассимилирующих тканях сорта Валентина.
Полученные результаты позволяют выявить механизмы изменения метаболизма в ассимилирующих органах растений амаранта, находящихся в тем-
ноте в условиях гипобарической гипоксии. При недостатке кислорода в листьях амаранта количество амарантина уменьшалось только у одного из изучаемых видов - амаранта трехцветного сорта Валентина. Этот сорт отличался повышенным содержанием амарантина (300-500 мкг/г сырой массы) по сравнению с амарантом темным сорта Кизлярец (90-130 мкг/г сырой массы).
Т а б л и ц а 5
Активность алкогольдегидрогеназы у 24-дневных растений амаранта при нормальной аэрации (Р = 101 кПа, РО2 = 2кПа) и в условиях гипобарической гипоксии (Р = S кПа, РО2 = 2 кПа, при 16 ч)
Субстрат, фермент Условия опыта Активность фермента
мЕ/мг белка мЕ/г сырой массы
Сорт Кизлярец
Ацетальдегид, НАДН-АДГ Аэрация 27,5В і 3,б б1,38 і 5,40
Гипоксия 21,71 і 2,77 4б,47 і 4,08
Этанол, НАД-АДГ Аэрация б,2В і 0,84 1б,58 і 1,71
Ггипоксия 9,30 і 1,09 22,0б і 2,48
Ацетальдегид, НАДН-АДГ Сорт Валентина
Аэрация Зб,б7 і 2,51 бб,8б і 5,94
Гипоксия В7,б3 і 8,85 138,2б і 22,84
Этанол, НАД-АДГ Аэрация 11,39 і 1,19 25,82 і 2,44
Гипоксия б,3В і 0,98 17,2 і 0,90
Примечание. Все различия между контролем и опытом достоверны при р < 0,01.
Соотношение путей дыхательного метаболизма при кратковременной гипоксии у амаранта трехцветного сорта Валентина заключается в снижении энзиматической активности цикла Кребса и увеличении активности АДГ по восстановлению ацетальдегида в этанол. Это сопровождается усилением доли альтернативного пентозофосфатного пути окисления углеводов, что вместе с высоким содержанием биологически активного алкалоида амарантина может обеспечивать его устойчивость к недостатку кислорода. Пентозофос-фатный путь поставляет НАДФН, который используется как восстановитель в биосинтетических процессах, в условиях, когда не происходит образование НАДФН при фотосинтезе. Поэтому он имеет особенно большое значение в нефотосинтезирующих тканях, прорастающих семенах, а также в часы тем-нового периода. При функционировании этого пути окисления углеводов образуется рибозо-5-фосфат, необходимый для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот. При недостатке кислорода количество амарантина уменьшается только у сорта Валентина, что, по-видимому, может восполняться также через продукты, образующиеся в окислительном пентозофосфатном пути. Известно, что синтез амарантина происходит через образование шикимовой
кислоты путем конденсации эритрозо-4-фосфата из пентозофосфатного пути и фосфоэнолпирувата из гликолиза [21]. Способность бетацианина амарантина образовывать комплексы с ионами переменной валентности, в частности с железом, медью, цинком, которые регулируют и катализируют свободнорадикальные процессы [8], активизирующиеся в растениях при гипоксическом стрессе [3, 22], приводит к его расходованию и обеспечивает устойчивость к гипоксии растений сорта Валентина. Усиление работы окислительного пентозофосфатного пути, которое отмечается в исследовании, характерно для более приспособленных к дефициту кислорода растений [3].
В листьях растений сорта Кизлярец, судя по активности НАД-АДГ, при недостатке кислорода происходит усиление работы фермента, а следовательно, имеет место обращение конечных этапов спиртового брожения и окисление образующихся восстановленных коферментов, необходимых для поддержания высокой скорости гликолитического пути. Одновременно в листьях амаранта сорта Кизлярец в условиях гипобарической гипоксии снижается активность малатдегидрогеназы, работающей на заключительных этапах цикла ди- и три-карбоновых кислот и не происходит активация окислительного пентозофос-фатного пути, судя по активности глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы.
Таким образом, выявлены особенности функционирования отдельных этапов дыхательного обмена в ассимилирующих тканях в темноте при гипобари-ческой гипоксии у двух видов амаранта, отличающихся по содержанию антиоксиданта амарантина. Выполняя протекторную функцию в растениях, ама-рантин обеспечивает наряду с другими защитными реакциями устойчивость сорта Валентина к кислородной недостаточности. Он снижает уровень свободнорадикальных процессов в клетках, а одновременное усиление использования глюкозы по окислительному пентозофосфатному пути повышает устойчивость этих растений к недостатку кислорода, обеспечивает восполнение амарантина и восстановление коферментов. Устойчивость растений сорта Кизлярец при неизменном, но более низком содержании амарантина в условиях недостатка кислорода обеспечивается усилением окисления продуктов брожения за счет активации алкогольдегидрогеназы, работающей от этанола.
Литература
1. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1988. 244 с.
2. Сrawford R.M.M. Metabolie Adaptation to Anoxia / In Hook D.D., Ga-würd R.M.M., eds / Plant Life in Anaerobic Environments // Ann. Arbor. Seienee, 1978. P. 119-136.
3. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. Л.: Изд-во СПб. унта, 2002. 240 с.
4. Вартапетян Б.Б. Учение об анаэробном стрессе растений - новое направление в экологической физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 931-953.
5. Ершова А.Н. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и повышенному содержанию диоксида углерода. Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2007. 263 с.
6. Ладыгин В.Г. Влияние корневой гипоксии и аноксии на функциональную активность и структуру хлоропластов листьев Pisum sativum и Glycine max // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 2. С. 246-258.
7. Астафурова Т.П. Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания при адаптации растений к условиям гипобарической гипоксии: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Томск, 1997. 40 с.
8. Гинс М.С. Биологически активные вещества амаранта. Амарантин: свойства, механизмы действия и практическое использование. М.: Изд-во РУДН, 2002. 184 с.
9. Чиркова Т.В., Белоногова В.А., Магомедов И.М. Оценка устойчивости различных видов амаранта к недостатку О2 // Вестник СПб. ун-та. 1992. Вып. 3, № 17. С. 79-82.
10. Чиркова Т.В. Амарант - культура XXI века // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 10. С. 23-27.
11. Голик К.Н., Гуляев Б.И., Зубцова А.Я., Антонец А.Н. Обмен СО2 у амаранта при различном водообеспечении // Физиология и биохимия культурных растений. 1993. Т. 25, № 6. С. 540-545.
12. Юзбеков А.К. Спектрофотометрические способы определения активности ключевых ферментов фотосинтетического метаболизма у С3 и С4-растений: Метод. пособие. Киев: Институт физиологии растений и генетики АН УССР, 1990. 44 с.
13. Методы биохимического анализа растений. Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1978. 192 с.
14. Гавриленко В. Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыхание: Учеб. пособие. М.: Высш. шк., 1975. 392 с.
15. BradfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding // Analytical biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248.
16. Муравьева Д.А., Бубенчикова В.Н., Беликов В.В. Спектрофотометрическое определение суммы антоцианов в цветках василька синего // Фармация. 1984. Т. 36, № 5. С. 28-29.
17. Гинс М.С., Кононков П.Ф., Гинс В.К., Лысенко Г.Г., Дэсалень Т.Л., Бравова Г.Б. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина из растений Amaran-thus tricolor L. // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. С. 450-454.
18. Кузнецов В.К. Ускоренный метод статистической обработки результатов наблюдений при сравнении средних // Социально-гигиенические исследования: Тр. II Моск. мед. ин-та. 1973. Т. 19, № 3. С. 253.
19. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. 1971. С. 154-170.
20.Астафурова Т.П., Зайцева Т.А., Зотикова А.П., Рябчук Ю.А. Формирование пигментного аппарата в проростках ячменя в условиях гипобарической гипоксии // Физиология растений. 1996. Т. 43, № 6. С. 900-905.
21. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. Т. 2. 312 с.
22. Ershova A.N. Enzyme activity of antioxidative system in plants with different tolerance under hypoxia and CO2-media // Acta Physiology Plantarum. 2004. Vol. 26. Р. 224-225.
