Исследование процесса экстракции полисахаридов семян льна (Linum usitatissimum L. ) Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 547.912 + 582.751.42

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ЭКСТРАКЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ СЕМЯН ЛЬНА (LINUM USITATISSIMUM L.)

*

© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru

Изучены параметры экстракции полисахаридов семян льна и выбраны оптимальные условия. Показана возможность использования в качестве экстрагента раствора натрия хлорида. Результатом исследования является улучшение реологических параметров получаемых экстрактов и, как следствие, повышение выхода полисахаридов и сокращение времени технологического процесса.

Сокращения: БАС - биологически активное соединение; ВРПС - водорастворимые полисахариды; Гр - гравиметрический анализ; ПС - полисахариды; СФМ - спектрофотометрический анализ; MW - молекулярная масса; Ara - ара-биноза; Xyl - ксилоза.

Введение

Семена льна - зрелые семена культивируемого растения льна обыкновенного (Linum usitatissimum L., сем. Linaceae), используются в качестве лекарственного средства и технического растительного сырья.

Известно, что слизь семян льна обладает обволакивающим действием, уменьшает раздражающее действие различных ирритантов, помимо этого она препятствует всасыванию веществ, принятых внутрь или использованных местно на кожу и слизистые оболочки. Ее применяют для уменьшения раздражения при воспалительных и язвенных процессах слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, при отравлениях, катарах дыхательных путей, для смягчения вкуса острых и кислых веществ, а также для пролонгирования действия лекарственных средств [1-3].

Химический состав семян льна представлен разными классами БАС: полисахариды 10-12% [4-6], жирное масло 30-48%, в состав которого входят свободные жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая и изолинолеиновая кислоты) и их триглицериды, стерины (Р-ситостерин, кампестерол, 5-авенастерин, циклоартенол, холестерин), фосфолипиды (фосфатидилхолин, фитогликолипид, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол) [7, 8], белки 20-30% [9], цианогенные гликозиды (линамарин, лотаустралин, линустатин, неолинустатин) [10], лигнаны (секоизоларицирези-нол), флавоноиды (ориентин, изориентин, виценин, луценин), фенолокислоты (п-кумаровая, кофейная, феруловая, синаповая) [11].

Фармакологические свойства и применение обусловлено комплексом БАС, в котором особое положение занимают ПС. Водорастворимые ПС семян льна представлены двумя группами полимеров. Первая, основная, составляющая до 80%, является смесью арабиноксилана (56%; Ara : Xyl 0,24-0,32: MW 3,2-1055,7-106 Да) и галактоглюкана (44%; MW 6,5-104 Да). Минорная компонента ПС-комплекса - это гетерогенная группа галактуронанов с MW 1-3-105 Да [4-6].

Цель настоящей работы - исследование процесса экстракции ПС семян льна и определение оптимальных параметров.

* Автор, с которым следует вести переписку.

Экспериментальные условия

Семена льна (Linum usitatissimum L.) приобретены через аптечную сеть. Спектры поглощения регистрировали на приборе Cecil CE 2011 (Англия) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Вязкость растворов определяли с применением вискозиметра типа ВПЖ-2 (ГОСТ 10028-62).

Комплексы ВРПС выделяли из цельных семян при 20 и 100 °С (гидромодуль 1:50) водой очищенной и растворами NaCl. Экстракцию повторяли еще два раза. Объединенное извлечение концентрировали до 1/10 объема и осаждали ПС 90% спиртом этиловым (1:4). Осадок отделяли центрифугированием и высушивали сменой растворителей.

Остаточное содержание ВРПС определяли экстракцией сырья 1% раствором NaCl при 100 °С в течение 2 ч.

Общий выход ВРПС и зольность определяли гравиметрическим методом [12], общий белок - хлорамин-ным по Починку [13], содержание углеводов - спектрофотометрическим [14]. Гель-хроматографию на сефа-дексе G-200 проводили, как описано ранее [15]. Амилолиз проводили согласно [16]. В эксперименте по определению времени и кратности экстракции содержание ПС оценивали только спектрофотометрическим методом. Микроскопическое исследование проводили согласно ранее описанной методике [17].

Метрологический анализ результатов проводили согласно рекомендациям [18, 19].

Результаты и их обсуждение

Растворы ПС семян льна, которые относят к слизеподобным ПС («слизям»), представляют собой вязкие растворы, вследствие чего возникают определенные трудности при проведении ряда технологических операций (экстракция, фильтрование). Для снижения вязкости получаемых экстрактов нами предложено использовать в качестве растворителей растворы неорганических солей. По совокупности ряда свойств (экстрагируемость, вязкость растворов, безопасность, цена, доступность соли) наиболее приемлемым является натрия хлорид. В ходе исследования динамики экстракции ПС установлено, что оптимальной является концентрация соли 1%; дальнейшее увеличение содержания натрия хлорида в экстрагенте не является целесообразным. Вязкость экстрактов снижается почти в 3 раза, что позволяет проводить ранее указанные технологические процедуры в обычных условиях (без применения центрифугирования и фильтрования в вакууме). Нами исследованы основные физикохимические показатели качества ВРПС, выделенных с применением водной и солевой экстракции (табл. 1).

Известно, что растительные ПС-комплексы представляют собой сложные системы, состоящие из углеводной, белковой, минеральной и фенольной компонент. При анализе образцов ВРПС установлено, что при использовании солевой экстракции общий выход суммарного ПС-комплекса увеличивается, при одновременном снижении содержания углеводной компоненты и увеличении содержании белка и зольных элементов; общий выход угле-вод-содержащих компонентов увеличивается. Г ель-хроматография показала идентичность хроматографических профилей исследуемых образцов и отсутствие низкомолекулярных продуктов (рис.).

Остаточное содержание ВРПС в сырье после экстракции водой составляет 34-40%, в сравнении с солевой экстракцией - менее 1%.

Общеизвестным фактом является то, что при уменьшении степени измельчения сырья выход БАС во время экстракции увеличивается. Анатомическое исследование строения семян льна показало, что слизевые клетки локализуются преимущественно в эпидермисе семенной кожуры, в то время как в эндосперме установлено наличие алейроновых зерен диаметром 0,4-8,0 мкм, включающими кристаллоиды, глобоиды, которые, вероятно, состоят из крахмала и подобных ему глюканов.

Таблица 1. Физико-химические показатели качества ВРПС из семян льна

Показатели Экстракция

Водная Солевая 100 °С

20 °С 100 °С

Выход ПС-комплекса, % от массы а.с.с. (Гр) Зольность, % от массы ПС-комплекса Белок, % от массы ПС-комплекса Углеводы в пересчете на Xyl, % от массы ПС-комплекса (СФМ) Общий выход ПС в пересчете на Xyl, % от массы а.с.с. (СФМ) Вязкость (г|уд) 0,1% раствора, отн.ед. 4,40 11,02±0,15 5,67±0,11 45,19±1,81 1,99 0,632 (вода) 4,77 14,83±0,25 6,02±0,18 53,38±1,56 2,55 0,920 (вода) 7,23 18,15±0,35 8,37±0,29 42,31±1,49 3,06 0,264 (1% NaCl)

1

О

0.9 0-е 1

0.8 Н--0 2

? 0.7 3 | ;

в

О

е °'6 <П ЗЬ

о

5 0.5 о

§ ь

§ 0-4 йЗ 1'к

1 1 1

| 0.3 ■| ( л\

о л/ \ ч

0.2 ?ч 1 4

■ * 1 Г- 1

0.1 ■л I

:/ 1 1

0 —1—|—1—1—|—1—1—■ ■ ■ ■ 1 о а 1—1—>- 1 1

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56

Объем элюата, мл

Хроматографические профили ВРПС, выделенных с применением воды при температурах 20 °С (1) и 100 °С (2) и 1% раствора №С1 при 100 °С (3)

При проверке водных извлечений эндосперма на наличие крахмала с применением реакции Сакса (йодная реакция) установлено, что она отрицательная, хотя ранее указывалось на присутствие в семенах льна крахмала [20]. Количественный анализ после применения амилазы как специфичного фермента, вызывающего гидролиз а-глюкановых ПС, показал, что их содержание находится в пределах 0,12-0,36% и, вероятно, говорит о присутствии низкомолекулярных декстринов, неокрашивающихся йодом. Для выяснения необходимости проведения измельчения семян льна при проведении экстракции исследовали влияние степени измельчения на выход ПС (табл. 2).

Установлено, что при уменьшении степени измельчения содержание ПС снижается. Наибольшее содержание ПС наблюдается при измельчении сырья до размеров частиц 1,00-2,00 мм (гравиметрический анализ дает аналогичные результаты), причем показатели для цельного сырья и этой фракции, которая на 90% состоит из остатков эпидермиса, отличаются на 6-9%, что дает основание полагать, что слизевые клетки преимущественно локализуются на поверхности льняного семени, что было подтверждено данными микроскопии. Отсутствие необходимости измельчения сырья исходит еще из того факта, что получаемые извлечения обладают сложными реологическими параметрами: фильтрация возможна только с применением центрифугирования, что заметно увеличивает время анализа и приводит к занижению результатов анализа на 10-16%.

В процессе разработки методики определены оптимальные параметры экстракции, представленные в таблице 3. Установлено, что максимальное извлечение ПС достигается при использовании в качестве экстрагента 1% раствора натрия хлорида. При соотношении «сырье : экстрагент» 1 : 70 в условиях кипения равновесие наступает через 60 мин. Применение двукратной экстракции позволяет извлечь до 96% полисахаридов, поэтому в увеличении кратности экстракции нет необходимости.

Таблица 2. Влияние степени измельчения семян льна на выход полисахаридов

Степень измельчения, мм Суммарное содержание ПС в пересчете на Ху1, % ((хтП — хтах)/(х ± Ах) )

Гравиметрия Спектрофотометрия

< 0,25 9,07-9,81 / 9,41±0,27 1,90-2,34 / 2,19±0,12

0,25-0,50 8,87-9,45 / 9,23±0,24 2,42-2,71 / 2,52±0,13

0,50-1,00 9,57-10,15 / 9,81±0,22 3,11-3,57 / 3,32±0,15

1,00-2,00 9,78-10,50 / 10,16±0,26 5,09-5,22 / 5,15±0,08

цельное 6,72-8,41 / 7,72±0,67 4,78-4,93 / 4,79±0,05

Таблица 3. Выбор оптимальных условий экстракции ПС из семян льна

Иараметр Суммарное содержание ПС в пересчете на Xyl, % ((xmin - xmax )/(x ± Ax) )

Гравиметрия Спектрофотометрия

Экстрагент

Вода очищенная 3,07-3,80 I 3,4i±0,26 2,03-2,37 I 2,i9±0,i4

NaCl 0,25% 6,58-7,27 I 6,78±0,33 4,68-5,i0 I 4,93±0,i7

NaCl 0,50% 7,83-9,00 I 8,44±0,40 5,30-5,57 I 5,53±0,ii

NaCl i,00% S,i7-9,52 I 8,79±0,48 5,57-5,80 I 5,75±0,i0

NaCl 2,00% 7,66-8,56 I 8,09±0,3i 4,98-5,i2 I 5,04±0,i2

Соотношение сырье: экстрагент

i ; 30 8,50-8,92 I 8,60±0,37 3,38-3,6i I 3,46±0,i0

i ; 50 9,53-ii,86 I i0,75±0,82 4,55-4,73 I 4,64±0,06

i ; 70 i0,32-ii,93 I ii,32±0,67 4,97-5,29 I 5,i4±0,ii

i ; i00 i0,36-ii,62 I ii,45±0,52 4,7i-5,03 I 4,89±0,i2

i ; i50 9,77-ii,38 I i0,44±0,63 3,95-4,30 I 4,09±0,i4

i ; 200 i0,50-ii,37 I ii,02±0,35 4,06-4,45 I 4,29±0,i6

Температура экстракции, °С

20 2,i5-2,92 I 2,66±0,34 i,0i-i,i6 I i,i0±0,06

40 2,57-3,09 I 2,87±0,20 i,49-i,68 I i,57±0,08

60 4,50-5,02 I 4,79±0,i4 2,53-2,65 I 2,58±0,05

80 4,80-6,43 I 5,57±0,57 3,56-3,67 I 3,60±0,05

i00 5,56-6,82 I 6,24±0,45 3,86-4,i7 I 4,02±0,ii

Время экстракции, мин Кратность экстракции

i (±0,i9-0,47) 2 (±0,05-0,i2) 3 (±0,03-0,04) 4 (±0,0i-0,02)

15 2,i 3 0,38 0,08 0,07

30 3,49 0,77 0,ii 0,08

45 5,05 i,3i 0,i6 0,09

60 5,88 i,44 0,i6 0,ii

75 5,83 i ,45 0,i7 0,ii

90 5,9i i ,46 0,i7 0,ii

105 5,89 i,44 0,i6 0,ii

120 5,90 i,44 0,i6 0,ii

Выводы

ПС семян льна представляют собой высокомолекулярные соединения, водные растворы которых обладают высокой вязкостью. Данный факт затрудняет проведение ряда технологических процедур, что в конечном итоге приводит к неполному извлечению ПС - в сырье после водной экстракции остается до 40% ВРПС.

В процессе изучения условий экстракции ВРПС семян льна предложено использование солевого экстрагента - 1% раствора NaCl. Исследование основных физико-химических показателей полученных образцов ВРПС показало, что общее содержание углеводных компонентов в данном случае увеличивается на 17-35%.

Предварительное измельчение сырья приводит к ухудшению реологических параметров извлечений и к снижению содержания ПС.

Список литературы

1. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия / Ред. Г.П. Яковлев, К.Ф. Блинова. СПб., 2004. 665 с.

2. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения / Ред. Г.П. Яковлев, К.Ф. Блинова. СПб., 2002. 325 с.

3. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. М., 1967. 315 с.

4. Warrand J., Michaud P., Picton L., Muller G., Courtois B., Ralainirina R., Courtois J. Flax (Linum usitatissimum) seed cake : A potential source of high molecular weight arabinoxylans // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005. V. 53. №5. P. 1449-1459.

5. Warrand J., Michaud P., Picton L., Muller G., Courtois B., Ralainirina R., Courtois J. Structural investigation of the neutral polysaccharide of Linum usitatissimum L. seed mucilage // International Journal of Biological Maromolecules. 2005. V. 35. №3-4. P. 121-125.

6. Davis A.E., Derouet C., Herve Du Penhoat C., Morvan C. Isolation and NMR study of pectins from flax (Linum usitatissimum L.) // Carbohydrate Research. 1990. V. 197. P. 205-215.

7. Oulaghan S.A., Wills R.B.H. Examination of linseed (Linum usitatissimum L.) for the presence of medium chain trie-noic fatty acids // Plant Science Letters. 1976. V. 7. №3. P. 195-197.

8. Chung M.W.Y., Lei B., Li-Chan E.C.Y. Isolation and structural characterization of the major protein fraction from NorMan flaxseed (Linum usitatissimum L.) II Food Chemistry. 2005. V. 90. №i-2. P. 27i-279.

9. Middleeditch B.S., Knights B.A. Sterols of Linum usitatissimum seed II Phytochemistry. i972. V. ii. №3. P. ii83.

10. Niedzweidz-Siegien I. Cyanogenic glycosides in Linum usitatissimum II Phytochemistry. i998. V. 49. №i. P. 59-63.

11. Ibrahim R.K., Shaw M. Phenolic constituents of the oil flax (Linum usitatissimum) II Phytochemistry. i970. V. 9. №8. P. i855-i858.

12. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып.2. М., i990. 398 с.

13. Иетербургский А.В. Ирактикум по агрономической химии. М., i968. 307 с.

14. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Применение метода Дрейвуда для количественного анализа листьев Plantago major L. II Химия природных соединений. 2006. №3. С. 22i-223.

15. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Цыренжапов А.В. и др. Биологически активные вещества листьев Cacalia hastata L. i. Углеводы листьев Cacalia hastata L. и их гипогликемическая активность II Химия природных соединений. 2004. №i. С. 4-9.

16. Соловьева Т.Ф., Прудникова Т.И., Оводов Ю.С. Общая характеристика полисахаридов Аралиевых II Растительные ресурсы. i968. Т.4. №4. С. 497-50i.

17. Оленников Д.Н., Потанина О.Г., Танхаева Л.М. Фармакогностическая характеристика листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.) II Химия растительного сырья. 2004. №3. С. 43-52.

18. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа II Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. ii8-i29.

19. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа II Журнал аналитической химии. i997. Т. 52. №i0. С. i022-i029.

20. Зубцов В.А., Осипова Л.Л., Лебедева Т.И. Льняное семя, его состав и свойства II Российский химический журнал. 2002. Т. 46. №2. С. i4-i6.

Поступило в редакцию 24 марта 2007 г.

После переработки 12 октября 2007 г.