CC BY
21
гипотермии в эксперименте. Показано, что холо-довой стресс оказывает выраженное повреждающее воздействие на рибосомальный синтез. Ключевые слова: гепатоциты, гипотермия, ядрыш-ковые организаторы
Ядрышко - это динамичная органелла клетки, и его структура отражает уровни трех основных процессов, связанных с биогенезом рибосом: синтез прерибосомальной рибонуклеиновой кислоты (преРНК), процессинг и миграцию рибонуклеопротеидных частиц в нуклеоплазму. Одним из замечательных свойств ядрышек является их высокая пластичность, которая проявляется в изменении размеров, морфологии и локализации в ядре при реакции на многие внешние стрессовые воздействия, а также при адаптации к неблагоприятным факторам. В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных морфологии ядрышка клеток печени при гипотермии. Ка-прелянц А. С. и соавт. (1985) в гепатоцитах, подвергнутых гипотермии, отмечали перемещение ядрышка на периферию ядра, к его мембране, что данные авторы объясняют увеличением ядерно-цитоплазматических отношений и усилением регуляторного влияния ядра на цитоплазму. По данным других авторов, под влиянием низкой температуры (2 часа при температуре 0-4 °С) в печени крыс происходила дегрануляция ядрышек, а через 10 часов после помещения экспериментальных животных снова в нормальные температурные условия ультраструктура ядрышек восстанавливалась [Логинов А. Г., 1987]. Молодых О. П. (2001) при электронной микроскопии ядрышек гепатоцитов при холодом стрессе отмечала явления сегрегации гранулярного и фибриллярного компонентов, что отражает низкий уровень синтеза рибосомной РНК и, как следствие, низкий уровень метаболизма клеток в целом. Исследований ядрышковых организаторов клеток печени методом серебрения при воздействии холодом в литературе нами не обнаружено.
Целью исследования являлся морфометрический анализ ядрышковых организаторов гепатоцитов крыс Вистар при одноразовой глубокой иммерсионной гипотермии и в постгипотермическом периоде.
Исследование было выполнено на 20 белых крысах линии Wistar. Гипотермию моделировали путем помещения животных, находящихся в индивидуальных клетках, в воду температурой 5 °C, при температуре окружающего воздуха 7 °C. Критерием прекращения эксперимента служило достижение животными ректальной температуры 20-25 °C, что соответствовало глубокой степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и в среднем составляло (40 ± 5) мин. В ходе эксперимента животные были разделены на 4 группы: 1 группы (n = 5) - животные выводились из эксперимента декапита-цией сразу после прекращения охлаждения; 2 группа (n = 5) - через 2 суток; 3 группа (n = 5) - через 7 суток и 4 группа (n = 5) - через 14 суток. Выявление ядрышковых организаторов осуществляли по двухступенчатому методу Daskal Y. et al., в нашей модификации. При увеличении х1000 под масляной иммерсией микроскопа высчитывали число ядрышек, суммарную площадь аргирофильных гранул (AgNORs) на 1 ядро, площадь одного ядрышково-го организатора и ядрышко-ядерное соотношение (Ядр/ яд) в относительных единицах (отн. ед.). Морфометри-ческие измерения проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, состоящего из программного обеспечения для морфометрического анализа ВидиоТест-Морфология 5.2, цифровой камеры VIDI CAM (Россия), адаптированной к световому микроскопу Nikon Eclipse E200 (Япония) и персонального компьютера. У каждого животного исследовали не менее 25-30 ядер гепатоцитов.
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета 81аЙ8Йса 10.0.
Результаты проведенного исследования показали, что при окраске гистологических срезов печени экспериментальных животных ядрышковые организаторы четко выявлялись в виде черных гранул (А§МОК.8) на желтоватом фоне нуклеоплазмы ядра.
Непосредственно после гипотермии среднее число А^ОКз составило (1,2 ± 0,1) на 1 ядро. Средняя площадь А^ОКз составила (2,7 ± 0,2) мкм2 на 1 ядро. Средняя площадь 1 А§МОК.8 составила (2,1 ± 0,1) мкм2. Ядр/яд соотношение составило (0,11 ± 0,01) отн. ед.
Через 2 суток после проведения гипотермии среднее число А§МОК.8 составило (2,35 ± 0,1) на 1 ядро. Средняя площадь А§МОК.8 составила (5,6 ± 0,2) мкм2 на 1 ядро. Средняя площадь 1 А§МОК.8 составила (2,2 ± 0,1) мкм2. Ядр/яд соотношение составило (0,15 ± 0,004) отн. ед.
Через 7 суток после проведения гипотермии среднее число А§МОК.8 составило (3,4 ± 0,1) на 1 ядро. Средняя площадь А§МОК.8 составила (8,7 ± 0,2) мкм2 на 1 ядро. Средняя площадь 1 А§МОК.8 составила (2,6 ± 0,1) мкм2. Ядр/яд соотношение составило (0,16 ± 0,004) отн. ед.
Через 14 суток после гипотермии среднее число А^ОКз составило (2,0 ± 0,1) на 1 ядро. Средняя площадь А^ОКз составила (4,2 ± 0,2) мкм2 на 1 ядро. Средняя площадь 1 А§МОК.8 составила (2,1 ± 0,1) мкм2. Ядр/яд соотношение составило (0,11 ± 0,004) отн. ед.
ВЫВОДЫ
Результаты проведенного исследования показали, что холодовой стресс оказывал выраженное воздействие на активность ядрышкового аппарата клеток печени экспериментальных животных. Непосредственно сразу после воздействия гипотермии в гепатоцитах отмечали низкую морфофункциональную активность нуклеолярного аппарата, что может быть связано с повреждающим действием холодового фактора. Далее, на 2-й день эксперимента (начальный период адаптации) наблюдали возрастание морфофункциональной активности нуклеол, что сопровождалось образованием новых ядрышек. На 7-й день (в период адаптации) количественные и морфометриче-ские параметры А§МОК.8 были наиболее высоки, что являлось следствием гипертрофии ядрышек и затем на 14-й день эксперимента активность ядрышковых организаторов значительно уменьшалась и приходила к норме. Таким образом, ядрышковый аппарат печеночных клеток подвергается повреждению при холодовом воздействии, но в постгипотермическом периоде возникают адаптивные компенсаторно-приспособительные процессы, которые характеризуются гипертрофией и амплификацией нуклеол, что приводит к нормализации рибосомного синтеза и регенерации гепатоцитов.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛОИДНОСТИ ЯДЕР КЛЕТОК ПЕЧЕНИ БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОТЕРМИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СРЕДЫ ОХЛАЖДЕНИЯ_
Н. Г. Крючкова, И. П. Бобров, А. В. Лепилов, А. Ю. Долгатов, З. Н. Гулдаева, О. В. Орлова, Е. Е. Алымова, М. Н. Соседова
Кафедра судебной медицины им. проф. В. Н. Крюкова и патологической анатомии с курсом ДПО ФГБОУ ВО АГМУ Барнаул Материал посвящен исследованию плоидности гепатоцитов печени белых крыс при воздействии глубокой иммерсионной и умеренной воздушной гипотермии в эксперименте. Проведен анализ индекса
накопления ДНК и клонального состава гепатоци-
тов в зависимости от среды охлаждения.
Ключевые слова: гепатоциты, гипотермия, среда
охлаждения, плоидность
Температура окружающей среды является одним из главных абиотических факторов, обеспечивающих гомеостаз человека и животных. Изменение теплового режима в сторону повышения или понижения температуры влечет за собой нарушения всех систем организма. В связи с этим очень важно исследовать морфологические основы воздействия компенсаторных механизмов гипотермии на организм человека. Показано, что выраженность ответной реакции со стороны организма зависит от уровня температуры тела, достигнутой в ходе гипотермии, а также от физико-химических свойств среды. Так, охлаждение на воздухе (воздушная гипотермия) характеризуется контактом ограниченных участков поверхности тела с окружающей средой, что приводит к более длительному периоду снижению температуры и формированию локального повреждения. В то же время при охлаждении в водной среде (иммерсионная гипотермия) наблюдается полный контакт с охлаждающим фактором, что сопровождается более интенсивным воздействием повреждающего фактора на организм, а это приводит к более интенсивной теплоотдаче, в результате которой период охлаждения занимает меньшее время.
Целью исследования являлось изучение плоидометри-ческих характеристик ядер гепатоцитов белых крыс сразу после воздействия гипотермии и в постгипотермическом периоде в зависимости от среды охлаждения.
Исследование выполнено на 50 белых крысах линии Wistar. Воздействие холодового фактора на печень животных изучали в зависимости от среды охлаждения на двух моделях гипотермии: однократной глубокой водной (иммерсионной) и однократной умеренной воздушной. Животные были разделены на 3 группы: 1 группа - группа контроля (n=10); 2 группа - животные которым проводили глубокую иммерсионную гипотермию (n=20); 3 группа -животные которым проводили умеренную воздушную гипотермию (n=20). Однократную глубокую иммерсионную гипотермию моделировали путем помещения животных, находящихся в индивидуальных клетках, в воду температурой 5 °C, при температуре окружающего воздуха 7 °C. Критерием прекращения эксперимента служило достижение животными ректальной температуры 20-25 °C, что соответствовало глубокой степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и в среднем составляло (40 ± 5) мин. Однократную умеренную воздушную гипотермию моделировали путем помещения животных, находящихся в индивидуальных клетках, в охлаждающую камеру при температуре воздуха - 25 °С. Животные находились в камере до достижения ректальной температуры 30° С, что соответствовало умеренной степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и в среднем составило (6 ± 3) часа. Животные выводились из эксперимента сразу после прекращения охлаждения, через 2 суток, 7 суток и 14 суток после прекращения охлаждения. Для определения плоидности ядер гепатоцитов препараты окрашивали методом Фельгена с использованием холодного гидролиза в 5н. HCl в течении 1 часа 30 минут. В каждом случае определяли содержание ДНК в ядрах 25-30 интерфазных печеночных клеток, а также в ядрах 25 малых лимфоцитов в той же серии срезов, которые служили стандартом. Среднее содержание ДНК в ядре малого лимфоцита принимали за диплоидное значение (2с). Измерения осуществляли в сертифицированной мор-фометрической программе ВидеоТест-Морфология 5.2. («ВидиоТест», Санкт-Петербург) с помощью специали-
зированных модулей «Стандарт» и «Плоидность». Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета 81аИ81:1са 10.0.
Результаты проведенного исследования показали, что в ядрах клеток печени крыс группы контроля ИНДНК составил (3,5с ± 0,1). Ядра характеризовались четырьмя уровнями плоидности: диплоидные (2с), на долю которых приходилось 20 % гепатоцитов, триплоидные (3с) - 30 %, тетраплоидные (4с) - 46 % и октаплоидные (8с) - 4 %.
Непосредственно после проведения однократной глубокой водной гипотермии во 2 группе исследования ИНДНК в ядрах был равен - (3,2с ± 0,2). Гепатоцитов с пло-идностью ядра 1с было - 3,4 %, 2с - 43,8 %, 3с - 16,85 %, 4с - 21,35 %, 5с - 4,5 %, 6с - 2,25 %, 7с - 6,7 % и 8с - 1,15 %. В 3 группе сразу после проведения однократной умеренной воздушной гипотермии ИНДНК возрастал в 2,5 раза (8,05с ± 0,2). Гепатоцитов с плоидностью от 1с до 4с в данной группе не отмечали, возрастало число клонов с ИНДНК от 6с до 8с и появлялись клоны с ИНДНК с 9с до 13с.
Через 2 суток после воздействия гипотермии во 2 группе ИНДНК в ядрах в среднем составил 5,7с ± 0,2. Гепатоцитов с плоидностью ядра 1с было - 0 %, 2с - 5 %, 3с - 12,5 %, 4с - 11,25 %, 5с - 23,75 %, 6с - 15 %, 7с - 13,75 %, 8с - 7,5 %, 9с - 6,25 %, 10с - 1,5 %, 11с - 1,25 %, 12с - 0 % и 13с - 1,25 %. В 3 группе исследования через 2 суток ИНДНК не отличался от 2 группы (5,5с ± 0,1). Гепатоцитов с плоидностью ядра 3с было - 4,1 %, 4с - 24,5 %, 5с - 24,5 %, 6с - 22,4 %, 7с - 15,3 %, 8с - 6,1 %, 9с - 3,1 %. Появлялись гепатоциты с плоидностью 3с и 4с и исчезали гепатоциты с ИНДНК от 10с до 13с.
Через 7 суток во 2 группе ИНДНК составил 9,3с ± 0,2. Гепатоцитов с плоидностью ядра 1с было - 0 %, 2с - 0 %, 3с - 0 %, 4с - 0 %, 5с - 1,4 %, 6с - 1,4 %, 7с - 6,8 %, 8с - 16,4 %, 9с - 32,9 %, 10с - 27,4 %, 11с - 5,5 %, 12с - 2,7 % и 13с -5,5 %. В 3 группе через 7 суток по сравнению с 2 группой ИНДНК меньше в 2,1 раза (4,4с ± 0,1). Гепатоцитов с плоидностью ядра 3с было - 16,25 %, 4с - 52,5 %, 5с - 13,75 %, 6с - 10 %, 7с - 6,25 %, 8с - 0 % и 9с - 1,25 %.
Через 14 суток во 2 группе ИНДНК составил - 5,0с ± 0,2. Гепатоцитов с плоидностью ядра 1с было - 0 %, 2с - 6,7 %, 3с - 8,3 %, 4с - 26,7 %, 5с - 23,3 %, 6с - 18,3 %, 7с - 16,7 %, 8с -0 %, 9с - 0 %, 10с - 0 %, 11с - 0 %, 12с - 0 % и 13с - 0 %. В 3 группе через ИНДНК был ниже в 1,5 раз (3,4с ± 0,1). Гепатоцитов с ИНДНК 2с было - 17,5 %, 3с - 30 %, 4с - 51,25 % и 7с - 1,25 %. Отмечали появление гепатоцитов с ИНДНК 2с и увеличение числа гепатоцитов с ИНДНК 3с. Гепато-циты с ИНДК 5с и 6с отсутствовали.
ВЫВОДЫ
Результаты проведенного исследования показали, что среда охлаждения оказывала значительное влияние на плоидометрический профиль гепатоцитов экспериментальных животных и сила этого влияния, прежде всего, была взаимосвязана с различным темпом охлаждения. При воздействии глубокой водной гипотермии (быстрый темп охлаждения) отмечали выраженное снижение синтеза ДНК в гепатоцитах непосредственно сразу после воздействия холодового фактора, что было обусловлено повреждением клеток печени, а возрастание синтеза ДНК происходило на 7 сутки в период адаптивных компенсаторно-приспособительных процессов. При воздействии умеренной воздушной гипотермии (медленный темп охлаждения) адаптивные компенсаторно-приспособительные процессы происходили непосредственно сразу после воздействия гипотермии. Полученные данные могут быть использованы в судебно-медицинской экспертной практике, когда бывает необходимо определить темп
развития гипотермического состояния с учетом состояния погибшего и условий, в которых он находился в момент переохлаждения.
■ АНАЛИЗ СМЕРТНОСТИ ОТ ВОЗДЕЙСТВИЯ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР ЗА 5-ЛЕТНИЙ ПЕРИОД В ГОРОДЕ БАРНАУЛЕ_
А. В. Лепилов, И. П. Бобров, А. Ю. Долгатов, Н. Г. Крючкова, З. Н. Гулдаева, О. В. Орлова, Е. Е. Алымова, М. Н. Соседова
Кафедра судебной медицины им. проф. В. Н. Крюкова и патологической анатомии с курсом ДПО ФГБОУ ВО АГМУ, Барнаул В работе представлены данные статистического анализа 5-летней смертности от общего переохлаждения в городе Барнауле.
Ключевые слова: смертность, низкая температура, анализ
Под общим переохлаждением организма понимается процесс последовательного чрезмерного охлаждения организма ниже допустимого предела внутренней температуры тела (35 °С), вызывающий нарушение (декомпенсацию) функциональной системы температурной регуляции организма и приводящей к его гипотермии. Процессы теплопродукции и теплоотдачи поддерживают постоянную температуру тела в организме человека. В то же время длительное нахождение в неблагоприятных условиях среды может привести к расстройству механизмов терморегуляции. Воздействие крайне низких температур окружающей среды приводит к гипотермии организма человека и в дальнейшем к его смерти от общего переохлаждения. Несмотря на то, что смерть от общего переохлаждения организма имеет небольшой процент в структуре насильственной смерти, для судебно-медицинского эксперта очень важно правильно диагностировать и зафиксировать морфологические проявления воздействия патогенетических механизмов гипотермии на организм человека. В настоящее время в судебно-медицинской практике используются определенные экспертно-диа-гностические критерии посмертной дифференциальной диагностики холодовой травмы и часто встречающихся мультифакториальных состояний.
Цель исследования - анализ структуры смертности от общего переохлаждения организма в городе Барнауле за 5-летний период, а также выявление частоты встречаемости патоморфологических признаков общего переохлаждения организма.
Материалом для исследования послужил архивный материал Барнаульского морга КГБУЗ «Алтайское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы». Метод исследования - статистико-аналитический. Анализу подвергали листы выезда дежурных экспертов и заключений экспертов. Учитывали следующие факторы: время года и место обнаружения трупов, пол, возраст, частоту встречаемости морфологических признаков характерных для данного вида смерти, а также степень алкогольного опьянения погибших.
За изученный период было проведено 123 экспертизы, в которых основной причиной смерти явилось общее переохлаждение организма, что составило 0,93 % от общего количества проведенных экспертиз (13 268 наблюдений) и 3,3 % от насильственной смерти (3765 наблюдений). Наибольшее количество случаев смерти от общего переохлаждения организма было зарегистрировано в 2012 г.-37 случаев (4,06 %). Остальные периоды распределились следующим образом: в 2013 г.- 21 (2,58 %), в 2014 г.- 24 (3,27 %), в 2015 г.- 23 (3,28 %) и в 2016 г.- 18 (2,96 %).
В зависимости от возраста показано, что чаще всего от общего переохлаждения погибали люди в возрастной группе 51-60 лет (42 мужчины, 13 женщин). Далее следуют умершие в возрасте от 41 до 50 лет (21 мужчин, 2 женщины) и в возрастном интервале 31-40 лет (12 мужчин, 2 женщины). Реже смерть происходила в возрасте 61-70 лет (10 мужчин, 2 женщины) и старше 70 лет (5 мужчин, 8 женщин). Значительно реже смерть наступает в возрасте до 30 лет (6 мужчин). Таким образом, в возрастном аспекте отмечался высокий процент смертности среди лиц трудоспособного возраста, а в соотношении мужчин и женщин имелось значительное преобладание первых -95 (77 %) и 28 (23 %) соответственно.
В соответствии со временем года анализируемый материал распределился следующим образом. Зимой 2012 г. было 28 случаев (22,8 %), весной - 3 (2,4 %), осенью - 6 (4,9 %). Зимой 2013 г.- 8 случаев (6,5 %), весной - 11 (8,9 %), осенью - 2 (1,6 %). Зимой 2014 г.- 13 случаев (10,6 %), весной - 4 (3,25 %), летом - 1 (0,81 %), осенью - 6 (4,87 %). Зимой 2015 г.- 13 случаев (10,6 %), весной - 2 (1,6 %), осенью - 8 (6,5 %). Зимой 2016 г.- 7 случаев (5,69 %), весной -6 (4,88 %), осенью - 4 (3,25 %). В зависимости от месяца наиболее высокий уровень смертности от общего переохлаждения, приходился на январь - 24,4 % (30 случаев), с последующим снижением: февраль - 20,3 % (25), март -11,4 % (14 случаев), апрель - 9,8 % (12), май - 0,8 % (1), август - 0,8 % (1). Плавный рост смертности наблюдался с началом осеннего периода: сентябрь - 4 % (5 случаев), октябрь - 5,7 % (7). На ноябрь и декабрь пришлось по 11,4 % (14 случаев).
При анализе мест обнаружения трупов погибших было отмечено, что с улиц города было доставлено 77 человек (62,5 %), из жилых помещений (дом, квартира) - 28 (22,8 %), стационаров - 13 (10,6 %), подсобных хозяйств - 5 (4,1 %).
Анализ листов выезда дежурного эксперта выявил, что осмотр трупа на месте его обнаружения проводился в 110 случаях (89,4 %), при этом фиксировались следующие обязательные признаки: положение и поза трупа в 7 случаях (5,7 %); полное промерзание - в 3 (2,4 %); наличие одежды и соответствие ее времени года - в 2 (1,6 %); признаки обморожения - в 2 (1,6 %); снятая одежда и ее местонахождение - в 1 (0,8 %); состояние ложа - в 1 (0,8 %). Розовые или багрово-синюшные с розоватым оттенком трупные пятна отмечались в 87 (71 %), багрово-синюшные - в 29 (23,5 %), в 7 случаях (5,5 %) трупные пятна вовсе не отмечены. Внутрипеченочная температура измерялась в 12 случаях (13,3 %), которая в среднем соответствовала 6,5 °С. Суправитальные реакции (проба пилокарпином, механическое раздражение мышц) зафиксировались в 16 случаях (17,8 %). Наличие телесных повреждений при осмотре трупа на месте его обнаружения было отмечено у 28 человек (31,1 %), а при исследовании в морге у 26 (28,9 %). В 6 наблюдениях (6,7 %) при исследовании трупа в морге были отмечены телесные повреждения, которые не указывались в листе выезда дежурного эксперта.
Исследование трупа в морге показало, что наличие одежды описано в 108 случаях (87,8 %), при этом она соответствовала времени года у 72 погибших (58,5 %). В остальных 15 наблюдениях (12,2 %) трупы доставляли в морг без одежды, из них: из ЛПУ - 13 (10,5 %) и 2 (1,6 %) - с места обнаружения.
При наружном исследовании трупа были зафиксированы повреждения в виде ссадин с характерной для общего переохлаждения локализацией: в области коленных суставов - в 3 (4,1 %) наблюдениях, локтевых суставов -в 2 (1,6 %), лучезапястных суставов и кистей - в 7 (5,6 %). Повреждения в виде ссадин и кровоподтеков различной
