CC BY
62
УДК 535.34
Кульсарин А.А., Муллашева Н.М.
Оренбургский государственный университет E-mail: kulsarin@mail.ru
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛЕНОЧНЫХ СТРУКТУР ДНК-ОРГАНИЧЕСКИЙ КРАСИТЕЛЬ МЕТОДОМ ИК-СПЕКТРОСКОПИИ
В настоящей работе с использованием метода колебательной спектроскопии изучены свойства оптически однородных пленочных структур ДНК-органический краситель. Исследовано кон-формационное состояние молекул ДНК в пленках при различных уровнях относительной влажности окружающей среды. Показана возможность стабилизации нативной структуры ДНК путем внесения добавок глицерина.
Ключевые слова: ДНК, органический краситель, инфракрасные спектры.
Введение
Молекулы нуклеиновых кислот и их комплексы с лигандами различной природы находят применение в качестве строительных блоков при создании функциональных нанострук-турных материалов [1, 2].
В подобных системах в качестве соединений, способных образовывать наноразмерные комплексы с молекулами ДНК, могут выступать органические катионные красители. Одним из возможных направлений применения пленочных структур на основе указанных систем может являться запись высокоэффективных рельефно-фазовых голографических решеток, динамических голограмм на триплетных состояниях красителей и ряда других [3,4].
Известно, что конформационное состояние ДНК сильно зависит от количества воды и ионов, приходящихся на одну нуклеотидную пару, что проявляется в изменении положения и интенсивности полос в колебательных спектрах исследуемых образцов [5-6].
В спектрах ДНК в интервале 900-1800 см-1 выделяют три области характеристических полос, отвечающих за поглощение дезоксирибозно-го кольца, фосфатных групп и азотистых оснований [6-9]. В некоторых работах рассматривают интервал 2000-4000 см-1, принадлежащий валентным колебаниям связанной с ДНК воды [8-11].
Существуют работы, в которых проведен теоретический анализ колебательных состояний нуклеиновых кислот, что, в сочетании с экспериментальными данными, позволяет определять состояние молекул полимера в исследуемых образцах [12-14].
Целью данной работы являлось изучение конформационного состояния молекул ДНК в оптически однородных пленках с добавками ка-тионного красителя акридинового оранжевого (АО) методом ИК-спектроскопии, а также ис-
следование возможности сохранения нативно-го состояния биополимера путем внесения в пленки стабилизирующего агента (глицерина).
Объекты и методика эксперимента
Для получения пленочных образцов использовали натриевую соль высокомолекулярной ДНК (MP Biomedicals), выделенной из молок лосося. Растворы ДНК и красителя готовили в бидистиллированной воде. Глицерин (Эко-лаб) очищали двойной вакуумной перегонкой, акридиновый оранжевый (Sigma) использовали без очистки.
Образцы пленок ДНК-орагнический краситель получали на ZnSe подложках исключением растворителя из исходного раствора при определенной влажности и температуре.
ИК-спектры исследуемых образцов регистрировали с помощью инфракрасного Фурье-спектрометра ИнфраЛЮМ-ФТ-02 (Люмэкс) в диапазоне 900-1800 см-1. Для поддержания заданной влажности окружающей среды использовали насыщенные растворы неорганических солей.
Все измерения проводили при 20-25 С.
Результаты и их обсуждение
В условиях сухой пленки дегидратированные молекулы ДНК находятся в расплетенном состоянии [5-11]. При увлажнении пленки ДНК под влиянием образующейся гидратной оболочки макромолекул формируется вторичная дву-спиральная структура, причем процесс стабилизации двойной спирали происходит поэтапно. На начальной стадии при n<6 молекул воды в расчете на нуклеотид, что соответствует о.в. до 64%, происходит одновременная гидратация как азотистых оснований, так и сахарофосфтного остова. При этом начинает формироваться упорядоченная структура ДНК, которая окончательно принимает А-форму при n = 10-11 молекул воды
Биология, экология
в расчете на нуклеотид. Дальнейшее увлажнение приводит к формированию В-формы ДНК, полностью стабилизированной при n = 20 [5].
ИК-спектры исследуемых в настоящей работе пленочных образцов ДНК-АО регистрировались с целью определения информационного состояния молекул биополимера. Задача установления влияния красителя на колебательные спектры ДНК и выявления особенностей взаимодействия красителя с ДНК по колебательным спектрам не ставилась [15].
В спектрах пленок ДНК-АО при соотношении P/D (P - общая концентрация полимера, выраженная в нуклеотидных эквивалентах на литр, D - общая концентрация красителя) равном 50 и о.в. воздуха 95% в области колебаний кратных связей азотистых оснований присутствует полоса 1712 см-1. В области колебаний сахарофосфтного остова наблюдаются узкие интенсивные полосы 1088, 1053 и 1224 см-1, отвечающие за симметричные и асимметричные колебания фосфатных групп. Наличие данных маркеров свидетельствует о том, что молекулы ДНК в пленке находятся в состоянии двойной спирали (В-формы) [6-10].
В спектрах пленок ДНК-АО при пониженных значениях о.в. полоса 1712 см-1 смещается на 1692 см-1, при этом наблюдается уменьшение интенсивности полосы 1660 см-1. В области колебаний сахарофосфатного остова наблюдается уши-рение, уменьшение интенсивности и смещение максимумов 1088, 1053 и 1224 см-1 в высокочастотную область спектра. При этом происходит деформация полосы при 1020 см-1, которая наиболее интенсивна в случае нативной ДНК [6]. Также можно отметить смещение полосы 970 см-1, являющейся маркером В-формы ДНК, до 966 см-1 [6,7]. Указанные изменения в спектре поглощения образцов свидетельствуют о денатурации ДНК в исследуемых образцах, что свя-
зано с удалением воды при дегидратации пленки в условиях низкой о.в. [6-11].
Возможность сохранения двуспиральной структуры ДНК в пленочных образцах в условиях комнатной влажности и температуры исследовалась нами посредством добавления в состав пленок некоторого количества глицерина.
Для пленок ДНК, содержащих глицерин, выявление маркеров ДНК в области 900-1150 и 1300-1600 см-1 затруднено из-за наличия полос поглощения глицерина. Однако область колебаний кратных связей азотистых оснований свободна от поглощения глицерина. Здесь наблюдается интенсивная полоса 1660 см-1, а также характеристические полосы 1712 и 1224 см-1, что можно объяснить существованием молекул ДНК в двуспиральной форме.
По нашему мнению, стабилизирующее влияние добавки может быть обусловлено как высокой способностью глицерина удерживать сор-бционную воду, так и непосредственным взаимодействием молекул глицерина с ДНК, сопоставимым с влиянием молекул воды на состояние двойной спирали.
Заключение
В настоящей работе с использованием метода ИК-спектроскопии исследовано конформаци-онное состояние молекул ДНК в оптически однородных пленочных структурах, активированных добавками органического красителя акридинового оранжевого. Показано, что в условиях пониженной о.в. молекулы биополимера в пленке находятся в расплетенном состоянии. Повышение о.в. приводит к стабилизации двойной спирали.
Внесение в пленочные структуры ДНК-АО добавок глицерина позволяет поддерживать нативное состояние ДНК при различных, в том числе и комнатных уровнях относительной влажности.
25.01.2011
Список литературы
1. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа для создания наноконструк-ций для медицины и биотехнологии // Российские нанотехнологии.- 2006. - Т. 1. - № 1. - С. 256 - 264.
2. Seeman N.S. Nanomaterials based on DNA // Annu. Rev. Biochem. - 2010. - V. 79. - P. 65-87.
3. Lantukh Yu.D., Ketsle G.A., Letuta S.N., Paschkevich S.N., Alidjanov E.K., Ipatov I.V. Holographic investigation of DNA activated by organic dyes // Proc. SPIE. - 2004. - V. 5447. - P. 375-380.
4. Lantukh Yu.D., Paschkevich S.N., Letuta S.N., Ketsle G.A., Alidjanov E.K., Kulsarin A.A. Investigation of DNA-acridine orange biopolymer films by holographic and spectroscopic techniques // Proc. SPIE. - 2007. - V. 7006. - P. 700614.
5. Малеев В.Я., Семенов М.А., Гасан А.И., Кашпур В.А. Физические свойства системы ДНК - вода // Биофизика. - 1993. -Т. 38. - № 5.- С. 768-790.
6. Сухоруков Б.И., Козлова Л.А., Маевский А.А. Оптические свойства и молекулярное строение гидратированной и дегидратированной ДНК // Биофизика. - 1974. - Т. XIX. - Вып. 4. - С. 595-600.
7. Семенов М.А., Сухоруков Б.И., Малеев В.Я. Гидратируются ли азотистые основания в ДНК при низких влажностях? // Биофизика. - 1981. - Т. XXVI. - Вып. 6. - С. 979-984.
8. Bradbury E.M., Price W.C., Wilkinson G.R. Infrared studies of molecular configurations of DNA. // J. Mol. Biol. - 1961. - V. 3. -P. 301-317.
Кульсарин А.А., Муллашева Н.М.
Исследование пленочных структур .
9. Tsuboi M. Application of infrared spectroscopy to structure studies of nucleic acids // Appl. Spec. Rev. - 1970. - V. 3. - Iss. 1. -P. 45-90.
10. Falk B.M., Hartman K.A., Lord R.C. Hydration of Deoxyribonucleic Acid. II. An Infrared Study // J. Amer. Chem. Soc. -1963. - V. 85. - P. 387-391.
11. Семенов М.А., Сухоруков Б.И., Малеев В.Я., Шабарчина Л.И. Исследование температурной аномалии воды, сорбированной на ДНК, методом ИК-спектроскопии // Биофизика. - 1979. - Т. XXIV. - Вып. 2. - С. 210-216.
12. Brown E.B., Peticolas W.L. Conformational geometry and vibrational frequencies of nucleic acid chains // Biopolymers. -1975. - V. 14. - Iss. 6. - P. 1259-71.
13. Taillandier E., Liquier J., Ghomi M. Conformational transitions of nucleic acids studied by IR and Raman spectroscopies // J. Mol. Struct. - 1989. - V. 214. - P. 185-211.
14. Ghomi M., Letellier J., Taillandier E. Interpretation of DNA vibrational spectra by normal coordinate analysis // Int. J. Biochem. - 1990. - V. 22. - N 7. - P. 691-699.
15. Neault J.F., Tajmir-Raiahi H.A. Structural analysis of DNA-chlorophyll complexes by Fourier transform infrared difference spectroscopy // Biophys. J. - 1999. - V.76. - P. 2177-82.
Работа выполнялась в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК №П1535 от 04.09.2009 г.) и при поддержке РФФИ, грант № 09-02-99020.
Сведения об авторах:
Кульсарин Артур Айдарович, заведующий лабораторией Института микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13, тел. (3532) 372580, е-mail: kulsarin@mail.ru Муллашева Наиля Миннияровна, заведующая лабораторией Института микро- и нанотехнологий
Оренбургского государственного университета 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13, тел. (3532) 372580, е-mail: mullasheva@mail.ru
UDC 535.34
Kulsarin A.A., Mullasheva N.M.
Orenburg State University E-mail: kulsarin@mail.ru
INVESTIGATION OF DNA-ORGANIC DYE FILMS BY IR-SPECTROSCOPY TECHNIQUE
In this article the properties of optically homogeneous DNA-organic dye film structures were studied using method of vibrational spectroscopy. Conformational state of DNA molecules in these films at different levels of ambient relative humidity was investigated. It was shown that stabilization of the native structure of DNA can be performed by adding glycerol.
Key words: DNA, organic dye, infrared spectra.
Bibliography:
1. Evdokimov Yu.M. Spatially ordered forms of DNA and its complexes as the basis for the creation of nanostructures in medicine and biotechnology // Rossiiskie nanotekhnologii (Russian). - 2006. - V. 1. - N 1. - P. 256 - 264.
2. Seeman N.S. Nanomaterials based on DNA // Annu. Rev. Biochem. - 2010. - V. 79. - P. 65-87.
3. Lantukh Yu.D., Ketsle G.A., Letuta S.N., Paschkevich S.N., Alidjanov E.K., Ipatov I.V. Holographic investigation of DNA activated by organic dyes // Proc. SPIE. - 2004. - V. 5447. - P. 375-380.
4. Lantukh Yu.D., Paschkevich S.N., Letuta S.N., Ketsle G.A., Alidjanov E.K., Kulsarin A.A. Investigation of DNA-acridine orange biopolymer films by holographic and spectroscopic techniques // Proc. SPIE. - 2007. - V. 7006. - P. 700614.
5. Maleev V.Ya., Semenov M.A., Gasan A.I., Kashpur V.A. Physical properties of DNA - water system // Biofizika (Russian). -1993. - V. 38. - N 5. - P. 768-790.
6. Sukhorukov B.I., Kozlova L.A., Maevsky A.A. Optical properties and molecular structure of hydrated and dehydrated DNA // Biofizika (Russian). - 1974. - V. 19. - N. 4. - P. 595-600.
7. Semenov M.A., Sukhorukov B.I., Maleev V.Ya. Do nitrogenous bases in DNA hydrate at low humidity? // Biofizika (Russian). -1981. - V. 26. - N 6. - P. 979-984.
8. Bradbury E.M., Price W.C., Wilkinson G.R. Infrared studies of molecular configurations of DNA. // J. Mol. Biol. - 1961. -V. 3. - P.301-317.
9. Tsuboi M. Application of infrared spectroscopy to structure studies of nucleic acids // Appl. Spec. Rev. - 1970. - V. 3. - Iss. 1. - P. 45-90.
10. Falk B.M., Hartman K.A., Lord R.C. Hydration of Deoxyribonucleic Acid. II. An Infrared Study // J. Amer. Chem. Soc. -1963. - V. 85. - P. 387-391.
11. Semenov M.A., Sukhorukov B.I., Maleev V.Ya., Shabarchina L.I. Investigation of the temperature anomaly of water sorbed on DNA by IR spectroscopy technique // Biofizika (Russian). - 1979. - V. 24. - N 2. - P. 210-216.
12. Brown E.B., Peticolas W.L. Conformational geometry and vibrational frequencies of nucleic acid chains // Biopolymers. -1975. - V. 14. - Iss. 6. - P. 1259-71.
13. Taillandier E., Liquier J., Ghomi M. Conformational transitions of nucleic acids studied by IR and Raman spectroscopies // J. Mol. Struct. - 1989. - V. 214. - P. 185-211.
14. Ghomi M., Letellier J., Taillandier E. Interpretation of DNA vibrational spectra by normal coordinate analysis // Int. J. Biochem. - 1990. - V. 22. - N 7. - P. 691-699.
15. Neault J.F., Tajmir-Raiahi H.A. Structural analysis of DNA-chlorophyll complexes by Fourier transform infrared difference spectroscopy // Biophys. J. - 1999. - V. 76. - P. 2177-82.
