CC BY
62
УДК 616-091.8:618.146:616-006
Т.Е. Белокриницкая', Ю.Н. Пономарева', Г.М. Ломнева2. С.В. Добросовестнова3
ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ АПОПТОЗА ПРИ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ДИСПЛАЗИИ И РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ
1Читинская государственная медицинская академия (Чита) 2Читинский областной диагностический центр (Чита) 3Читинский областной онкологический диспансер (Чита)
Приводятся данные ретроспективного иммуногистохимического исследования апоптоза в образцах тканей шейки, матки. 50 здоровых женщин, 108 пациенток с предраковыми, и. 156 со злокачественными поражениями, цервикального эпителия в зависимости, от. клинической формы., стадии заболевания, гистологического варианта и. рецепторов половых стероидов. Для. изучения, апоптоза использовали, индекс мечения р53 и. bcl-2 с помощью моноклональных антител фирмы. «Dako», Дания. При. дисплазии шейки, матки, обнаружено увеличение экспрессии. p53 по сравнению с контрольной группой. Максимально высокие значения. р53 были. при. тяжелой дисплазии и. внутриэпителиальном раке. Инвазивный рак характеризовался. стабильно высокими значениями p53, которые не превышали показателей при. внут-риэпителиальной карциноме. При. раке шейки, матки, был обнаружен bcl-2, не экспрессировавшийся при цервикальной дисплазии и. в контрольной, группе. Экспрессия. р53 и. bcl-2 в инвазивных опухолях была обратно пропорциональна экспрессии, рецепторов эстрогенов и. прогестерона. Таким, образом., исследование регуляторов апоптоза р53 и. bcl-2 перспективно для прогнозирования, течения цервикальной дисплазии и. рака шейки, матки.
Ключевые слова: апоптоз, дисплазия, рак шейки матки
DETECTION OF APOPTOSIS PARAMETERS IN LESIONS OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA AND CERVICAL CANCER
T.E. Belokrinitskaya1, Y.N. Ponomaryova1» G.M. Lomneva2, S.V. Dobrosovestnova3
1Chita State Medical Academy, Chita 2Chita Regional Diagnostic Centre, Chita 3Chita Regional Oncologic Centre, Chita
It is given a retrospective immunohistochemical investigation, in 50 cases healthy tissues, in 108 — CIN, in 156
— with cervical cancer in dependence on their clinical form, disease stage, histological variant and sex steroid. receptors. Indicator index p53 and bcl-2 with monoclonal antibodies («Dako», Danish) was used. Expression p53 was increased in comparison, with test group in cases with CIN. The highest level of p53 was CIN III and. intraepithelial cancer. Invasive cancer was characterized with constantly high, level of p53, but it wasn't higher than intraepithelial carcinoma. Bcl-2 was detected, in cervical cancer but not in CIN and. test-group. P53 and. bcl-2 expression, in invasive tumors was in back dependence with, expression, of estrogen and. progesterone receptors. So, p53 and. bcl-2 can be used, as prognostic factors for development of cervical intraepithe-lial neoplasia and cervical cancer.
Key words: apoptosis, cervical intraepithelial dysplasia, cervical cancer
Известно, что развитие многих заболеваний, в том числе и злокачественных, обусловлено неспособностью клеток подвергаться апоптозу (программированной клеточной смерти) [2, 6]. Одним из механизмов нарушения гибели трансформированных клеток являются мутации в генах, контролирующих апоптоз. В ряду этих процессов находятся изменения в гене p53, препятствующие функционированию кодируемого им белка-индуктора апоптоза, и гиперэкспрессия гена Ьй-2, тормозя-
щего апоптоз. При дефектном функционировании этих генов происходит накопление клеток с множественными генетическими изменениями, что, возможно, и является фактором опухолевой прогрессии [1, 2, 7, 8]. Очевидно, что детальное изучение функционирования генов р53 и Ьй-2, разно-направлено влияющих на развитие апоптоза, представляется перспективным для поиска новых прогностических критериев злокачественной прогрессии при различных заболеваниях.
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка параметров апоптоза клеток при цервикальной дисплазии и раке шейки матки в зависимости от клинической формы, стадии заболевания, гистологического строения и экспрессии рецепторов половых гормонов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами проведено ретроспективное иммуноги-стохимическое исследование 314 образцов тканей шейки матки, полученных при биопсии и хирургическом лечении пациенток с дисплазией и раком шейки матки, находившихся на обследовании и лечении в Читинском областном онкологическом диспансере в период с 1998 по 2004 гг.
Возраст обследованных женщин варьировал в пределах от 19 до 52 лет и составил в среднем 41,9 ± 6,9 года.
Диагностика заболеваний шейки матки включала клинические, кольпоскопические, цитогисто-логические и иммуногистохимические методы исследования. Стадирование предраковых процессов шейки проводилось в соответствии с общепринятой Международной статистической классификацией болезней (1992), гистологической классификацией опухолей женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в соответствии с классификацией по системе TNM и по системе FIGO (1997). В зависимости от тяжести заболевания пациентки распределялись следующим образом. Слабая дисплазия шейки матки была диагностирована у 31 (11,7 ± 3,1 %) пациентки, умеренная — 34 (12,9 ± 4,5 %) и тяжелая — у 43 (16,3 ± 6,0 %) женщин. Внутриэпителиальный рак был обнаружен у 46 (17,4 ± 2,0 %) больных, I стадия — у 40 (15,2 ± 2,5 %), II стадия — у 39 (14,8 ± 6,1 %) и III стадия злокачественного процесса — у 31 (11,7 ± 3,5 %) пациентки. В качестве контрольной группы использовали 50 образцов тканей шейки матки здоровых женщин.
Определение пролиферативной активности и рецепторов эстрогенов и прогестерона проводили в лаборатории патоморфологии областного диагностического центра г. Читы. При изучении клеточной гибели использовали определение экспрессии генов p53 и bcl-2. Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм. Срезы инкубировали с антителами к р53 («Dako», Дания, клон DO-7, рабочее разведение 1:100), bcl-2 («Dako», Дания, клон 124, рабочее разведе-ние 1:20). Сроки инкубации для всех антител составили 18 ч при температуре 4 °С. Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотин-пероксидазный метод («Dako», Дания), во всех случаях проводили докрашивание ядер гематоксилином. Подсчет проводили в 20 произвольно выбранных полях зрения при увеличении в 400 раз. Индекс мечения р53 рассчитывали как отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу ядер. При исследовании препаратов, окрашенных антителами к bcl-
2, рассчитывали отношение иммуногистохимичес-
ки позитивных кле-ток с окрашенной цитоплазмой к общему числу клеток [5]. Для определения экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона также применяли стрептавидин-биотин-перок-сидазный метод с помощью моноклональных антител («Dako», Дания) с предварительной высокотемпературной демаскировкой антигенов в тканях. Реакцию оценивали полуколичественным методом по D.C. Allred и соавт. [4, 5].
Данные представлены в виде M ± m, где M — среднее арифметическое, m — ошибка среднего. Для оценки статистически значимых различий полученных данных использовали критерий Стью-дента (t), для расчета коэффициентов парных корреляций (r) применялся метод Пирсона, критический уровень значимости принимался равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования нами была выявлена следующая динамика экспрессии генов p53 и bcl-2 (табл. 1).
При диспластических изменениях цервикального эпителия было обнаружено статистически достоверное увеличение уровня p53 по сравнению с контрольной группой. При этом значительное повышение экспрессии р53 было выявлено при тяжелой дисплазии в сравнении с аналогичными показателями при предраке слабой и умеренной степеней тяжести. Так же, как и в контроле, при предраковом поражении шейки матки не было выявлено клеток с экспрессией bcl-2.
Цервикальный рак характеризовался неоднозначными изменениями экспрессии р53 в зависимости от распространенности опухолевого поражения. При внутриэпителиальном раке содержание p53 соответствовало уровню экспрессии этого протонкогена при тяжелой дисплазии (р = 0,252). В инвазивных карциномах уровень р53 был ниже по сравнению с преинвазивным раком (р = 0,000), в свою очередь, средние значения индекса метки р53 при злокачественном поражении шейки матки превышали таковые в случае цервикальной дисплазии — 27,9 ±10,8% против 22,7 ± 6,6 % (р = 0,000). При опухолях шейки матки был обнаружен bcl-2, экспрессия которого отсутствовала в контрольной группе и при цервикальном предраке. Наибольшие значения bcl-2 отмечались при II и III стадиях рака шейки матки, достоверно отличаясь между собой и показателями экспрессии при I стадии карциномы, при которой содержание bcl-2 было ниже, чем при внутриэпителиальном раке. Следует отметить, что опухолям с низкой степенью дифференцировки, включая плоскоклеточные раки и аденокарциномы, соответствовали высокие значения индекса метки bcl-2. При сопоставлении экспрессии bcl-2 с уровнями р53 оказалось, что высокой экспрессии bcl-2 соответствуют относительно низкие уровни апопто-за, что, возможно, обусловлено блокирующим влиянием онкогена bcl-2 на апоптоз с одновременной стимуляцией пролиферативных процессов в клетках. Особое внимание заслуживала ядерная лока-
Таблица 1
Показатели экспрессии р53 и Ь&-2 при дисплазии и раке шейки матки, M ± m
Группы обследованных, число обследованных (п) Индекс мечения, % р, статистическая значимость различий
р53 Ье!-2 контроль умеренная дисплазия 0 степень I степень II степень
Контроль, п = 50 2,5 ± 1,2 - р = 0,000 - - - -
Дисплазия шейки матки
Слабая, п = 31 7,4 ± 5,1 - р = 0,000 р = 0,000 - - -
Умеренная, п = 34 27,6 ± 3,7 - р = 0,000 - - - -
Тяжелая, п = 43 33,0 ± 10,9 - р = 0,000 р = 0,005 р = 0,252 - -
Рак шейки матки
0 стадия, п = 46 36,4 ± 16,2 2,4 ± 0,6 р = 0,000 - - - -
I стадия, п = 40 22,5 ± 7,9 2,0 ± 0,5 р = 0,000 - р = 0,000 р* = 0,001 - -
II стадия, п = 39 25,1 ± 9,5 3,7 ± 0,5 р = 0,000 - - р = 0,066 р* = 0,000 -
III стадия, п = 31 27,4 ± 9,5 4,7 ± 2,2 р = 0,000 - - - р = 0,170 р* = 0,008
Примечание: р - статистическая значимость различий между показателями р53; р* - статистическая значимость различий между показателями Ьс1-2.
лизация Ьс1-2 в первичных опухолях — в этих случаях было отмечено метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, очевидно, что Ьс1-2 в ядре максимально активизирует процессы клеточной пролиферации. Достоверных различий экспрессии р53 и Ьс1-2 в плоскоклеточных опухолях и железистом раке шейки матки нами обнаружено не было.
Анализ сведений современной литературы позволяет выделить ряд перспективных направлений в исследовании механизмов регуляции клеточного роста. Среди них важная роль принадлежит рецепторам половых гормонов, которые взаимосвязаны с модуляцией процессов контроля количества клеток в органах-мишенях [3, 4]. При корреляционном анализе взаимосвязи экспрессии р53, Ьс1-2 и рецепторов эстрогенов и прогестерона при инвазивном раке были выявлены обратные сильные связи. Соответственно г = —0,71 (р = 0,006) между уровнем р53 и экспрессией рецепторов прогестерона и г = —0,70 — по отношению к рецепторам эстрогенов (р = 0,001); г = —
0,84 между Ьс1-2 и определением рецепторов прогестерона (р = 0,000) и г = —0,70 (р = 0,003) — для рецепторов эстрогенов. В случае преинвазивного рака между р53 и рецепторами прогестерона и эстрогенов были обнаружены соответственно прямая сильная связь и связь средней силы: г = 0,44 (р = 0,006) и г = 0,31 (р = 0,017). Полученные данные, возможно, связаны с определением нами совокупного гена р53, представляющего сочетание продуктов дикого и мутантного генов р53, которые могут принимать участие как в апоптозе (дикий тип), так и в пролиферации (мутантный тип) [5]. Возможно, что на этапе предракового поражения цервикального эпителия основным регулятором апоптоза является дикий тип р53, и, напротив, при злокачественном поражении шейки матки в регу-
ляции клеточной гибели участвует мутантный тип р53 в сочетании с Ьс1-2, который самостоятельно способен тормозить апоптоз. Можно предположить, что более низкие показатели р53 при инвазивных опухолях по сравнению с уровнем экспрессии этого гена при внутриэпителиальном раке, обусловлены экспрессией Ьс1-2. Кроме того, нами выявлено, что р53-позитвные клетки локализовались практически в тех же участках клеток, что и Ьс1-2, что свидетельствует о тесной взаимосвязи этих онкогенов в регуляции процессов клеточного роста. Таким образом, наличие мутантных онкогенов, в частности, р53 и Ьс1-2, определяет изменения клеточных функций с последующим торможением апоптоза и прогрессированием неопластической трансформации клеток.
Все вышеизложенное свидетельствует о перспективности и целесообразности использования параметров апоптоза, в частности, р53 и Ьс1-2, для прогнозирования течения цервикальной дисплазии и рака шейки матки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулаков В.И. Апоптоз в клинике гинекологических заболеваний / В.И. Кулаков, Г.Т. Сухих, Р.Г. Гатаулина // Проблемы репродукции. — 1999.
- № 2. - С. 15-26.
2. Лушников Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз) / Е.Ф. Лушников, А.Ю. Абросимов. — М.: Медицина, 2001. - 192 с.
3. Пожарисский К.М. Значение иммуногисто-химических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний / К.М. Пожарисский, Е.Е. Леенман // Архив патологии. - 2000. - Т. 62, № 5. - С. 3-11.
4. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2004. - 456 с.
5. Хариет Э.Р. Иммуноцитохимия: электронная микроскопия / Э.Р. Хариет, К.С. Гаттер // Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтон, Дж. Макги. — М.: Мир, 1999. — 558 с.
6. Швемберг И.Н. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии / И.Н. Швемберг, Л.Б. Гин-кул // Вопросы онкологии. — 2002. — Т. 48, № 2.
— С. 153—158.
7. Expression of p53, Ki-67, and bcl-2 in the vaginal margins of radical hysterectomy in patients
with stage IB carcinoma of the cervix / A.L. Silva-Filho, P. Traiman, S.A. Triginelli, F.M. Reis et al. / / Gynecol. Oncol. — 2004. — Dec., 95(3). — P. 646-654.
8. Telomerase activity, MIB-1, PCNA, HPV 16 and p53 as diagnostic markers for cervical intraepithelial neoplasia / M. Herbsleb, U.B. Knudsen, T.F. Orntoft, P. Bichel et al. // Gynecol. Oncol. - 2001. - Nov., 83(2). - P. 216220.
