CC BY
43
Исследование острой токсичности ГМЛ-1
Мирошкина И.А., Сорокина А.В., Алексеева С.В., Волкова А.В., Дурнев А.Д.
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Резюме. Актуальность. Оценка острой токсичности является необходимым этапом доклинического исследования нового оригинального анксиолитического лекарственного средства ГМЛ-1. Цель настоящей работы - изучение острой токсичности ГМЛ-1. Методы. ГМЛ-1 вводили однократно перорально и внутрибрюшинно мышам и крысам в максимально возможных объёмах для каждого из способов введения и для каждого из видов животных, в максимально возможных концентрациях. Животные контрольных групп получили эквивалентный объём 1 % раствора крахмала. Регистрировались сроки развития интоксикации животных с подробным описанием наблюдаемой клинической картины. Эвтаназию и патологоанатомическое вскрытие проводили через 14 сут. после введения препаратов. Результаты. Определение средних смертельных доз не представлялось возможным из-за отсутствия гибели животных в условиях достижения максимально возможных концентраций и максимально допустимых объёмов введения. Морфологическая картина внутренних органов, обнаруженная при патологоанатомическом вскрытии всех экспериментальных животных, не отличалась от таковой, наблюдаемой у контрольных животных. Заключение. Установлено, что препарат ГМЛ-1 при пероральном и внутрибрюшинном введении является малотоксичным и по классификации Сидорова К. К. (1973 г.) может быть отнесён к 4-му классу токсичности.
Ключевые слова: ГМЛ-1; острая токсичность; мыши; крысы
Для цитирования:
Мирошкина И.А., Сорокина А.В., Алексеева С.В., Волкова А.В., Дурнев А.Д. Исследование острой токсичности ГМЛ-1 // Фар-макокинетика и фармакодинамика. - 2018. - № 2. - С.65-70. DOI: 10.24411/2587-7836-2018-10016.
Study of acute toxicity of the drug GML-1
Sorokina A.V., ALekseeva S.V., Miroshkina I.A., VoLkova A.V., Durnev A.D.
FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Resume. Relevance. The acute toxicity evaluation is the anecessary stage of preclinical research of the new original anxiolytic drug GML-1. The present investigation aim is study of the GML-1 acute toxicity. Methods. GML-1 was administered once oraLLy and intraperitoneaLLy to mice and rats in the maximum possible volumes for each of the administration methods and for each animal species, at the highest possibLe concentrations. EquivaLent voLume of 1 % starch soLution was administered to animaLs of the controL groups. Euthanasia and pathoanatomicaL dissection were performed 14 days after the drug administration. The animal intoxication periods with a detaiLed description of the observed cLinicaL picture were registered. Results. The mean LethaL doses were not identified because GML-1 did not cause death of animaLs at injection of the maximum aLLowabLe voLumes and maximum aLLowabLe concentrations. The morphoLogicaL view of the internaL organs, detected during pathoanatomicaL dissection of aLL experimentaL animaLs, did not differ from that observed in controL animaLs. Conclusion. It was determined that the drug GML-1 at oraL and intraperitoneaL injection concerns to Low-toxic substances. According to cLassification Sidorov K.K. (1973) this drug may be reLated to 4th toxicity cLass.
Keywords: GML-1; acute toxicity; mice; rats
For citations:
Sorokina AV, ALekseeva SV, Miroshkina IA, VoLkova AV, Durnev AD. Study of acute toxicity of the drug GML-1. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2018;2:65-70. (In Russ). DOI: 10.24411/2588-0519-2018-10016.
Введение
Исследования острой токсичности химических соединений имеют давнюю, более чем вековую историю и не утратили своего значения [1]. С точки зрения получения фундаментальных знаний важность этих исследований определяется получением новых сведений о токсичности тех или иных веществ, что определяет направления новых хими-
ческих синтезов, пополняет соответствующие библиотеки подходов т зШео, расширяет представления о видовой зависимости летальных эффектов и раскрывает множество других принципиально важных параметров, характеризующих взаимодействие в системе вещество - живой организм.
С практической точки зрения оценка острой токсичности - необходимый этап доклинических исследований, определяющий принципиальную
возможность превращения фармакологического вещества в лекарство, а также предоставляющий базовые данные, позволяющие судить о начальной (стартовой) дозе для клинических исследований; диапазоне условно безопасных доз, фокусах клинического мониторинга потенциальных нежелательных явлений.
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова» разработано новое оригинальное лекарственное средство ГМЛ-1 - быстродействующий анк-сиолитик на основе производного пирроло [1, 2-а] пиразина, лиганда 18 кДа транслокаторного белка (TSPO). Оценка острой токсичности является необходимым этапом доклинического исследования безопасности ГМЛ-1.
Целью настоящей работы явилось изучение острой токсичности ГМЛ-1.
Задачи исследования - установить среднелеталь-ные дозы ГМЛ-1, оценить выраженность его токсического действия и переносимость при однократном пероральном и внутрибрюшинном введении, зарегистрировать сроки развития интоксикации и гибели животных с подробным описанием наблюдаемой клинической картины, а также определить класс токсичности ГМЛ-1.
Материалы и методы
В эксперименте использовали таблеточную массу ГМЛ-1, предназначенную для формирования таблеток ГМЛ-1 г/х пролонгированного. Каждые 100 г массы содержали ГМЛ-1 - 1 г; МСС-101 - 88 г; Kollidon - 6 г, Polyplasdon XL - 4 г; магния стеарат - 1 г. ГМЛ-1 был произведён в опытно--технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (серия 220916).
Из таблеточной массы готовили суспензию ex tempore дисперсионным методом на 1 % растворе крахмала. Исследование проводили на белых беспородных мышах (n = 48, масса 18-20 г) и белых беспородных крысах (n = 48, масса 180-220 г), обоего пола в соотношении 1:1. Животные содержались в виварии в соответствии с ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Животные были акклиматизированы в помещении вивария в течение 5 дней до начала проведения испытаний. Во время данного периода ежедневно проводили осмотр внешнего состояния животных, патологических отклонений у крыс и мышей не было обнаружено [2-4]. Группы животных формировали методом случайного отбора с использованием массы тела в качестве ведущего признака (разброс по исходной массе между и внутри групп в пределах одного пола не превышал ±10 %).
ГМЛ-1 вводили однократно в дозах: 4 г/кг (таблеточная масса) или 40 мг/кг (активное вещество) пе-рорально самкам и самцам мышей и крыс; 1 г/кг (таблеточная масса) или 10 мг/кг (активное вещество) внутрибрюшинно самкам и самцам мышей и крыс. ГМЛ-1 вводили в максимально возможных объёмах для каждого из способов введения и для каждого из видов животных (мыши - 0,5 мл перорально и 1 мл внутрибрюшинно; крысы - 5 мл перорально и 5 мл внутрибрюшинно), в максимально возможных для введения концентрациях (16 % - при пероральном введении мышам и крысам, 2 % - при внутрибрю-шинном введении мышам, 4 % - при внутрибрюш-инном введении крысам). Животные контрольных групп получили эквивалентный объём 1 % раствора крахмала однократно. Препараты вводили перо-рально с помощью металлического атравматическо-го зонда и внутрибрюшинно с помощью одноразовых шприцов [5].
Далее наблюдали за опытными и контрольными группами в течение 14 сут. Первые 8 ч после введения препарата каждая особь находилась в индивидуальной, прозрачной, пластиковой камере для непрерывного визуального наблюдения. Затем животных помещали в клетки группового содержания и осматривали ежедневно утром и вечером с целью выявления их возможной гибели, а также описания их общего состояния и особенностей поведения [6, 7]. Массу тела животных определяли перед введением ГМЛ-1 или 1 % раствора крахмала. В первую неделю наблюдения мышей и крыс взвешивали ежедневно, со второй недели наблюдения и до окончания эксперимента - еженедельно. Суточное потребление корма и воды фиксировали до введения ГМЛ-1 или 1 % раствора крахмала, а также в первые, седьмые и четырнадцатые сутки эксперимента. Животных, павших в ходе исследования, вскрывали. Эвтаназию и патоло-гоанатомическое вскрытие всех животных проводили через 14 суток после введения препаратов [2].
Статистическую обработку полученных данных по динамике массы тела и её прироста проводили следующим образом. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уил-ка, гомогенность дисперсий проверяли с помощью критерия Левена для множественных сравнений. Так как распределение изучаемых данных значимо не отличалось от нормального, а дисперсии были гомогенны, то для определения статистической значимости изменений использовали параметрические методы. Для сравнения нескольких выборок применяли однофакторный дисперсионный анализ или дисперсионный анализ для повторных измерений с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. В случае сравнения двух вы-
Примечания: оценку значимости различий между выборочными средними осуществляли при условии, что статистическая совокупность включает не менее 4 наблюдений (числовых значений). * - статистически значимые различия (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой животных, получавших 1 % раствор крахмала. ■ - статистически значимые различия (р < 0,05) по сравнению с исходными данными.
Таблица 1
Оценка суточного потребления воды и корма у мышей в течение двух недель после введения препарата ГМЛ-1
Группа Корм, гр. Вода, мл
до введения 1-й день 7-й день 14-й день до введения 1-й день 7-й день 14-й день
Контроль per os $ 3,7 (3,7 ч 4,1) 3,1-(3,1 ч 3,3) 2,6-(2,6 ч 2,8) 3,3-(3,3 ч 3,4) 8,1 (8,0 ч 8,8) 6,5-(6,4 ч 6,9) 4,9-(4,8 ч 5,2) 6,6-(6,6 ч 6,8)
ГМЛ-1 per os 4г/кг $ 3,2* (3,1 ч 3,4) 1,9-* (1,6 ч 1,9) 3,3* (2,9 ч 3,4) 3,4-(3,3 ч 3,5) 6,8* (6,6 ч 7,1) 1,7-* (1,5 ч 1,7) 10,5-* (9,3 ч 10,6) 6,8 (6,6 ч 6,9)
Контроль per os S 3,7 (3,5 Ч 3,9) 3,6 (3,5 ч 3,9) 3,4-(3,2 ч 3,5) 3,5-(3,3 ч 3,7) 6,6 (6,3 ч 7,1) 5,0-(4,8 ч 5,3) 3,4-(3,2 ч 3,5) 8,2-(7,9 ч 8,8)
ГМЛ-1 per os 4г/кгS 2,5* (2,4 Ч 2,6) 2,4* (2,1 ч 2,6) 4,5-* (3,9 'ч 4,6) 4,3-* (4,2 ч 4,5) 6,7 (6,5 ч 6,9) 1,7-* (1,8 ч 1,8) 6,9* (6,0 ч 7,2) 7,5-* (7,3 'ч 7,8)
Контроль в/бр $ 3,0 (2,9 ч 3,1) 3,3-(3,2 ч 3,5) 2,8-(2,7 ч 3,0) 3,5-(3,4 ч 3,6) 6,7 (6,4 ч 6,9) 5,0-(4,7 ч 5,2) 8,4-(7,9 ч 8,8) 8,3-(8,0 ч 8,6)
ГМЛ-1 в/бр 1 г/кг $ 2,7* (2,5 ч 2,8) 0,8-* (0,8 ч 0,9) 8) 4, ,6 (4, 4 4-* (4,3 'ч 4,4) 6,8 (6,2 ч 7,1) 3,4-* (3,3 ч 3,5) 8,4-(8,2 ч 8,5) 7,6-* (7,4 ч 7,6)
Контроль в/бр S 5,0 (4,8 ч 5,2) 4,2-(4,0 ч 4,3) 4,5-(4,3 ч 4,6) 5,0 (5,0 ч 5,1) 8,4 (8,0 ч 8,6) 5,0-(4,8 ч 5,2) 8,4 (8,0 ч 8,5) 6,7-(6,6 ч 6,7)
ГМЛ-1 в/бр 1 г/кг S 4,0* (3,9 ч 4,2) 0,0-* (0,0 ч 0,0) 5,5-* (5,3 ч 5,7) 5,3-* (5,1 ч 5,5) 6,6* (6,5 ч 7,0) 1,6-* (1,6 ч 1,7) 6,6* (6,5 ч 6,9) 9 9-* (9,5 ч 10,4)
борок использовали ^критерий Стьюдента. Полученные результаты описывали с помощью средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия считали статистически значимыми приp < 0,05.
Результаты и обсуждение
При изучении острой токсичности препарата ГМЛ-1 на беспородных белых мышах и крысах обоего пола при пероральном или внутрибрюшинном введении определение средней смертельной дозы не представлялось возможным из-за отсутствия гибели животных в условиях достижения максимально возможных концентраций и максимально допустимых объёмов введения.
В ходе эксперимента у мышей и крыс, получивших ГМЛ-1 перорально или внутрибрюшинно, отмечалось постепенное угнетение двигательной активности, нарушение ритма дыхания, которое было учащённым и поверхностным или, наоборот редким. Не было отмечено нарушений ушного и корнеального рефлексов. Когда через 8 ч животных помещали в клетки группового содержания, дви-
гательная активность восстановилась, отдельные особи (мыши) были гиперактивны, выпрыгивали из рук, вокализировали. При этом мыши и крысы были сгорбленными, с взъерошенной шерстью, бока у некоторых были втянуты. Следует подчеркнуть, что уже к началу вторых суток после введения ГМЛ-1 большинство мышей и крыс были активны и любопытны. При этом многие опытные животные оставались сгорбленными, шерсть была взъерошена. В дальнейшем внешний вид и состояние опытных мышей и крыс постепенно нормализовались, к концу первой недели и до окончания эксперимента животные были активны, охотно потребляли корм, пили воду. Поведение экспериментальных мышей и крыс в этот период наблюдения не отличалось от поведения животных контрольной группы.
В первые двое суток после введения препарата отмечалось резкое уменьшение потребления корма и воды (табл. 1, 2), а также резкое снижение массы тела и её прироста у всех опытных животных. Масса тела и её прирост у мышей и крыс, получивших ГМЛ-1 перорально или внутрибрюшинно, начинали возрастать со 2-3 дня.
Примечания: оценку значимости различий между выборочными средними осуществляли при условии, что статистическая совокупность включает не менее 4 наблюдений (числовых значений). * - статистически значимые различия (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой животных, получавших 1 % раствор крахмала. ■ - статистически значимые различия (р < 0,05) по сравнению с исходными данными.
Таблица 2
Оценка суточного потребления воды и корма у мышей в течение двух недель после введения препарата ГМЛ-1
Группа Корм, гр. Вода, мл
до введения 1-й день 7-й день 14-й день до введения 1-й день 7-й день 14-й день
Контроль peros $ 15,1 (14,6 ч 15,3) 16,2-(15,7 ч 16,5) 15,6-(15,2 ч 16,3) 13,6-(12,9 ч 13,8) 25,1 (24,3 ч 25,5) 23,4-(22,7 ч 23,8) 19,9-(19,3 ч 20,8) 27,1-(25,8 ч 27,5)
ГМЛ-1 per os 4 г/кг $ 15,4 (15,2 ч 16,3) 14,3-* (13,9 ч 14,7) 14,1* (14,1 ч 14,7) 16,2-* (15,7 ч 16,4) 23,0* (22,7 ч 24,2) 18,3-* (17,8 ч 18,8) 24,7-* (24,6 ч 25,6) 20,2-* (19,7 ч 20,4)
Контроль perosS 18,6 (17,8 ч 18,8) 17,7-(17,1 ч 17,9) 17,9 (17,8 ч 18,2) 19,7-(19,6 ч 19,8) 42,2 (40,4 ч 42,7) 28,7-(27,6 ч 29,1) 26,7-(26,7 ч 27,2) 28,4-(28,2 ч 28,5)
ГМЛ-1 per os 4 г/кгS 18,9 (18,6 ч 19,1) 17,8-(17,2 ч 17,9) 21,1-* (20,5 ч 21,8) 24,8-* (23,7 ч 26,5) 29,1* (28,5 ч 29,4) 24,9-* (24,1 ч 25,1) 31,5-* (30,6 ч 32,7) 30,5-* (29,2 ч 32,6)
Контроль в/бр $ 14,7 (14,4 ч 14,9) 15,6-(15,1 ч 15,7) 10,6 (10,3 ч 10,7) 15,1-(14,5 ч 15,4) 23,4 (22,9 ч 23,6) 25,1-(24,3 ч 25,3) 18,5-(18,0 ч 18,6) 28,5-(27,4 ч 29,0)
ГМЛ-1 в/бр 1 г/кг $ 14,6 (14,4 ч 15,0) 3,3-* (3,3 ч 3,4) 14,3* (14,3 ч 14,8) 18,1-* (18,1 ч 18,2) 23,2 (22,9 ч 23,8) 4,9-* (4,9 'ч 5,0) 23,1* (23,0 ч 23,8) 23,3* (23,2 ч 23,3)
Контроль в/бр S 17,8 (17,0 ч 18,7) 17,4-(16,6 ч 18,4) 18,4-(17,8 ч 19,1) 19,4-(18,7 ч 20,3) 24,9 (23,8 ч 26,2) 24,9 (23,8 ч 26,3) 31,8-(30,7 ч 33,0) 30,0-(29,0 ч 31,4)
ГМЛ-1 в/бр 1 г/кг S 17,7 (16,1 ч 18,1) 5,0-* (4,8 ч 5,2) 17,2* (16,6 ч 17,7) 25,7-* (24,1 ч 26,3) 18,7* (17,0 ч 19,1) 8,3-* (8,1 ч 8,7) 24,7-* (23,9 ч 25,4) 31,9-(29,9 ч 32,7)
В группе мышей, получивших ГМЛ-1 перораль-но, исходные значения массы у самок были достигнуты лишь на второй неделе, у самцов на 3-й день. К окончанию эксперимента у самцов не отмечено значимых различий в приросте массы тела между опытными и контрольными животными. У самок в течение всего эксперимента показатели прироста были значимо ниже контрольных данных (рис. 1 а, б).
В группе мышей, получивших ГМЛ-1 внутрибрю-шинно, первые семь дней показатели прироста массы тела имели отрицательное значение. К окончанию эксперимента показатели прироста массы опытных животных не имели статистических различий с показателями контрольной группы (рис. 1 в, г).
В группе крыс, получивших ГМЛ-1 перорально, у самок с пятых суток и до окончания эксперимента показатели прироста массы тела были в 2 раза ниже контрольных значений. У самцов в течение всего периода наблюдения не отмечено значимых различий в показателях с контрольной группой животных (рис. 1 д, е).
В группе крыс, получивших ГМЛ-1 внутрибрю-шинно, показатели прироста массы тела у самок
достигли положительных результатов на 7-й день, а у самцов на 4-й день. Показатели прироста массы опытных самок в течение всего эксперимента были значительно ниже контрольных данных (рис. 1 ж, з).
Важно, что к окончанию эксперимента не было выявлено закономерных различий в показателях прироста массы тела у опытных животных по сравнению с контрольными значениями. В показателях потребления корма и воды в данных группах к окончанию эксперимента также не было выявлено закономерных различий с контрольными группами (см. табл. 1, 2).
Морфологическая картина внутренних органов, обнаруженная при патологоанатомическом вскрытии всех экспериментальных животных, не отличалась от таковой, наблюдаемой у контрольных животных.
В результате исследования установлено, что ГМЛ-1 при пероральном и внутрибрюшинном введении является малотоксичным и, по классификации Сидорова К.К. (1973 г.), может быть отнесён к 4-у классу токсичности. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 препарат ГМЛ-1 относится к 3-у классу опасности для перорального способа введения.
Рис. 1. Динамика прироста массы тела (%) у экспериментальных животных при исследовании острой токсичности ГМЛ-1 а - мыши самки после перорального введения ГМЛ-1 в дозе 4 г/кг; б - мыши самцы после перорального введения ГМЛ-1 в дозе 4 г/кг; в - мыши самки после внутрибрюшинного введения ГМЛ-1 в дозе 1 г/кг; г - мыши самцы после внутрибрюшинного введения ГМЛ-1 в дозе 1 г/кг; д -крысы самки после перорального введения ГМЛ-1 в дозе 4 г/кг; е - крысы самцы после перорального введения ГМЛ-1 в дозе 4 г/кг; ж - крысы самки после внутрибрюшинного введения ГМЛ-1 в дозе 1 г/кг; з - крысы самцы после внутрибрюшинного введения ГМЛ-1 в дозе 1 г/кг.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Мирошкина Ирина Александровна Автор, ответственный за переписку e-mail: iris10.81@mail.ru ORCID ID: 0000-0002-3208-198X SPIN-код: 4697-7938
н. с. лаборатории лекарственной токсикологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Сорокина Александра Валериановна
ORCID ID: 0000-0002-9600-7244 в. н. с. лаборатории лекарственной токсикологии, к.б.н., ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. За-кусова», Москва
Алексеева Светлана Витальевна
SPIN-код: 8985-3418
с. н. с. лаборатории лекарственной токсикологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Волкова Анна Валерьевна
SPIN-код: 9587-6581
с. н. с. лаборатории психофармакологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Дурнев Андрей Дмитриевич
ORCID ID: 0000-0003-0218-8580 SPIN-код: 8426-0380
д. м. н., профессор, член-корр. РАН, зав. лабораторией лекарственной токсикологии, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Литература / References
1. Красовский Г.Н., Рахманин Ю.А., Егорова Н.А. Экстраполяция токсикологических данных с животных на человека. -М.: Медицина; 2009. [Krasovskii GN, Rakhmanin YuA, Egorova NA. Ekstrapolyatsiya toksikologicheskikh dannykh s zhivotnykh na cheloveka. Moscow: Medicine; 2009. (In Russ).]
2. Беленький М.Б. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Медгиз; 1963. [Belen'kii M.B. Elementy kolichestvennoi otsenki farmakologicheskogo effekta. Leningrad: Medgiz; 1963. (In Russ).]
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств. Изучение острой токсичности. - М.: Гриф и К; 2012. - С. 15-17. [Guidance on Preclinical Evaluation of Medicines. Part 1. Metodicheskie rekomendatsii po izucheniyu obshchetoksicheskogo deistviya lekarstvennykh sredstv. Izuchenie ostroi toksichnosti. Moscow: Grif i K; 2012. P. 15-17 (In Russ).]
Miroshkina Irina Corresponding author e-mail: iris10.81@mail.ru ORCID ID: 0000-0002-3208-198X SPIN code: 4697-7938
Research Officer at the laboratory of drug toxicology FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow
Sorokina Aleksandra
ORCID ID: 0000-0002-9600-7244 Leading researcher of the laboratory of drug toxicology, Candidate of Biological Sciences, FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow
Alekseeva Svetlana Vital'evna
SPIN code: 8985-3418
senior researcher, laboratory of drug toxicology FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow
Volkova Anna
SPIN code: 9587-6581 senior researcher at the laboratory of psychopharmacology FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow
Durnev Andrei
ORCID ID: 0000-0003-0218-8580
SPIN code: 8426-0380
Doctor of Medical Sciences, Professor,
Corresponding Member, RAS, head of the laboratory
of drug toxicology, FSBI «Zakusov institute of
Pharmacology», Moscow
4. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academies Press (US). Washington (DC). 2011. DOI: 10.17226/12910
5. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств. РД 64-126-91. - М.: МЗ России, ФК; 1992. [Pravila doklinicheskoi otsenki bezopasnosti farmakologicheskikh sredstv. RD 64126-91. Moscow: Rosminzdrav, FK; 1992. (In Russ).]
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. - М.: Медицина; 2005. С.41-47. [Guideline for Experimental (Preclinical) Studying of New Pharmacological Substances. Metodicheskie ukazaniya po izucheniyu obshchetoksicheskogo deistviya farmakologicheskikh veshchestv. Moscow: Medicine; 2005. P. 41-47 (In Russ).]
7. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. - М.: Медицина; 1974. [Gatsura VV. Metody pervichnogo farmakologicheskogo issledovaniya biologicheski aktivnykh veshchestv. Moscow: Medicine; 1974. (In Russ).]
