Исследование особенностей сорбции ионов кобальта в водных растворах сывороточного альбумина Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ

УДК 532.577.11; 537.635

ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СОРБЦИИ ИОНОВ КОБАЛЬТА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА

Ю. М. Петрусевич, Г. П. Петрова, А. М. Макуренков, А. В. Бойко

(.кафедра медицинской физики; кафедра молекулярной физики) E-mail: petrus@phys.msu.su

Методом ЯМР-релаксации изучены процессы сорбции ионов кобальта на поверхности макромолекул альбумина в его водных растворах. Определено число центров сорбции и произведена оценка энергии адсорбции. Методом динамического рассеяния света измерены диффузионные коэффициенты макромолекулярных кластеров альбумина, образующихся в присутствии ионов кобальта.

Введение

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем медицинской биофизики является изучение белков как основного составного элемента живой природы и, в частности, их водных растворов. Макромолекулы белков и биополимеров являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной оптики. Поверхность белковой молекулы содержит многочисленные заряженные группы, причем величину заряда можно изменять в широких пределах, путем изменения рН раствора. Кроме того, размеры и масса белковой макромолекулы строго определены для каждого вида белка. Сильное электростатическое взаимодействие между молекулами белка оказывает существенное влияние на характер броуновской динамики молекул. Последние играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем. С точки зрения экологии и медицины представляет интерес изучение влияния ионов металлов на растворы белков.

В человеческом организме различные металлы играют весьма важную роль. Основными из них являются натрий, калий, кальций, магний, содержащиеся в человеческом теле в количестве от десятых долей до нескольких процентов. Такие металлы, как кобальт, молибден, цинк и др., присутствуют в организме в гораздо меньших концентрациях и существуют в связанном состоянии с ферментами, их совокупное содержание составляет менее процента. В больших количествах многие из этих металлов токсичны.

Известно, что белковые макромолекулы (протеины) при определенных условиях, например, в присутствии ионов металлов, образуют надмолекулярные структуры, при этом кроме молекул протеина в растворах появляются их агрегаты — дипольные кластеры [1, 2].

В данной работе была поставлена задача изучить процессы взаимодействия ионов (в частности иона кобальта Со2+) с бычьим сывороточным альбуми-

ном (БСА) в растворе, приводящие к сорбции ионов на поверхности белка, а также к агрегации макромолекул. Для исследования использовались методы ЯМР и динамического светорассеяния.

1. Уравнение Скэтчарда и теория сорбции в растворе

По теории сорбции газов Ленгмюра [3] считается, что молекулы газа адсорбируются на поверхности монослоем. Характеристикой этого процесса является параметр сорбции Ленгмюра ■& = ^, где па и в/ — общие количества адсорбированных и свободных молекул соответственно.

Процессы установления равновесия адсорбции в растворе описываются следующим образом:

Р + А'

¡PA], ка =

[РА] 'Р][АУ

(1)

где Р — концентрация протеина, А — концентрация иона металла, ка — константа адсорбции. Следующие соотношения, написанные Скэтчардом [4], связывают параметр Ленгмюра и параметр Скэтчарда г:

ст = [РА] + [!% [РА] + кап[А][РА] = к„п[Л\<:„

г = га? =

¡РА]

(2)

Здесь ст — исходная концентрация протеина, а в — число центров сорбции. Из уравнения (2) следует линейная зависимость между параметром Скэтчарда и параметром сорбции Ленгмюра. При этом г можно записать в виде

г =

К[А]п 1 + ка[А]'

(3)

Видно, что зависимость параметра Скэтчарда г от концентрации иона [А] имеет вид изотермы

Ленгмюра. Окончательно уравнение Скэтчарда записывается следующим образом:

\А] ~пка

гк„

(4)

При наличии центров сорбции различной природы уравнение Скэтчарда выражается суммой

г =

Е

п.

1,кЧА]

1 + ЩА}'

(5)

2. Метод ЯМР-релаксации и молекулярная сорбция

Метод импульсного ЯМР используется в науке уже более тридцати лет и зарекомендовал себя как удобный, быстрый и точный способ обнаружения содержания протонов в растворах и твердых телах. Он позволяет по времени релаксации сигнала определить не только спектр, но и молекулярную подвижность, а также молекулярную сорбцию.

В настоящей работе методом ЯМР-релаксации определялись параметры сорбции парамагнитного иона Со2+ на поверхности макромолекулы альбумина. Измеряемая величина скорости спин-решеточной релаксации может быть представлена в виде следующей суммы:

Д1 = (Д1)о+р(Д1)1,

(6)

где (Дх)0 — скорость спин-решеточной релаксации водного раствора в отсутствие ионов Со, а (#1)1 характеризует дополнительную релаксацию при наличии ионов кобальта. При этом р характеризует коэффициент сорбции парамагнитного иона на поверхности макромолекулы. Таким образом, из двух измерений можно определить величину А(Дх), по которой рассчитывается коэффициент сорбции:

А(Я1) = (Я1)1-(Я1)0=р(Я1)1,

к„п

Р = сг,

ка[А}'

(7)

(8)

Величина параметра Скэтчарда записывается в виде

Р кап

1 + ка[А]'

(9)

Экспериментальная кривая зависимости скорости продольной ЯМР-релаксации представлена на рис. 1 как функция концентрации ионов Со в растворе для двух значений концентрации макромолекул альбумина. На обоих графиках (рис. 1, кривые 2, 3) видна область основной сорбции парамагнитного иона кобальта. Рост скорости релаксации при появлении свободного иона в растворе подтверждается сравнением с графиком для скорости релаксации иона Со в отсутствие белка (рис. 1, кривая /).

хЮ - моль/л

Рис. 1. Зависимости скорости релаксации Дх парамагнитного иона Со2+ от его концентрации а„п в растворе при рН 7.0 для различных концентраций альбумина ст = 0% (/), 5% (2) и 10% (3)

Последовательность графических расчетов по уравнениям (5)-(9) приводит к окончательному результату в координатах Скэтчарда, представленному на рис. 2. Из этого графика следует, что число центров сильной сорбции иона кобальта на поверхности альбумина составляет величину близкую к единице. Кроме того, обнаруживается область слабой сорбции иона Со2+ с числом центров сорбции на порядок большей величины. Эти центры имеют различные значения констант связывания и соответственно различную энергию сорбции.

Рис. 2. График сорбции ионов кобальта на альбумине в координатах Скэтчарда. Концентрация макромолекул альбумина ст =5% (/) и 10% (2)

3. Метод динамического рассеяния света

Методом динамического рассеяния света определялись размеры макромолекулярных кластеров, образующихся при сорбции ионов металла и исследовалась зависимость размера кластеров от поверхностного заряда альбумина.

Динамическое рассеяние света, также как и статическое рассеяние, связано с флуктуациями концентрации рассеивающих частиц [5]. Для растворов макромолекул в этом случае возможно написать корреляционную функцию с(£), описывающую мо-

ф

J" /

ш,

Рис. 3. Схема установки для исследования динамического светорассеяния: 1 — лазер; 2 — кювета с раствором; 3 — фильтр; 4 — фотоумножитель; 5 — усилитель; 6 — коррелятор с РС1-интерфейсом; 7 — IBM PC; 8 — блоки питания

лекулярное броуновское движение:

ф) = а(Е*(0)Е(г)). (10)

Соответствующий метод определения с(£) называется методом корреляции фотонов. Схема установки для исследования динамического рассеяния света приведена на рис. 3. Луч лазера (/) попадает через зеркало (а) на зеркало (Ь) с малым коэффициентом отражения, за счет чего образуются два луча. Часть прошедшего сквозь зеркало излучения рассеивается в кювете с раствором (2) под углом 90° и линзой (е) фокусируется на катоде ФЭУ (4). Отраженный опорный луч через зеркала (с) и {<!) также попадает на катод ФЭУ, где смешивается с рассеянным лучом и регистрируется гетеродинным методом. Автокорреляционная функция интенсивности, получаемая с помощью коррелятора, затем обрабатывается компьютером (7).

Корреляционная функция в случае раствора макромолекул, совершающих трансляционное броуновское движение с диффузионным коэффициентом Б и волновым вектором д = 2я-/А выглядит следующим образом:

с(*) = соехр[-*/т]. (И)

В случае частиц различных по массе имеем сумму таких экспонент:

c(t) = cqí exp[-t/n] где t¿ = 1/D¿g2. При этом

D = кТ/6жг}Я,

Ti =

ñwqRi

kTq2

(12)

(13)

где Щ — радиус г-й частицы, а г/ — вязкость раствора. Программа обработки данных позволяет рассчитать величины гидродинамических радиусов рассеивающих частиц. Из последней формулы (13) следует линейная связь между измеренным временем релаксации ц и радиусом частицы Щ. Из рис. 4 видно, что логарифм корреляционной функции можно аппроксимировать двумя прямыми, что свидетельствует о наличии двух типов частиц с различны-

ми радиусами. Вероятнее всего это макромолекулы альбумина и образованные из них кластеры.

Результаты эксперимента, полученные методом динамического светорассеяния в растворе альбумин + СоС12 + Н2О + НС1 (М = 0.015), проведенного при различных рН, представлены на рис. 5, а, где показано изменение величины относительного размера дипольных кластеров Яс/Ят,

1п с/с0

0.2

0.1

V

\v

\

\

\

\

V

zx:

о

10

10"

t, с

Рис. 4. Зависимость логарифма отношения конечной с и начальной со корреляционной функций от времени I

20-1

15-

10

5-

М, г/моль ' &

80

60

40

20

-i-

J_______

6 7

рН

5.5 6.0 6.5 7.0

рН

Рис. 5. Отношение эффективных радиусов кластеров Rc к радиусам исходных макромолекул альбумина Rm в зависимости от рН раствора альбумин +C0CI2 +H2O + HCI (fj, = 0.015) (а) и зависимость эффективной молярной массы рассеивающих частиц М от рН раствора альбумин + C0CI2 +Н20 + NaOH (р = 0.03) (б)

Кт — эффективный радиус молекулы белка при изменении поверхностного заряда макромолекулы (т.е. рН раствора). Характерный минимум размеров кластеров находится вблизи изоэлектрической точки альбумина (рН и 5).

При изменении концентрации ионов водорода в растворе, содержащем ионы кобальта, наблюдалась обратимость процесса кластеризации, когда относительный размер кластеров вначале уменьшался в интервале рН 4-5, а затем увеличивался при рН от 5 до 6. Подобная зависимость наблюдалась и при другой концентрации иона кобальта. Полученные данные хорошо согласуются с результатами исследования влияния ионов кобальта на параметр статического рассеяния света в растворах альбумина. На рис. 5,6 приведена зависимость эффективной массы рассеивающих частиц (кластеров) от рН раствора, полученная методом статистического светорассеяния.

Заключение

1. Методом ЯМР-релаксации получены параметры сорбции ионов кобальта на поверхности макромолекулы альбумина. Обнаружено, что имеются центры сильной и слабой сорбции, и рассчитано их число.

2. Методом динамического светорассеяния определены относительные размеры макромолекулярных дипольных кластеров. Изучены изменения этой величины как функции поверхностного заряда макромолекул (величины pH в диапазоне 4-7 ед.).

3. Сравнение результатов двух оптических методов — интегрального и динамического светорассеяния — показывает, что в случае ионов кобальта наблюдается рост эффективного радиуса и массы рассеивающих молекул в области pH > 5.

Литература

1. Petrova O.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. // Gen. Physiol, and Biophys. 1998. 17, N 2. P. 97.

2. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.H. // Вестн. Моск. ун-та. Физ. Астрон. 1998. №4. С. 71 (Moscow University Phys. Bull. 1998. N 4. P. 91).

3. Мэлвин-Хьюз Э.И. Физическая химия. M., 1964.

4. Маршалл Э. Биофизическая химия. М., 1981.

5. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов / Ред. Г. Камминс, Э. Пайк. М., 1978.

Поступила в редакцию 15.07.04