Научная статья на тему 'Исследование основных механизмов действия димефосфона на модели стимулированной агрегации тромбоцитов человека'

Исследование основных механизмов действия димефосфона на модели стимулированной агрегации тромбоцитов человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
163
21
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — В. Н. Цибулькина, Я. В. Костин, Н. В. Шмырева

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Исследование основных механизмов действия димефосфона на модели стимулированной агрегации тромбоцитов человека»

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Глазовская М. А. Принципы классификации природных систем по устойчивости к тех-ногенезу и прогнозное ландшафтно-геохимичс-ское районирование // Устойчивость геосистем. М., 1983. С. 61 — 78.

2. Демск Я. Теория систем и изучение ландшафта. М.: Прогресс, 1977. 223 с.

3. Дьяконов К. Н. Подходы к изучению устойчивости и изменчивости в геосистемах // VII совещание по вопросам ландшафтоведения: Тез. докл. Всесоюз. геогр. о-ва. Пермь, 1974. С. 14 — 16.

4. Маслясв В* Н. Структура геосистем и ее

Поступила 04.12.98.

анализ для целей водных мелиораций: Дис. ... канд. геогр. наук. М., 1994. 234 с.

5. Ракита С. А. Устойчивость геосистем: Подходы к практически реализуемой оценке // География и природные ресурсы. 1980. № 1.

С. 6 — 15.

6. Солнцев Н. А. Проблема устойчивости

ландшафтов // Вести. Моск. ун-та. Сер. геогр. 1984. № 1. С. 14 — 20.

7. Сочава В. Б. Введение в учение о геосистемах. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1978. 319 с.

Медицина

ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ДИМЕФОСФОНА НА МОДЕЛИ СТИМУЛИРОВАННОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

В. Н. ЦИБУЛЬКИНА, доктор медицинских наук, Я. В. КОСТИН, доктор медицинских наук, Н. В. ШМЫРЕВА, аспирант

Димефосфон представляет собой ди-метиловый эфир 1,1-диметил-З-оксобу-тилфосфоновой кислоты, синтезированный А. О. Визелем под руководством Б. А. Арбузова [1 ]. Препарат обладает широким спектром терапевтического действия. Он проявляет антидотный эффект при отравлении ингибиторами холинэстеразы |3|, эффективно применяется при патологии нервной системы для нормализации мозгового кровообращения и повышения устойчивости ткани к гипоксии [4], оказывает кар-диопротекторное действие 17 ], нормализует функции вегетативной нервной системы [6], проявляет стресспротек-тивные свойства [9], применяется при лечении бронхиальной астмы и гипер-

реактивности бронхов [10], имеет выраженный противовоспалительный эффект с подавлением хемотаксиса ней-трофилов [5 ], оказывает противосудо-рожное действие [8 ]. Вышеперечисленное — далеко не полный перечень эффектов в области клинического применения препарата. Тем не менее существующие представления о механизмах действия димсфосфона чаще всего могут объяснить какой-то один эффект или группу эффектов, но не обладают универсальностью [2]. Поэтому актуальным является поиск механизма, объясняющего если не все, то многие наблюдаемые эффекты препарата.

Оптимальной для поиска универсального механизма терапевтического

© В. Н. Цибулькина, Я. В. Костин, Н. В. Шмырева, 2000

эффекта димефосфона является, на наш взгляд, модель стимулированной агрегации тромбоцитов человека. В связи с вышесказанным мы поставили перед собой цель на модели антиагре-гационного действия димефосфона на тромбоциты раскрыть механизмы реализации влияния препарата на универсальные процессы клеточной активации. Исследования проведены на 154 образцах тромбоцитарной плазмы и 88 образцах суспензии отмытых от плазменных факторов тромбоцитов, выделенных из цитратной крови 33 здоровых доноров. Для мониторирова-ния, записи и последующего анализа полученных агрегатограмм использовался лазерный анализатор, подключенный через интерфейс к компьютеру. Запись кривых агрегации осуществлялась турбидиметрическим методом [11]. Прямое определение содержания свободного цитоплазматичсского кальция осуществлялось с помощью флуоресцентного индикатора, созданного на основе кальциевого хелатора БАФТА

[13].

Ключевую роль в запуске многих тромбоцитарных реакций играют внутриклеточные ионы кальция, для которых известно быстрое увеличение концентрации при стимуляции тромбоцитов различными агонистами. Возможно, эти ионы являются наиболее важным внутриклеточным медиатором функций клетки |12|. Совместное использование кальциевого ионофора А23187 с димефосфоном позволяет оценить действие препарата на содержание в клетке ионизированного кальция. Переносчики дивдлентных катионов индуцируют большинство тромбоцитарных ответов при наличии в среде ионов кальция в концентрациях, сопоставимых с физиологическими \12\. Поэтому в исследованиях концентрация свободных ионов кальция в растворе доводилась до 2 ммоль/л, что соответствует их естественному уровню в плазме крови. Применение ионофора А23187 в концентрации 1 мкмоль/л обеспечивало развитие выраженной тромбоцитарной агрегации (амплитуда и скорость агрегации в данном слу-

чае приняты за 100 %). Предварительное внесение в реакционную суспензию димефосфона в концентрации 1 ммоль/л за 3 мин до добавления кальциевого ионофора приводило к частичному угнетению агрегации. Показатели ее амплитуды и скорости достоверно снижались и составили 73,0 и 73,6 % соответственно.

ж

Обнаруженный эффект свидетельствует в пользу того, что антиагрегаци-онная активность димефосфона может быть связана с блокированием увеличения концентрации ионизированного кальция в цитоплазме за счет подавления его притока снаружи. Однако такая постановка эксперимента не позволяла судить о способности димефосфона воздействовать на поступление кальциевых ионов в цитоплазму клеток из их эндогенного пула. В связи с,этим была проведена дополнительная серия экспериментов с использованием ионофора в бескальциевой среде. Оказалось, что ионофор А23187 вызывает полноценный тромбоцитарный ответ даже в концентрации 0,2 мкмоль/л (амплитуда и скорость агрегации в данном случае приняты за 100 %). Предварительная 3-минутная инкубация отмытых тромбоцитов с димефосфоном в концентрации 1 ммоль/л обеспечивала существенное ослабление последующего агрегационного ответа на индуктор: амплитуда и скорость агрегации достоверно снизились и составили 60,8 и 68,8 % соответственно. Полученные нами результаты доказывают, что эффект димефосфона опосредуется также и за счет его выраженного воздействия на выход эндогенного кальция.

Столь серьезные предположения сделали необходимым проведение исследований с привлечением добавочных моделей опосредованной и прямой оценки вероятности функционирования ионов кальция в качестве основной мишени для реализации действия димефосфона. С этой целью в следующей серии экспериментов нами было проведено сравнительное исследование эффектов димефосфона и БАФТА-АМ — соединения, известного своей способностью легко проникать чере°з плазмати-

ческую мембрану клетки и с высокой селективностью связывать свободные ионы кальция за короткие интервалы времени [13]. Для моделирования процесса агрегации применялись следующие тромбоцитарные индукторы: аде-нозиндифосфат (АДФ), адреналин, ионофор А23187. В сравнительных экспериментах показано, что характер ин-гибирования тромбоцитарной активности кальциевым хелатором БАФТА-АМ и димефосфоном полностью идентичен: оба соединения проявляют отчетливое ингибирующее действие в случае стимуляции тромбоцитов АДФ, адреналином и А23187, которые инициируют агрегацию опосредованно через повышение уровня ионизированного кальция. Обнаруженное нами сходство антиагре-гационного профиля БАФТА-АМ и ди-мсфосфона свидетельствует о том, что механизм их действия аналогичен. Однако обнаруженная аддитивность инги-биторных эффектов говорит об отсутствии конкуренции тестируемых соединений в лх воздействии на уровень внутриклеточного кальция. Если БАФ-ТА-АМ связывает непосредственно сами ионы кальция, поступившие в ци-тозоль, то действие димефосфона реализуется скорее всего за счет изменения скорости потоков ионизированного кальция внутрь клетки (табл.).

Теоретическая и практическая важность формируемого заключения требовала окончательного подтверждения, т. е. проведения прямых исследований по определению базального и стимулированного уровней кальция в тромбоцитах. Если величину кальциевого ответа при использовании одного только

Таблица

Сравнение антиагрегационных эффектов БАФТА-АМ и димефосфоиа при индуцировании агрегации тромбоцитов

адреналином (1 мкмоль/л)

БАФТА-АМ, мкмоль/л Димефос- фон, мкмоль/л Степень ингибирова-пия агрегации, %

по амплитуде по скорости

— 500 54,9 (Р < 0,01) 42,0 (Р < 0,01)

25 58,3 (Р < 0,05) 59,6 (Р < 0,05)

25 500 78,6 (Р < 0,01) 83,5 (Р < 0,01)

АДФ принять за 100 %, то одновременное воздействие АДФ и димефосфона обеспечивало прирост кальция лишь на 43,6 % от возможного уровня. С л ед оватс л ьно, исп ыту с м ы й п репа рат обеспечивает достоверное ослабление АДФ-индуцированного кальциевого ответа в 2,3 раза. При исследовании влияния димефосфона на базальный уровень внутриклеточного кальция в тромбоцитах выявлено, что под действием димефосфона отмечаются незначительные и недостоверные колебания количества внутриклеточного кальция как в ту, так и в другую сторону от базального уровня.

Таким образом, установленное нами в косвенных и прямых экспериментах снижение уровня внутриклеточного кальция в тромбоцитах под воздействием димефосфона может быть следствием как непосредственного влияния препарата на пропускную способность клеточных мембран, так и его эффекта на систему фосфоинозитидов.

Б И 1>Л И ОГРАФ И ЧЕСК И Й СМ И С О К

1. Арбузов Б. А., Визель А. О., Ивановская К. М. и др. Синтез и новые биологические эффекты фосфорорганичсских соединений с низкой токсичностью // Докл. АН СССР. 1968. Т. 182, № 1. С. 101 — 104.

2. Гараев Р. С. Особенности взаимодействия димефосфона с цитохромом Р-450 // Фармация и фармакология: Тез. докл. Междупар. копф. Пермь, 1993. С. 81.

3. Гараев Р. С., Студенцова И. А. Влияние диметилового эфира 3-кстобутилфосфи-новой кислоты на холипергические процессы //

Действие пейротронпых средств на нервную и гормональную регуляцию. JI., 1968. С. 49 — 50.

4. Гараев Р. С., Студен цова И. А. Новые лекарственные средства па основе неантихолин-эсте разных фосфорорганичсских соединений // Каз. мед. жури. 1995. № 4. С. 324 — 327.

5. Зиганшина Л. Е. Экспериментальное изучение п рот и нонос палите л ыюй активности димефосфона: Автореф. дис. ... канд. мед. паук. Казань, 1988. 23 с.

6. Исмагилов М. Ф. Церебральные всгста-

тивиые нарушения пубертатного периода: Лпто-реф. дис. ... д-ра мед. наук. Казань, 1986. 44 с.

7. Латфуллин И. А. Изменения гипоталамо-гипофизарно-мадпочечпиковой системы при инфаркте миокарда и их коррекция препаратом димефосфон: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1985. 51 с.

8. Студенцова И. Ам Гараев P.C. Влияние димстилового эфира 1,1-диметил-З-кетобутил-фосфиновой кислоты на токсическое действие некоторых стимуляторов нервной системы // Тезисы докладов конференции „Фармакология и токсикология ФОС и других биологически активных веществ" Казань, 1969. С. 69 — 70.

9. Хафизьяпова Р. X. Церебропротекторныс свойства малотоксичных неантихолинэстсразных ФОС // Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Казань, 1991.42 с.

Поступила 10.04.2000.

10. Цибулькииа В. Н. Влияние димефосфона на гиперреактивность бронхов // Международная конференция „Улучшение качества жизни при астме и аллергии": Сб. резюме. СПб., 1995. С. 89.

11. O'Brien J. R. Platelet aggregation. Some results of a new study // J. Clin. Pathol. 1962. Vol. 15. P.452 — 455.

12. Rink T. J. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets: Ca2* thresholds and Ca-independent activation for shape-change and secretion // FEBS Lctl. 1982. Vol. 148, № 1. P. 21 — 26.

13. Tsicn R. Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: 1 design and properties of prototype structures // Biochemistry. 1980. Vol. 19. P 2396 — 2404.

###########################################

ВЛИЯНИЕ МОДУЛЯТОРОВ МО-СИНТАЗЫ

1^АМЕ И Ь-АРГИНИНА НА РАЗВИТИЕ И ТЕЧЕНИЕ

АРИТМИЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

О. И. ШЕПЕЛЕВА, ассистент, Л. К. ФЕДОТКИНА, кандидат медицинских наук, В. П. БАЛАШОВ, доктор биологических наук, А. А. СОСУНОВ, доктор медицинских наук

Оксид азота (N0) является высокоактивным межклеточным посредником, регулирующим многие внутриклеточные процессы посредством активации цитозольной гуанилатциклазы с последующим синтезом цГМФ [5]. Огромное значение N0 имеет в регуляции тонуса кровеносных сосудов и деятельности мышечных клеток сердца. Ранее нами была показана способность блокатора ЫО-синтазы Ь-ЫАМЕ предупреждать развитие острых окклюзионных аритмий у кошек [21. Однако роль N0 в возникновении нарушений сердечного ритма, а также возможности их фармакологической коррекции путем регуляции активности ЫО-синтазы требуют дальнейшего исследования. В настоящей работе представлены результаты сравнительного изучения противоаритмической активности ингибитора

NO-синтазы L-NAME и предшественника N0 L-аргинина, а также данные о структурном состоянии миокарда в использованной экспериментальной модели.

Исследования выполнены на 44 по-

9 0

ловозрелых 1фысах обоего пола массой 220 — 360 г. Окклюзию нисходящей

ветви левой коронарной артерии (10 мин) производили под общим гек-сеналовым наркозом ' (40 мг/кг) по методике, описанной рйнсе [1 ]. Реперфу-зию осуществляли снятием лигатуры.

В качестве модуляторов активности NO-синтазы в работе использовали Ы-ш-нитро-Ь-аргйнин метиловый

эфир (L-NAME) (Sigma), неспецифиче-ский ингибитор NO-синтазы, блокирующий конститутивную и индуцибель-ную изоформы фермента, и предшественник N0 в реакции его образования

> *

■ * ^ .

© О. И. Шепелева, JI. К. Федоткина, В. П. Балашов, А. А. Сосунов, 2000

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.