CC BY
15удк: 535.739:612.11:616-053.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЩЕЙ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ И ЛИЗАТА КЛЕТОК СОСУДОВ ПУПОВИНЫ НОВОРОЖДЕННЫХ МЕТОДОМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
Ситникова О. Г., Попова И. Г., Назаров С. Б., Кузьменко Г. Н., Клычева М. М.
ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В. Н. Городкова» Минздрава России, 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20, Россия
Для корреспонденции: Ситникова Ольга Григорьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической биохимии и генетики, ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В. Н. Городкова» Минздрава России, E-mail: og_sitnikova@mail.ru
For correspondence: Ol'ga G. Sitnikova, PhD, senior researcher of the laboratory of clinical biochemistry and genetics, Ivanovo Scientific-Research Institute of Maternity and Childhood named after V. N. Gorodkova, E-mail: og_sitnikova@mail.ru
Information about authors:
Sitnikova O. G., http://orcid.org/0000-0003-2604-0724 Popova I. G., http://orcid.org/0000-0003-1836-3523 Nazarov S. B., http://orcid.org/0000-0003-1545-7655 Kuzmenko G. N., http://orcid.org/0000-0001-5772-9271 Klycheva M. M., http://orcid.org/0000-0002-1725-8505
резюме
Проведено исследование общей антиоксидантной активности пуповинной крови и лизата клеток сосудов пуповины у 14 доношенных и 26 недоношенных новорожденных методом хемилюминесценции с использованием модельной системы фосфат-цитрат-люминол. Выявлено повышение общей антиокислительной активности пуповинной крови у доношенных детей.
ключевые слова: антиоксидантная активность, хемилюминесценция, новорожденные, пуповинная кровь, лизат клеток сосудов пуповины.
THE STUDY OF TOTAL ANTIOXIDANT ACTIVITY OF UMBILICAL CORD BLOOD AND LYSATE OF THE CELLS OF THE BLOOD VESSELS OF THE UMBILICAL CORD OF A NEWBORN BY THE CHEMILUMINESCENCE METHOD
Sitnikova O. G., Popova I. G., Nazarov S. B., Kuzmenko G. N. Klycheva M. M.
Ivanovo Scientific-Research Institute of Maternity and Childhood named after V. N. Gorodkova, Ivanovo, Russia
summary
A study of the total antioxidant activity of umbilical cord blood and lysate of the cells of the blood vessels of the umbilical cord of14 full-term and 26 preterm infants by the chemiluminescence method using a model system phosphate-citrate-luminol. Showed increased total antioxidant activity of the umbilical cord in full-term infants.
Key words: antioxidant activity, chemiluminescence, newborns, umbilical cord blood, cell lysate of the umbilical cord vessels.
Свободнорадикальное окисление (СРО) липидов является необходимым метаболическим процессом, обеспечивающим гомеостаз для целостного организма, который зависит от состояния антиоксидантной системы. Многокомпонентная антиоксидантая система (АОС) представлена ферментами (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза), природными антиокси-дантами (а-токоферол, аскорбиновая кислота, флавоноиды), церулоплазмином и тиоловыми соединениями, утилизирующими продукты СРО липидов - активные формы кислорода, свободные радикалы, гидроперекиси на различных стадиях. В норме состояние СРО - АОС находится в динамическом равновесии, при ослаблении действия
антиоксидантов накапливаются токсичные продукты СРО, приводящие к развитию окислительного стресса [1, 2]. Ранее у доношенных и недоношенных новорожденных установлено нарушение гемостатических свойств эндотелия [3-5], которое может иметь место в условиях развития окислительного стресса, сопровождающегося нарушением активности антиоксидантной системы. В связи с этим исследование интегрального показателя общей антиоксидантной активности является актуальным. Целью работы является исследование общей антиокислительной активности (АОА) пуповинной крови и лизата клеток сосудов пуповины новорожденных методом хе-милюминесценции.
2017, том 20, № 2, вып. 2
ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК
материал и методы
Исследование свободнорадикальных реакций проводили методом регистрации хемилюминесцен-ции (ХЛ). Метод основан на детекции сверхслабого свечения, возникающего при генерации свободных радикалов, активных форм кислорода в модельной системе фосфат-цитрат-люминол при добавлении инициатора - сульфата железа II. Готовили модельную систему, состоящую из фосфатного буфера (20 мМ КН2 РО4) с добавлением цитрата натрия (50 мМ) и люминола (10-5 М) с величиной рН 7,5. Данная модельная система состоит из стабильных компонентов, поэтому нет необходимости готовить ее перед каждым анализом, что существенно сокращает время исследования и повышает его достоверность [6]. Подавление ХЛ модельной системы в присутствии сыворотки пуповинной крови или лизата клеток сосудов пуповины, выраженное в процентах от контроля (свечение модели), характеризует АОА. Метод выполнялся на биохемилюминометре «БХЛ 07» (Россия) следующим образом: в кювету прибора «БХЛ 07» помещали 1 мл модельной системы с 0,05 мл физиологического раствора (контроль) или сыворотку крови, или аликвотный объем лиза-та клеток вены пуповины, содержащий 500 клеток. Далее в систему вводили активатор окисления - 0,2 мл 10 мМ раствора сульфата железа II. Весь процесс измерения и обработка результатов проводилась автоматически прибором. В дальнейшем учитывали величину быстрой вспышки, то есть максимум
120
%
100
свечения (I max) за 30 секунд, как информативный показатель, позволяющий оценить способность организма к свободнорадикальному окислению. Полученные цифровые значения показателей I max выражали в процентах от контроля (I max опыт / I max контроль), что характеризовало АОА сыворотки крови или лизата клеток. Обследовано 14 доношенных и 26 недоношенных новорожденных. Материалом для исследования служила пу-повинная кровь и лизат клеток сосудов пуповины. Выделение эндотелиальных клеток из вены пуповины проводили методом Gerlach J. C. et al. (2001) [7]. К осадку клеток добавляли 1 мл физиологического раствора, подсчет клеток проводили с использованием камеры Горяева [8]. Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6,0 (Stat soft) for Windows с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney [9].
результаты
Хемилюминограмма модельной системы пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных представлена на рис. 1. Как видно из рисунка 1, отмечается повышение показателя I max (р=0,0189) у недоношенных новорожденных.
Сравнение этого показателя в лизате клеток сосудов пуповины (рис. 2) показало отсутствие достоверных различий (р=0,2901).
120
%
100
Рис. 1. Показатели величины быстрой вспышки ХЛ (в % от контроля) модельной системы в присутствии пуповинной сыворотки крови (1 - контроль, 2 - доношенные дети, 3 - недоношенные дети).
Рис. 2. Показатели величины быстрой вспышки ХЛ (в % от контроля) модельной системы в присутствии лизата клеток сосудов пуповины (1 - контроль, 2 - доношенные дети, 3 - недоношенные дети).
обсуждение
Выявленное повышение показателя I max (р=0,0189) у недоношенных новорожденных свидетельствует о недостаточности антиоксидантной системы по сравнению доношенными детьми.
Отсутствие достоверных различий (р=0,2901) показателя в лизате клеток сосудов пуповины, по-нашему мнению, можно объяснить сбалансированностью системы ПОЛ - АОА сосудах пуповины.
заключение
Таким образом, исследование общей антиокислительной активности пуповинной крови показало ее более высокую активность у доношенных детей. Данное предположение согласуется с работами авторов, исследовавших маркеры окислительного стресса и их связь с общей антиокислительной активностью [10].
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Колесникова Л.И., Гребенкина Л.А., Да-ренская М.А., Власов Б.Я. Окислительный стресс как неспецифическое патогенетическое звено репродуктивных нарушений (обзор). Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2012;32(1):58-66.
2. Poston L., Igosheva N., Mistry H.D., Seed P.T., Shennan A.H., Rana S., Karumanchi S.A., Chappell L.C. Role ofoxidative stress and antioxidant supplementation in pregnancy disorders. Am. J. Clin. Nutr. 2011;94(6Sup-pl):1980S-1985S. doi: 10.3945/ajcn.110.001156.
3. Кузьменко Г.Н., Чемоданов В.В., Назаров С.Б. Клиническое значение нарушений регуляции функции эндотелия в развитии респираторного дистресс-синдрома у недоношенных новорожденных. Педиатрия (г. Ташкент). 2008;1:22-27.
4. Попова И.Г., Назаров С.Б., Филькина Е.В., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г. Особенности эн-дотелиальной функции в период ранней постна-тальной адаптации у новорожденных от матерей с гестозом. Мать и дитя в Кузбассе. 2014;2:82-86.
5. Попова И.Г., Чаша Т.В., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г., Филькина Е.В., Назаров С.Б. Лабораторная оценка функционального состояния эндотелия у доношенных новорожденных, родившихся y матерей с гестозом. Клиническая лабораторная диагностика. 2009;6:12-14.
6. Семесько С.Г., Фархутдинов Р.Р. Суммарная антиокислительная активность слезной жидкости. Клиническая лабораторная диагностика. 2002;5:24-34.
7. Gerlach J.C., Zeilinger K., Spatkowski G., Hentschel F., Schnoy N., Kolbeck S., Schindler R.K., Neuhaus P. Large-Scale isolation endothelial cells from pig and human liver. J. Surg. Res. 2001;100(1):39-45. doi: 10.1006/jsre.2001.6224.
8. Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д., Волкова Е.В., Зуева Е.Е., Мозговая Е.В. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови. Клиническая лабораторная диагностика. 2001;1:50-52.
9. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера; 2002.
10. Гармаза Ю.М., Козлова Н.М., Артюшев-ская М.В., Петрович В.А., Сапотницкий А.В., Шишко Г.А., Слобожанина Е.И. Маркеры окислительного стресса в плазме пуповинной крови недоношенных новорожденных. Медицинский Академический журнал. 2013;13(4):71-76.
references
1. Kolesnikova L.I., Grebenkina L.A., Darenskaya M.A., Vlasov B.Ya. Oxidative stress as nonspecific pathogenetic link of reproductive disorders (systematic review). Bjulleten' Sibirskogo ot-delenija Rossijskoj akademii medicinskih nauk. 2012;32(1):58-66. (In Russ).
2. Poston L., Igosheva N., Mistry H.D., Seed P.T., Shennan A.H., Rana S., Karumanchi S.A., Chappell L.C. Role ofoxidative stress and antioxidant supplementation in pregnancy disorders. Am. J. Clin. Nutr. 2011;94(6Sup-pl):1980S-1985S. doi: 10.3945/ajcn.110.001156.
3. Kuz'menko G.N., Chemodanov V.V., Nazarov S.B. The clinical significance of disorders of regulation of endothelial function in the development of respiratory distress syndrome in preterm infants. Pediatrija (g. Tashkent). 2008;1:22-27. (In Russ).
4. Popova I.G., Nazarov S.B., Filkina E.V., Kuz-menko G.N., Sitnikova O.G. Features endothelial function in early postnatal adaptation newborns from mothers with preeclampsia. Mat' i ditja v Kuzbasse. 2014;2:82-86. (In Russ).
5. Popova I.G., Chasha T.V., Kuzmenko G.N., Sitnikova O.G., Filkina Ye.V., Nazarov S.B. Laboratory elevation of endothelial function in preterm neonatal infants born to mothers with gestosis. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2009;6:12-14. (In Russ).
6. Semesko S.G., Farhutdinov R.R. The total antioxidant activity of the lacrimal fluid. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2002;5:24-34. (In Russ).
7. Gerlach J.C., Zeilinger K., Spatkowski G., Hentschel F., Schnoy N., Kolbeck S., Schindler R.K., Neuhaus P. Large-Scale isolation endothelial cells from pig and human liver. J. Surg. Res. 2001;100(1):39-45. doi: 10.1006/jsre.2001.6224.
8. Petrishhev N.N., Berkovich O.A., Vlasov T.D., Volkova E.V., Zueva E.E., Mozgovaya E.V. Diagnos-tical value to determine if desquamated endothelial cells in blood. Klinicheskaja laboratornaja diagnos-tika. 2001;1:50-52. (In Russ).
9. Rebrova O.Ju. Statisticheskij analiz medicin-skih dannyh. Primenenie paketa prikladnyh programm STATISTICA. M.: MediaSfera; 2002. (In Russ).
10. Harmaza Y.M., Kozlova N.M., Artsiusheuskaya M.V., Petrovich V.A., Sapotnitski A.V., Shyshko G.A., Slobozhanina E.I. Oxidative stress markers in the cord blood plasma of the preterm infants. Medicinskij Aka-demicheskij zhurnal. 2013;13(4):71-76. (In Russ).
